田二淵 關(guān)巍 王鐵霖 黃洋 劉堰鳳 劉博 楊玉文 趙廷昌

摘 要： 瓜類細菌性果斑病是危害葫蘆科作物的世界性病害，其病原菌為西瓜噬酸菌 （Acidovorax citrulli）。以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac-5為研究對象，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aryR的全基因缺失突變株，并構(gòu)建了互補菌株。測定了野生型、突變株和互補菌株的致病性、致敏性、生物膜形成能力和運動能力等生物學特性。同時，使用qRT-PCR 定量檢測了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系統(tǒng)功能基因hrpE和hrcN 的表達水平。結(jié)果顯示，aryR的缺失降低了Aac-5對西瓜的致病力和運動能力，增強了生物膜形成能力，對非寄主煙草仍具有致敏性。hrpE、hrcN、fliR、fliC基因在突變株中的表達量下調(diào)，表明aryR對hrpE、hrcN、fliR、fliC基因均為正調(diào)控。綜上所述，基因aryR在Aac-5致病過程、運動能力和其他表型中起著重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 西瓜噬酸菌; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子; aryR; 致病性; 運動能力

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）02-008-09

Functional study on the global regulation factor aryR of Acidovorax citrulli Aac-5 strain

TIAN Eryuan1，2， GUAN Wei2， WANG Tielin3， HUANG Yang2， LIU Yanfeng2， LIU Bo2， YANG Yuwen2， ZHAO Tingchang2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jinlin， China; 2. State Key Laboratory of Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 3. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs/National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijng 100700， China）

Abstract： Bacterial fruit blotch（Acidovorax citrulli）is a serious worldwide disease on cucurbitaceous plants. In this study， a full-gene deletion mutant strain of the global regulatory factor aryR was constructed based on the wild-type strain Aac-5 of A. citrulli through homologous recombination， as well as the complementation strain. The virulence， hypersensitive on tobacco， swimming and twitching motility and the ability of biofilm formation of the wild-type strain， mutant and complementation strain was determined. The expression of flagellum-assembly genes fliR and fliC， and Type III secretion -related genes hrpE and hrcN were also quantitatively assessed by using qRT-PCR. The results showed that compared with the wild type， the virulence， twitching and swimming motilities was decreased in mutant strain， while its biofilm formation ability was increased. The ability of aryR mutant strain on causing hypersensitive reaction on non-host tobacco was maintained. Compared to the wild-type strain， the fliR and fliC genes were lowly expressed in the mutant strain， and the hrpE and hrcN genes were also lowly expressed， suggesting that the aryR positively regulates fliR， fliC， hrpE， and hrcN genes in Aac-5 strain of A. citrulli. In summary， the aryR plays an important role in regulating the virulence， twitching and swimming motilities and biofilm formation of A. citrulli Aac-5 strain.

Key words： Acidovorax citrulli; Translation regulatory factorr; aryR; Virulence; Motility

自然環(huán)境是復雜多變的，生存在其中的微生物為了適應環(huán)境因此進化出了一套高效的調(diào)控系統(tǒng)[1]，例如群體感應系統(tǒng)（Quorum sensing， QS）與雙組份系統(tǒng)等。LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是QS系統(tǒng)中廣泛存在的調(diào)節(jié)因子，近年來研究表明，基因組中存在許多LuxR同源蛋白在行使調(diào)控功能。目前發(fā)現(xiàn)，在苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等大約70余種革蘭氏陰性菌中存在類似的LuxR型QS模式系統(tǒng)，行使對生物被膜的形成[2]、毒力因子金屬蛋白酶活性[3]、致病性及細胞毒性、細菌游動能力、T3SS相關(guān)蛋白（ExoS、PcrV）表達、綠膿素合成量、喹諾酮QS系統(tǒng)信號分子合成[4]等多種行為的調(diào)控作用。除了參與群體感應的LuxR蛋白外，還有一部分LuxR家族蛋白可以單獨或以雙組份調(diào)控系統(tǒng)的形式參與細菌生命活動的調(diào)控[5]。伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）中的CepR與cepI和aidA基因的啟動子結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同作用行使細菌群體移動、生物膜形成等功能[6]，梨火疫病菌（Erwinia amylovora）LuxR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的EaluxR突變株對于梨葉及梨幼果的致病性明顯減弱，在NA液體培養(yǎng)基上的生長速度明顯減慢，對耐過氧化氫及胞外多糖產(chǎn)生能力明顯減弱，但是，對煙草過敏性反應、抗生素耐性、生物膜形成沒有任何影響[7]。

瓜類細菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）的病原菌為西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli），為革蘭氏反應陰性[8]，主要侵染西瓜、甜瓜等葫蘆科作物，是世界范圍內(nèi)的檢疫病害[9]。2007年劉鵬等[10]利用生物學方法證明西瓜噬酸菌存在群體感應系統(tǒng)，西瓜噬酸菌II組菌株AAC00-1的群體感應系統(tǒng)對病菌的致病力、生長能力、運動能力有不同程度的調(diào)控作用[11]。同時前期研究表明，西瓜噬酸菌的全基因組中LuxR家族共有13個LuxR同源蛋白基因[12]，參與西瓜噬酸菌的行為調(diào)節(jié)。其中aacR基因編碼的AacR蛋白是參與群體感應的LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該基因的缺失導致西瓜噬酸菌致病力、生物膜形成能力和運動能力等與群體感應相關(guān)的表型發(fā)生顯著改變[5，13]。luxR（Aave-4229）對西瓜噬酸菌致病力、運動能力及生物膜的形成具有重要調(diào)控作用[5]。

在西瓜噬酸菌AAC00-1基因組（NCBI accession number：NC_008752）中基因Aave_1577編碼一個LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AryR。根據(jù)親緣關(guān)系預測結(jié)果，該轉(zhuǎn)錄因子與水稻白葉枯病菌的OryR單獨成簇，蛋白的三級結(jié)構(gòu)和水稻白葉枯病菌的OryR蛋白非常相似，其蛋白氨基端沒有任何典型的結(jié)構(gòu)域，羧基端有保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，故命名為AryR。OryR蛋白與水稻白葉枯病菌的毒性有關(guān)[14]，可與目的基因的啟動子進行特異性結(jié)合以表達相關(guān)基因[15-16]。OryR蛋白能夠響應植物信號并且激活鄰近pip基因及相關(guān)能動基因的表達[16-18] ，它是宿主與病原菌之間交流的重要調(diào)控蛋白。水稻白葉枯菌沒有LuxI家族AHL合成酶，不產(chǎn)生AHL信號分子，在這種情況下，OryR會與另外一種未知信號分子結(jié)合，而這種信號分子是由植物本身產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，當水稻白葉枯菌感染水稻時，OryR蛋白濃度增加，表明 LuxR家族蛋白也可以檢測到真核生物產(chǎn)生的非AHL信號物質(zhì)[6]。為了探明AryR蛋白與果斑病的特性相關(guān)性，筆者根據(jù)該全基因組序列提供的信息，分析了AryR的結(jié)構(gòu)域特征，以aryR基因為研究對象，探究該基因缺失后對Aac-5致病力和其他相關(guān)表型的影響，以期初步探索aryR在Aac-5致病機制中的調(diào)控作用，進而為防治瓜類細菌性果斑病提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及引物 所用菌株和質(zhì)粒詳見表1。

1.1.2 試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒（百泰克（北京）生物技術(shù)有限公司）、核酸限制性內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）、抗生素（Sigma-Aldrich公司（美國））、高保真酶KOD plus Neo（東洋紡（日本）），試驗所用引物由華大基因（北京）合成。研究中所用到的儀器有精密恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9082）、PCR儀（T100TM Thermal Cycler）、電泳儀（DYY-8C）、紫外可見分光光度計（Nano VuePlus）等。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）Kings B培養(yǎng)基（pH=7.0，蒸餾水定容至1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）20 g;K2HPO4 1.5 g;MgSO4·7H2O 1.5 g;丙三醇 （Glycerol） 15 mL。加蒸餾水至1 L，滅菌備用。固體培養(yǎng)基加瓊脂粉（Agar），比例為1.5%;高蔗糖培養(yǎng)基為在KB固體培養(yǎng)基內(nèi)加10%的蔗糖。（2）LB培養(yǎng)基（pH=7.0，蒸餾水定容至1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）10 g;氯化鈉 （NaCl ）10 g;酵母粉 （Yeast）5 g。加蒸餾水至1 L，滅菌鍋滅菌備用，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉（Agar），比例為1.5%。（3）0.3%半固體培養(yǎng)基（pH=7.0，蒸餾水定容至1 L）：細菌專用運動性蛋白胨0.3 g、酵母提取物0.3 g、瓊脂粉3 g;加入蒸餾水至1 L，在121 ℃滅菌鍋高溫高壓滅菌備用。

1.2 方法 試驗于2019年3—12月在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所實驗室進行。

1.2.1 西瓜噬酸菌LuxR家族蛋白AryR同源性和結(jié)構(gòu)域分析 利用BLASTp工具及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分別對蛋白的注釋信息及結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.2.2 突變株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp的篩選及驗證 利用Primer 5.0軟件根據(jù)目的基因aryR左右兩端設(shè)計引物并擴增目的基因的上下游片段，設(shè)計片段引物對LaryR-F/LaryR-R和RaryR-F/ RaryR-R，以西瓜噬酸菌Aac-5基因組為模板，擴增目的片段上游和下游片段。通過連接酶將擴增片段與慶大基因（Gm）連接于酶切過后的pK18mobsacB中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18-aryRGm。采用三親交配的方法將重組質(zhì)粒導入野生型Aac-5的菌株中。因為質(zhì)粒pK18mobsacB中蔗糖致死基因的緣故，重組質(zhì)粒無法在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長。因此在含有抗生素加10%蔗糖的KB平板上，理論上可篩選得到突變株。大量挑取平板中生長的單菌落進行驗證，采用果斑病原菌的特異性引物WFB1/WFB2[19]及目的基因的特異性檢測引物aryRF/aryRR進行PCR驗證。PCR擴增引物序列、酶切位點見表1。

利用pBBR1MCS-2質(zhì)粒來構(gòu)建互補菌株，設(shè)計目的基因的互補片段引物pBBRaryR-F/pBBRaryR-R，擴增aryR基因的片段。基因片段為1 023 bp。擴增片段與質(zhì)粒連接后導入突變株中，由于pBBR1MCS-2載體含有卡那抗性，所以在抗性平板中理論上長出的單菌落即為互補菌株，利用載體的通用引物進行驗證獲得正確菌株。

1.2.3 致病性測定 采用噴霧接種的方法[20]。用KB液體配體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)野生型Aac-5菌株、突變菌株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體后用無菌水重復懸洗3次將培養(yǎng)基液體洗凈，加無菌水將菌懸液OD600調(diào)至0.3收集200 mL，菌懸液采用噴霧接種的方法均勻噴至2葉1心期的西瓜幼苗，無菌水噴霧作陰性對照，在溫度為28 ℃相對濕度為90%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d之后進行病情指數(shù)調(diào)查[21]。每個處理3盆苗，3次重復。

1.2.4 致敏性測定 KB液體培養(yǎng)基加抗生素28 ℃搖野生型菌株Aac-5、突變菌株ΔaryR和互補菌株ΔaryRcomp至對數(shù)期，然后離心，對菌體進行收集，無菌水重懸菌體至OD600=0.3。使用1 mL注射器（去掉針頭）取適量菌液，在幼嫩煙草葉背面（輕輕但是要盡量充滿注射部位）注射于葉脈與葉脈之間相交的地方，陰性對照為無菌水;在28 ℃光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，1 d后觀測供試菌株的致敏性發(fā)生情況，3次重復。

1.2.5 運動性測定 野生型Aac-5菌株、突變菌株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp供試菌株28 ℃培養(yǎng)收集菌體后無菌水調(diào)菌懸液至OD600=0.3取5 μL菌懸液點至專供測定菌株運動能力所用的運動性半固體培養(yǎng)基，輕點且點至培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)皿正面朝上放至28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每個處理進行9次生物學重復，試驗進行3次重復。對平皿中暈圈直徑進行測量拍照并進行統(tǒng)計學分析[21]。

1.2.6 蹭行運動測定 將野生型Aac-5菌株、突變菌株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp供試菌株在含有抗性（ApR）的平板上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察類似于波紋狀的痕跡是否在單個菌落周圍形成。

1.2.7 生物膜形成能力測定 將野生型Aac-5菌株、突變株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp單菌落在KB液體培養(yǎng)基搖至對數(shù)期，在滅菌三角瓶中加入30～50 mL菌液。28 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)7 d，將菌液倒出，加入0.1%的結(jié)晶紫溶液進行染色，時間持續(xù)1 h左右。將染色后的三角瓶用蒸餾水沖洗多次，之后將三角瓶放入烘箱80 ℃烘干1 h之后進行拍照，適量無水乙醇進行洗脫，測定其在OD575下的吸光度，每個處理3個生物學重復，試驗進行3次重復。

1.2.8 相關(guān)基因表達分析 將野生型Aac-5菌株和突變株菌株ΔaryR的總RNA進行提取并進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的cDNA濃度統(tǒng)一調(diào)至60 ng?μL-1，進行熒光定量檢測（qRT-PCR檢測）。選取rpoB作為內(nèi)參基因[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜噬酸菌LuxR家族蛋白AryR的結(jié)構(gòu)為Lux_C

蛋白AryR的結(jié)構(gòu)為Lux_C， 其氨基端沒有任何典型的結(jié)構(gòu)域，羧基端為典型的HTH結(jié)構(gòu)域。AryR為典型的LuxR家族調(diào)控因子（圖1）。

2.2 ΔaryR及互補菌株的制備及驗證

突變株的篩選采用三親交配的方法與同源重組雙交換的原理，將連接成功的重組質(zhì)粒pK18-LaryRL-Gm-RaryRR通過三親交配的方法轉(zhuǎn)入野生型Aac-5中，經(jīng)一系列檢測可獲得試驗所需突變菌株。由于突變株中被插入了Gm基因，所以可在含有慶大霉素抗性（GmR） 的培養(yǎng)基中進行單菌落的生長，但是果斑病病原菌是不含有此抗性的，所以可通過此種方法篩選得到突變株。Gm基因比aryR基因要短200 bp左右，檢測片段與華大測序結(jié)果均與預期一致，由此可證明獲得突變株（圖2～3）。

擴增目的基因互補片段，片段與pBBR1MCS-2載體進行連接構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過三親交配的方法導入已經(jīng)構(gòu)建好的突變株中，經(jīng)PCR和測序驗證符合預期結(jié)果，由此可證明成功獲得互補菌株（圖4）。

2.3 aryR基因缺失導致西瓜噬酸菌Aac-5菌株致病力下降

觀察噴霧接種8 d之后的西瓜幼苗發(fā)病情況。統(tǒng)計之后得出結(jié)果，無菌水作為陰性對照（CK），野生型Aac-5菌株、突變株ΔaryR、互補菌株 ΔaryRcomp的病情指數(shù)分別為48.32、34.74、45.28，突變株致病性未喪失但致病力有所下降，互補菌株的致病力基本恢復（圖 5）。

2.4 aryR基因缺失未導致西瓜噬酸菌Aac-5菌株喪失在非寄主煙草上的致敏性

三生煙草（Nicotiana tabacum）幼苗中注射野生型Aac-5、突變株ΔaryR及互補菌株ΔaryRcomp菌懸液，無菌水作為陰性對照（CK），24 h后觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對非寄主煙草仍具有致敏性，與Aac-5野生型菌株無差異（圖6）。

2.5 aryR基因缺失導致西瓜噬酸菌Aac-5菌株運動能力降低

36 h后對試驗結(jié)果進行記錄測量和拍照，結(jié)果得出，野生型 Aac-5、突變株菌株ΔaryR、互補菌株ΔaryRcomp運動直徑分別為 2.97、2.62、2.93 cm 。由此可知，aryR基因缺失導致Aac-5菌株運動能力降低，互補菌株的運動能力基本恢復（圖7）。

2.6 aryR基因缺失導致西瓜噬酸菌Aac-5菌株蹭行運動能力喪失

供試菌株在平板上的生長狀況顯示：野生型Aac-5菌株及互補菌株ΔaryRcomp可以在平板培養(yǎng)的單菌落四周形成水波紋狀的運動軌跡，突變株ΔaryR則喪失此蹭行能力（圖8）。

2.7 aryR基因缺失導致西瓜噬酸菌Aac-5菌株生物膜形成能力提高

相比較于野生型菌株，突變株ΔaryR的生物膜形成能力增強，OD575 的吸光值為2.10。互補菌株ΔaryRcomp與野生型Aac-5菌株相比，恢復了其生物膜形成能力（圖9）。

2.8 aryR基因缺失導致hrpE、hrcN、fliR、fliC基因表達量下調(diào)

采用qRT-PCR方法，對突變菌株中T3SS功能基因hrpE、hrcN及鞭毛基因fliR、fliC的表達情況進行了進一步的檢測。把野生菌株的表達作為標準設(shè)為1，結(jié)果表明，突變菌株中T3SS功能基因hrpE和hrcN表達值分別為0.14和0.40，鞭毛相關(guān)基因fliR和fliC表達值分別為0.89和0.90，表達量下調(diào)，與野生型菌株相比，存在極顯著差異（圖10）。說明aryR基因?qū)rpE、hrcN、fliR、fliC為正調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

許多病原菌利用LuxR調(diào)控因子調(diào)節(jié)細菌各種行為相關(guān)的功能基因的表達[23]。西瓜噬酸菌中AryR具有典型的LuxR家族調(diào)控因子結(jié)構(gòu)特征。筆者通過同源重組方法獲得了aryR基因全缺失的突變株，經(jīng)過對致病性、運動性、生物膜形成能力等表型的分析發(fā)現(xiàn)其致病力等表型發(fā)生變化，互補菌株的表型有所恢復，說明了aryR 基因?qū)卟〔≡闹虏⌒?、運動性包括運動能力和蹭行運動能力、生物膜形成能力具有重要的影響。蛋白AryR的氨基端無明顯的結(jié)構(gòu)域，通過親緣關(guān)系分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與Xoo的蛋白OryR分在一簇，親緣關(guān)系最近，因此西瓜噬酸菌LuxR家族功能蛋白AryR是否也能如蛋白OryR一樣通過接收寄主植物上的小分子信號物質(zhì)來行使功能需要進一步的試驗證明。

III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）是植物病原細菌致病過程中的關(guān)鍵因子[24]。本實驗室前期研究證明，III型分泌系統(tǒng)hrcQ缺失導致Aac-5菌株對寄主的致病能力喪失，運動性及生物膜形成能力降低，并喪失了引起煙草過敏性反應能力[25]，hrcN缺失導致噴霧接種的菌株致病力喪失[26]。hrcC基因的缺失使得突變菌株喪失了致敏性及致病力[27]。hrcR基因缺失后菌株的致病力也完全喪失[28];hpaA和hrpG基因突變體的鞭毛缺失且細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化[29]。在T3SS中hrpE、hrcN基因分別起到針管運輸和提供能量的作用[30-31]，通過qRT-PCR測定了西瓜噬酸菌中III 型分泌系統(tǒng)功能基因 hrpE及hrcN的表達情況，發(fā)現(xiàn)aryR基因的缺失引起了西瓜噬酸菌Aac-5菌株III型分泌系統(tǒng)功能基因的表達量顯著下調(diào)，由此推測aryR基因?qū)rpE和hrcN具有正調(diào)控作用。aryR基因的缺失導致hrpE和hrcN的表達量下調(diào)，相應的針管結(jié)構(gòu)與提供能量的功能受到影響，因此III型分泌系統(tǒng)效應子分泌時受到影響，可能是突變株致病力下降的原因之一。筆者證實西瓜噬酸菌中aryR缺失后，病原菌在非寄主煙草中引起過敏性反應的能力并未喪失，這說明aryR可能并非是西瓜噬酸菌在非寄主煙草上誘導過敏反應（HR）的關(guān)鍵基因之一。

鞭毛在植物病原細菌的致病機制和定殖中起重要作用[32]，通過測定鞭毛功能基因fliR及fliC在野生型Aac-5菌株和突變株中的表達量，發(fā)現(xiàn)基因aryR的缺失引起fliR基因及fliC基因的表達量下調(diào)，病原菌運動能力下降。因此推測，運動能力的下降是引起突變株ΔaryR致病力下降的原因之一。

本研究中Aac-5野生型菌株為西瓜噬酸菌中的II組菌株，此菌株在玻璃和塑料表面均不能形成明顯的生物膜[33]。突變株ΔaryR的生物膜形成能力明顯高于野生菌株。細菌中能增強附著能力的表面附屬物，例如鞭毛，與生物膜的形成有關(guān)[34-36]。蹭行運動與生物膜的形成密切相關(guān)，已在銅綠假單胞菌中得到證實[37]。本研究中，Aac-5缺失aryR基因后，運動能力明顯降低，蹭行運動能力缺失。因此推測，運動能力下降和蹭行運動能力的缺失是突變株生物膜形成能力增強的主要原因之一。

筆者對調(diào)控因子aryR 的基因功能僅做了初步探索，表明了調(diào)控因子aryR在果斑病病原菌——西瓜噬酸菌中具有重要的調(diào)控作用，對西瓜噬酸菌的致病機制做了初步研究。但該調(diào)控因子是否與水稻白葉枯病菌中OryR一樣可以與寄主植物互作需要進一步深入研究。

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