張彭飛 苑克勇 黃正蔚

牙菌斑是指細菌以生物膜的形式附著于口腔軟硬組織表面而形成的復雜微生物群落[1]，可導致齲齒、牙齦炎、牙周炎等口腔疾病[2-4]。唾液中的大量微生物及宿主飲食中的營養(yǎng)物質等因素使得菌斑的產生不可避免，因而去除牙菌斑，維護口腔衛(wèi)生成為預防和治療口腔常見疾病，保障牙體和牙周組織健康的重要措施?？刂凭叩姆椒ㄓ泻芏?，如機械法，藥物法，免疫療法等。其中，機械法去除牙菌斑是最常見且可靠的，如刷牙、使用牙線、牙簽、牙間隙刷等，因其方便快捷在日常生活中逐漸得以普及[5-7]。但相較于其他機械去菌方法，人們對刷牙的依從性更好。并且多項研究表明，通過刷牙可有效去除牙齒表面的牙菌斑/生物膜，對預防口腔疾病，特別是齲齒、牙齦炎和牙周炎等有重要作用[2-4]。因此，在個人日常口腔衛(wèi)生保健中使用牙刷已經成為多數(shù)人潔齒護齒的重要方法[5]。

一般認為，使用手動牙刷是保持口腔衛(wèi)生的基本方法。自20 世紀60 年代初電動牙刷問世以來[8]，對于電動牙刷的研究和開發(fā)日趨增多，其作為一種新形式的口腔保健方法也逐漸為大眾所認可。電動牙刷通過一定振動頻率的刷頭的側向及旋轉運動來模擬牙刷的手動運動[9]，因此，不同的刷頭類型對電動牙刷功效的影響也不盡相同。磨損是由于牙體硬組織因外力(單純機械磨擦)造成慢性磨耗的現(xiàn)象，可由遺傳因素，如先天性釉質發(fā)育不全等，酸蝕，磨牙癥，橫刷牙等引起[10]。橫刷牙對牙齒頸部磨損影響較大，可導致牙本質過敏，楔狀缺損等疾患。而牙刷毛的軟硬度也是影響刷牙對牙齒磨損的重要因素[11]。

本實驗通過構造變異鏈球菌(S.mutans)和內氏放線菌(A.naeslundii)雙菌種生物膜[12-13]，在體外模型中用不同硬軟頭電動牙刷對牙面菌斑生物膜進行接觸式去除，旨在比較硬軟頭電動牙刷之間菌斑清除的功效；用硬軟頭電動牙刷對磨片分別處理，借以對比不同硬度刷毛對釉質磨損的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腦心浸液培養(yǎng)液、瓊脂及血平板培養(yǎng)基(BD,美國)；接種針、牛恒磨牙、革蘭氏染色劑 (上海生工生物科技)；95%乙醇；1%結晶紫；0.9%生理鹽水；牙膏(Colgate?，美國)；上朵SD01電動牙刷(尼龍絲刷頭:刷頭大小均10 mm×18 mm，刷毛數(shù)量1 800 根/支，刷毛直徑0.127 mm、納米軟膠刷頭：刷頭大小均10 mm×18 mm，刷毛數(shù)量1 800 根/支，刷毛直徑0.127 mm)、上朵YB8702手動牙刷(刷頭大小10 mm×18 mm，數(shù)量1 600 根/支，刷毛直徑0.152 mm)(深圳市優(yōu)尼雅時尚電器有限公司)。

1.2 實驗設備

超凈工作臺；厭氧培養(yǎng)箱(含體積分數(shù)80%的N2、10%的CO2和10%的H2)、分光光度儀、 超速離心機(Beckman Optima L-100XP，美國)；酶標儀(BIO-TEK，美國)；光學顯微鏡(Whitley DG250,英國)；SEM(FEI,Qnanta-200F，荷蘭)。

1.3 實驗菌株培養(yǎng)及純度鑒定

本實驗采用的S.mutansUA159和A.naeslundiiT14V-J1由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物重點實驗室提供。室溫下復蘇-80 ℃冰箱中的細菌凍存液后，吸取30 μl菌液，四區(qū)劃線法涂布于固體培養(yǎng)基上。厭氧培養(yǎng)48 h后, 挑取單克隆菌落于4 ml BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)厭氧培養(yǎng)，變異鏈球菌(S.mutans)培養(yǎng)24 h，內氏放線菌(A.naeslundii)培養(yǎng)48 h。 革蘭氏染色鑒定兩菌種純度。

1.4 生物膜模型建立

將2 種細菌懸液室溫下以12 000 r/min離心5 min取沉淀， 并用0.9%生理鹽水清洗2 次以消除細菌團塊。然后用BHI培養(yǎng)液稀釋，在600 nm波長下用分光光度儀測量稀釋后菌液A值，將A值為0.5的2 種菌液稀釋液作為原液，調整菌液濃度為3×108CFU/ml。 將去除全部軟組織的離體牛牙頰面在無菌條件下制備成8 mm×8 mm×2 mm大小釉質磨片， 共12 片， 分為4 組， 每組3 片。 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min， 分別置于24 孔板中。將稀釋后的S.mutans及A.naeslundii細菌懸液各取100 μl依次滴至磨片表面，并用BHI將每孔補齊至1.5 ml將牛牙釉質磨片完全覆蓋。將孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，24 h換液，共培養(yǎng)48 h，在磨片表面形成雙菌種生物膜。

1.5 牙刷處理菌斑生物膜

將已形成生物膜的牛牙釉質磨片分4 組， 每組3 片。 分別為： A:對照組，不做處理； B:硬刷毛電動牙刷組，使用上朵SD01高頻振動牙刷及尼龍絲刷頭處理； C:軟刷毛電動牙刷組，使用上朵SD01高頻振動牙刷及納米軟膠刷頭處理；D：手動牙刷組，使用上朵YB8702手動牙刷處理。電動牙刷振動頻率43 200 次/min，生物膜和牙刷刷毛均浸沒于含17%牙膏(Colgate?，美國)的BHI培養(yǎng)液中。后3 組分別用相應的牙刷對磨片表面菌斑生物膜進行接觸式處理，牙刷均用砝碼加重后，垂直向施加1.5 N力于釉質磨片，自近中至遠中磨刷5 s[14-15]。

1.6 結晶紫吸附半定量實驗

將牛牙釉質磨片置于24孔板， 1 ml 0.9%生理鹽水漂洗生物膜3 次以去凈未結合到磨片上的細菌。每孔加入1%結晶紫染液1 ml， 靜置15 min后吸棄染料， 0.9%生理鹽水漂洗3 次去凈未結合的染液。每孔加入500 μl 95%乙醇，搖床脫色30 min。取倍比稀釋后的結晶紫脫色液100 μl至96 孔板(每組3 個復孔，實驗重復3 次)， 565 nm波長處用酶標儀下測定各孔吸光度(A值)。對照組結晶紫脫色液A值可半定量測量生物膜形成量，各個處理組的結晶紫脫色液A值可作為處理后剩余的生物膜量。各個處理組的生物膜去除量可按以下方法計算：

生物膜去除量=對照組A值-處理組A值

1.7 磨損實驗

另制取3片8 mm×8 mm×2 mm牛牙釉質磨片，樹脂包埋固定后，分為3 組。 A: 對照組，不做處理； B: 硬刷毛電動牙刷組，使用上朵SD01高頻振動牙刷及尼龍絲刷頭接觸式處理； C: 軟刷毛電動牙刷組，使用上朵SD01高頻振動牙刷及納米軟膠刷頭接觸式處理。電動牙刷振動頻率43 200 次/min，使用含17%牙膏的0.9%生理鹽水作為磨損液。牙刷均用砝碼加重后，垂直向施加1.5 N力于釉質磨片，自近中至遠中磨刷1 h后， 用0.9%生理鹽水清洗2 次以去除釉質磨片表面磨損液。之后將各組標本置于SEM下，觀察釉質磨片的表面形貌。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計處理。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較各處理組間生物膜去除量的差異，以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 結晶紫吸附實驗結果

各處理組菌斑生物膜去除量結果如圖1，電動牙刷和手動牙刷均能有效的去除菌斑生物膜。上朵SD01電動牙刷+尼龍絲刷頭菌斑生物膜去除量(0.45±0.02)與上朵SD01電動牙刷+納米軟膠刷頭(0.44±0.03)均大于YB8702手動牙刷組(0.25±0.02)，差距具有統(tǒng)計學意義(t=6.31，P<0.01；t=5.13，P<0.01)。而兩電動牙刷組菌斑生物膜去除量差距無統(tǒng)計學意義(t=0.35，P=0.75)。

圖1 結晶紫染色法比較各組菌斑生物膜去除量

2.2 SEM觀察結果

SEM下3 組釉質磨片表面形貌如圖2。未經刷牙處理的釉質磨片(對照組)表面呈現(xiàn)較平整光滑的表面，無明顯凹陷；使用上朵SD01高頻振動牙刷及尼龍絲刷頭處理的硬刷毛電動牙刷組，釉質磨片表面呈現(xiàn)大量密集不平整的凹陷，凹陷程度較深；使用上朵SD01高頻振動牙刷及納米軟膠刷頭處理的軟刷毛電動牙刷組，釉質磨片表面呈現(xiàn)散在分布凹陷，凹陷數(shù)量較B組的少，凹陷程度也較B組稍淺?？梢钥闯觯褂秒妱友浪⑺⒀罆τ再|表面造成磨損，且牙刷刷毛硬度越大，造成釉質表面的凹陷越大越深越多，表面形態(tài)越粗糙，對釉質的磨損越重。

圖2 各組釉質磨片表面形貌(SEM， ×5 000)

3 討 論

牙菌斑是導致齲患和牙周病的重要因素。唾液中的蛋白或糖蛋白吸附到牙面上形成獲得性薄膜后，很快不同種類的細菌按照不同的時空順序黏附到獲得性薄膜上從而形成牙菌斑生物膜。最早定植于牙面的細菌是鏈球菌和放線菌，之后更多致病和共生的菌株逐漸黏附其上，引起齲病，牙周病等疾病[12-18]。因而有效的去除牙菌斑生物膜就成為保護口腔健康的一項重要措施。刷牙則是日常生活中控制菌斑最普遍且有效的方法。隨著科技的發(fā)展，電動牙刷，磁療牙刷，負離子牙刷等相繼出現(xiàn)，并逐漸走入大眾的視野，其中應用廣泛的仍然是電動牙刷。

變異鏈球菌(S.mutans)是目前公認的主要致齲菌之一。其胞壁表面的脂磷壁酸，蛋白多糖等使得細菌在牙表面能夠黏附定植[16,18]；并具有產酸耐酸等毒力特征，在16 h內就能在牙面形成致密的菌斑生物膜[12]。內氏放線菌(A.naeslundii)也是牙面菌斑生物膜早期定植的先鋒菌之一，且與變異鏈球菌對營養(yǎng)物質無競爭性抑制[12,17]，因而在早期牙菌斑生物膜的形成發(fā)展過程中，兩者起著非常重要的作用。Verkaik等[13]對各類體外菌斑生物膜去除實驗模型進行比較發(fā)現(xiàn)：A.naeslundii和S.mutans作為先鋒菌，二者通過共聚集作用定植于獲得性薄膜上，黏附力相對于單菌種或的其他多菌種生物膜更強。更適宜用作菌斑去除實驗的體外模型。這與Paramonova等[19]的研究結果是一致的。本實驗同樣采用A.naeslundii和S.mutans雙菌種，通過BHI培養(yǎng)液吸附到牛牙釉質磨片上形成生物膜，能夠有效模擬體內菌斑生物膜的特性，而且容易定量培養(yǎng)，利于后續(xù)重復實驗。

刷牙過程中牙刷是必不可少的工具，刷頭與牙面的摩擦起著主要清潔作用。清潔效果是評價牙刷功能最主要的方面。本實驗通過牛牙釉質磨片及雙菌種生物膜構建的體外模型，來比較不同刷頭的電動牙刷接觸式刷牙時的菌斑清除效率，從而對口腔保健提供依據(jù)。本實驗結果顯示，電動牙刷和手動牙刷均能有效去除牙面菌斑生物膜，這說明通過刷牙能夠有效的去除菌斑，對維護口腔清潔和健康具有重要積極作用。且電動牙刷的菌斑清除效率均比手動牙刷高，具有統(tǒng)計學差異，這說明相較于傳統(tǒng)的手動牙刷，電動牙刷能夠更大程度的去除牙面菌斑生物膜，保障牙體及牙周組織健康，這與多項研究結果一致[3-4,14,18-21]。Schmidt等[22]還通過使用電動牙刷處理鄰面菌斑生物膜體外模型，并用共聚焦顯微鏡觀察處理后的生物膜，計算總生物量，研究得出對于手動牙刷難以清潔到鄰面菌斑生物膜，電動牙刷表現(xiàn)出了良好的清潔功效，對預防鄰面齲等有著更為積極的作用。另外，電動牙刷對于特殊人群[23]，以及調動刷牙積極性上也有著不可替代的作用。因而，電動牙刷具有更優(yōu)良的口腔保健能力。

本實驗采用大小，形狀類似，但硬度不同的電動牙刷刷頭來比較不同硬度刷毛的電動牙刷對菌斑生物膜去除功效的影響，結果顯示2 種刷頭電動牙刷處理后菌斑生物膜去除量無統(tǒng)計學差異。這說明，對電動牙刷而言，刷毛的材質并不會影響其對菌斑生物膜的清除功效，這與Schmickler等[24]的研究結果是一致的。

在日常生活中，牙齒磨損是不可避免的[10,25]。如果發(fā)生重度磨損，則可能會導致咬合紊亂、咀嚼功能下降，顳下頜關節(jié)紊亂病(TMD)等，給人們的生活帶來嚴重的影響。所以，盡量減少牙齒磨損對口腔保健至關重要[10-11,25]。刷牙是廣泛使用的口腔保健措施，從摩擦學角度看, 刷牙是牙刷、牙膏和牙齒之間相互摩擦的過程,而這種摩擦會導致牙齒釉質表面基本結構的改變。因刷牙導致的牙齒磨損早已被大量臨床和實驗研究所證實, 又被稱為“刷牙磨損”。刷牙的頻率，刷牙的力度，刷牙的時長，刷毛的軟硬，牙膏的種類等[26-28]都可能對刷牙時釉質的磨損產生影響。本實驗選用與人牙結構成分類似的牛牙，而未選用臨床拔取的人離體牙，是因為大眾人群難免會接受一些口腔保健措施，且方式、效果不盡相同，用其作為樣本一致性較差。使用從未接觸過口腔衛(wèi)生保健的牛牙，可以保證各組樣本初始特性具有一致性。由于目前對于刷毛的軟硬對釉質的磨損的研究較少，故本實驗將研究對象控制為刷毛硬度。廣泛宣傳的刷牙時間為每次至少2 min[3-5,21-24]，故本次實驗設計1 h刷牙時間來模擬1年的刷牙時長。在本次實驗中， SEM下觀察釉質形貌發(fā)現(xiàn)，使用電動牙刷刷牙會對釉質表面造成磨損，且硬度較大的尼龍絲刷頭組造成釉質表面的凹陷越大越深越多，表面形態(tài)越粗糙。這說明，使用較軟的電動牙刷刷頭，對釉質的磨損較小，能夠更好的保護釉質表面結構。

綜上，在菌斑生物膜體外模型中，相對于傳統(tǒng)手動牙刷，電動牙刷可更高效的去除牙面菌斑生物膜，不同硬度刷毛的電動牙刷的菌斑清除功效沒有明顯差異。且在使用電動牙刷刷牙時，軟毛刷頭對釉質表面的磨損較小，故使用軟毛刷頭電動牙刷對日?？谇槐＝∮兄e極的作用。