曹 盼,曾曉萍,梁光義*,徐必學(xué)*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014；3.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省天然藥物工程研究中心，貴州 貴陽 550014)

惡性腫瘤是當(dāng)今社會(huì)面臨的最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增1810萬癌癥患者，因癌癥死亡的患者達(dá)960萬人[4]。盡管臨床上于惡性腫瘤的抗腫瘤藥物種類繁多，作用機(jī)制各異，但嚴(yán)重的毒副作用以及耐藥性、增殖轉(zhuǎn)移等缺陷，導(dǎo)致患者存活率偏低[5-7]。

Scheme 1

小分子二肽類化合物具有廣泛的生物活性、高度的靶向?qū)Ｒ恍?、選擇性以及低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[8-12]。某些含有酪氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸殘基的多肽類化合物能增強(qiáng)核酸或蛋白的代謝而具有抗腫瘤作用[13-14]，同時(shí)該類化合物還有很好的抗炎[15]、抗菌[16]等生物活性。Yen等[17-18]報(bào)道了一類含有芴甲氧羰酰基(Fmoc)取代的苯丙氨酸二肽化合物，對(duì)HepG2、A549等腫瘤細(xì)胞有抑制作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，部分苯甲酸取代的苯丙氨酸二肽衍生物能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的水平，進(jìn)而上調(diào)P38 MAPK通路的活性，穩(wěn)定P53、激活P21轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，以L-酪氨酸為原料，引入4-芐氧基苯甲酸基團(tuán)所得部分二肽衍生物的抗腫瘤活性較高。

因此，本文擬在保留4-芐氧基苯甲酸取代的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成了一系列新的L-酪氨酸二肽衍生物。以L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽為原料，與芐氧基苯甲酸縮合制得N-對(duì)芐氧基苯甲?；?L-酪氨酸甲酯(1);1經(jīng)堿水解得N-對(duì)芐氧基苯甲?；?L-酪氨酸(2)；2分別于L-苯丙氨醇或L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽縮合得N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-O-甲基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(3a)或N-[N-(4-芐氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(3b)；3a或3b經(jīng)烷基化得到目標(biāo)化合物4a～4h(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和MS(ESI)表征。采用MTT法評(píng)價(jià)了目標(biāo)化合物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的體外抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XT-4型熔點(diǎn)儀；Bruker Avance NEO 600 MHz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))。

四氮唑藍(lán)(MTT)，sigma公司；其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1)1的合成

取酪氨酸甲酯鹽酸鹽10.7 g(46.2 mmol)和對(duì)芐氧基苯甲酸10.0 g(44.0 mmol)加入500 mL反應(yīng)瓶中，氬氣保護(hù)下，依次加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)100 mL、無水二氯甲烷(150 mL)、N-甲基嗎啉(NMM)16.1 mL(145 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)2.7 g(21.9 mmol)，攪拌使其完全溶解；冰浴冷卻至0 ℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)10.1 g(52.8 mmol)，繼續(xù)攪拌10 h(TLC檢測(cè))。加少量水終止反應(yīng)，減壓回收二氯甲烷，殘留物加入乙酸乙酯(500 mL)和蒸餾水(500 mL)，分液，有機(jī)層依次用水(200 mL)、1.0 mol·L-1鹽酸(200 mL)、飽和NaHCO3溶液(200 mL)以及飽和氯化鈉溶液(200 mL)洗滌，無水MgSO4干燥，減壓回收溶劑得粗品1，未經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步反應(yīng)。

(2)2的合成

將上一步所得粗品117.8 g(44.0 mmol)加入300 mL二氯甲烷部分溶解，攪拌下加入1.0 mol·L-1NaOH溶液175 mL(175 mmol)，體系中有大量白色固體析出，攪拌下反應(yīng)2 h(TLC檢測(cè))。以濃鹽酸調(diào)至pH 2～3，靜置，大量白色固體析出時(shí)過濾，濾餅用蒸餾水洗滌至pH呈中性，真空干燥得白色粉末狀化合物214.5 g，收率84.3%;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:12.66(s,1H),9.17(s,1H),8.57～8.39(m,1H),7.88～7.73(m,2H),7.46(d,J=7.1 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.15～7.03(m,4H),6.72～6.61(m,2H),5.17(s,2H),4.60～4.41(m,1H),3.13～3.01(m,1H),3.01～2.88(m,1H)。

(3)3a～3b的合成(以3a為例)

取化合物2a14.3 g(36.5 mmol)和L-苯丙氨醇6.1 g(40.2 mmol)于500 mL反應(yīng)瓶中，氬氣保護(hù)下，加入DMF(30 mL)、無水二氯甲烷(120 mL)和NMM 13.4 mL(120 mmol)，攪拌溶解完全，冰浴冷卻至0 ℃后緩慢滴加氯甲酸異丁酯(IBCF)5.1 mL(39.1 mmol)和無水二氯甲烷(20 mL)的混合溶液，滴畢，攪拌下反應(yīng)11 h(TLC檢測(cè))。加少量水終止反應(yīng)，減壓回收二氯甲烷，加入蒸餾水(500 mL)、乙酸乙酯(500 mL)，分液，乙酸乙酯層依次用水(200 mL)、1.0 mol·L-1鹽酸(200 mL)、飽和NaHCO3溶液(200 mL)以及飽和氯化鈉溶液(200 mL)洗滌，MgSO4干燥，減壓回收溶劑，殘余物經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶得白色固體化合物3a14.8 g，收率77.2%;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:9.12(s,1H),8.26(d,J=8.1 Hz,1H),7.84～7.73(m,3H),7.47(d,J=7.3 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.23～7.19(m,2H),7.18(t,J=7.4 Hz,2H),7.12(t,J=7.2 Hz,1H),7.10～7.04(m,4H),6.67～6.56(m,2H),5.18(s,2H),4.88～4.73(m,1H),4.62～4.52(m,1H),3.96～3.83(m,1H),3.35～3.23(m,2H),2.94～2.78(m,3H),2.70～2.62(m,1H)。

用類似的方法合成N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(3b)：白色粉末，收率58.1%,m.p.192～193 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:9.16(s,1H),8.44(d,J=7.3 Hz,1H),8.32(d,J=8.4 Hz,1H),7.80～7.74(m,2H),7.46(d,J=7.5 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.26～7.16(m,5H),7.14～7.09(m,2H),7.09～7.04(m,2H),6.67～6.60(m,2H),5.17(s,2H),4.68～4.60(m,1H),4.55～4.48(m,1H),3.59(s,3H),3.06(dd,J=14.0 Hz,6.0 Hz,1H),3.03～2.92(m,2H),2.84(dd,J=14.0 Hz,10.8 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.4,172.3,166.1,161.1,156.1,137.5,137.2,130.5,129.7,129.6,128.9,128.8,128.7,128.4,128.2,127.0,126.9,115.3,114.7,69.8,55.3,54.2,52.3,37.1,36.6;MS(ESI)m/z:575.3{[M+Na]+}。

(4)4a～4i的合成(以4a為例)

取化合物3a0.3 g(0.6 mmol)于25 mL反應(yīng)瓶，加入4 mL DMF溶解，依次加入K2CO30.2 g(1.4 mmol)和38 μL CH3I(0.6 mmol)，氬氣保護(hù)下，攪拌下反應(yīng)82 h(TLC檢測(cè))。加入適量水和乙酸乙酯，分液，乙酸乙酯層依次用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水MgSO4干燥，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=20/1,V/V)純化得4a0.2 g。

用類似的方法合成4b～4h。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-O-甲基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4a)：白色粉末，收率64.5%,m.p.182～183 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.5 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.7 Hz,2H),7.46(d,J=6.9 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.26～7.19(m,4H),7.18(t,J=7.4 Hz,2H),7.12(t,J=7.2 Hz,1H),7.07(d,J=8.8 Hz,2H),6.80(d,J=8.6 Hz,2H),5.17(s,2H),4.82(t,J=5.4 Hz,1H),4.64～4.57(m,1H),3.95～3.86(m,1H),3.68(s,3H),3.38～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.96(dd,J=13.8 Hz,4.6 Hz,1H),2.92～2.82(m,2H),2.67(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,158.1,139.4,137.2,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,113.9,69.8,62.7,55.5,55.4,52.9,36.9,36.8;MS(ESI)m/z:561.4{[M+Na]+}。

2016年起開始全面施行的《居住證暫行條例》為城市遷入人口提供了多項(xiàng)公共福利和便利。然而從社會(huì)權(quán)角度觀之，利益是構(gòu)成權(quán)利的要素，但不是權(quán)利的本身。權(quán)利是集資格、利益、主張和權(quán)能、自由等多重要素于一體的概念。從更為深刻的意義講，權(quán)利的存在是一種制度規(guī)范，其功能不是個(gè)體的絕對(duì)幸福，而是消除大多數(shù)人不幸的社會(huì)根源[6]。從利益與權(quán)利的邏輯關(guān)系來看，利益可能產(chǎn)生于權(quán)利之前，但利益只有在權(quán)利規(guī)范形成之后才能得到穩(wěn)定和長(zhǎng)久的保障，否則，利益存在是時(shí)效性的，缺乏穩(wěn)定的。《暫行條例》所能發(fā)揮的功能并不是法律意義上的“賦權(quán)”，而只是政策上的“獲益”。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(4b)：白色固體，收率63.4%,m.p.194～195 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.48(d,J=7.4 Hz,1H),8.36(d,J=8.5 Hz,1H),7.78(d,J=8.9 Hz,2H),7.46(d,J=6.7 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.28～7.21(m,6H),7.21～7.16(m,1H),7.06(d,J=8.9 Hz,2H),6.81(d,J=8.7 Hz,2H),5.17(s,2H),4.72～4.62(m,1H),4.55～4.48(m,1H),3.68(s,3H),3.59(s,3H),3.06(dd,J=13.8,5.9 Hz,1H),3.03～2.95(m,2H),2.88(dd,J=13.8 Hz,10.8 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.3,172.3,166.1,161.1,158.2,137.5,137.1,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.7,128.4,128.3,127.1,126.9,114.7,113.9,69.8,55.3,55.2,54.2,52.3,37.1,36.5;MS(ESI)m/z:589.2{[M+Na]+}。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-O-乙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4c)：白色粉末，收率60.1%,m.p.196～197 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.4 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.8 Hz,2H),7.46(d,J=6.9 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.24～7.15(m,6H),7.15～7.09(m,1H),7.07(d,J=8.9 Hz,2H),6.77(d,J=8.7 Hz,2H),5.17(s,2H),4.82(t,J=5.5 Hz,1H),4.63～4.56(m,1H),3.93(q,J=6.9 Hz,2H),3.92～3.86(m,1H),3.37～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.95(dd,J=13.9 Hz,4.6 Hz,1H),2.90～2.82(m,2H),2.66(dd,J=13.6 Hz,8.0 Hz,1H),1.27(t,J=7.0 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.1,161.1,157.4,139.4,137.2,130.6,130.6,129.7,129.6,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,114.4,69.8,63.2,62.7,55.5,52.9,36.9,36.8,15.1;MS(ESI)m/z:575.5{[M+Na]+}。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲酰基)-O-烯丙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4d)：白色粉末，收率74.4%,m.p.198～199 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.29(d,J=8.4 Hz,1H),7.80(d,J=8.3 Hz,1H),7.77(d,J=8.4 Hz,2H),7.45(d,J=7.5 Hz,2H),7.39(t,J=7.5 Hz,2H),7.32(t,J=7.3 Hz,1H),7.22～7.13(m,6H),7.11(t,J=7.2 Hz,1H),7.05(d,J=8.5 Hz,2H),6.80(d,J=8.3 Hz,2H),6.03～5.95(m,1H),5.34(dd,J=17.2 Hz,2.1 Hz,1H),5.23～5.18(m,1H),5.16(s,2H),4.79(t,J=5.5 Hz,1H),4.62～4.55(m,1H),4.47(d,J=5.2 Hz,2H),3.92～3.85(m,1H),3.35～3.29(m,1H),3.30～3.22(m,1H),2.94(dd,J=13.9,4.6 Hz,1H),2.90～2.80(m,2H),2.65(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,157.1,139.4,137.2,134.3,130.9,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.3,117.7,114.7,114.6,69.8,68.5,62.7,55.5,52.9,36.9,36.8;MS(ESI)m/z:587.5{[M+Na]+}。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲酰基)-O-二甲氨基丙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4e)：白色粉末，收率57.8%,m.p.181～182 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.4 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.6 Hz,2H),7.46(d,J=7.5 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.24～7.15(m,6H),7.12(t,J=7.1 Hz,1H),7.07(d,J=8.5 Hz,2H),6.78(d,J=8.4 Hz,2H),5.17(s,2H),4.80(t,J=5.5 Hz,1H),4.64～4.54(m,1H),4.02～3.80(m,3H),3.34～3.25(m,2H),2.95(dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,1H),2.91～2.82(m,2H),2.67(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H),2.31(t,J=7.1 Hz,2H),2.12(s,6H),1.79(p,J=6.7 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,157.5,139.5,137.2,130.7,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.3,114.7,114.4,69.8,66.1,62.7,56.2,55.5,52.9,45.6,36.9,36.9,27.4;MS(ESI)m/z:610.5{[M+H]+}。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-O-乙酸乙酯基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4f)：白色粉末，收率51.5%,m.p.178～179 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.31(d,J=8.5 Hz,1H),7.86～7.74(m,3H),7.46(d,J=7.0 Hz,2H),7.43～7.36(m,2H),7.37～7.30(m,1H),7.24～7.14(m,6H),7.16～7.09(m,1H),7.11～7.02(m,2H),6.84～6.76(m,2H),5.17(s,2H),4.81(t,J=5.4 Hz,1H),4.69(s,2H),4.63～4.55(m,1H),4.13(q,J=7.2 Hz,2H),3.95～3.85(m,1H),3.37～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.95(dd,J=13.9,4.5 Hz,1H),2.92～2.82(m,2H),2.66(dd,J=13.7 Hz,7.9 Hz,1H),1.17(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,169.3,166.1,161.1,156.5,139.4,137.2,131.6,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,114.5,69.8,65.1,62.7,61.0,55.4,52.9,36.9,36.8,14.5;MS(ESI)m/z:633.3{[M+Na]+}。

N-[N-(4-芐氧基-苯甲?；?-O-二甲氨基乙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(4h)：白色固體，收率56.1%,m.p.164～165 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.45(d,J=7.5 Hz,1H),8.34(d,J=8.5 Hz,1H),7.77(d,J=8.4 Hz,2H),7.49～7.43(m,2H),7.43～7.37(m,2H),7.37～7.31(m,1H),7.29～7.13(m,7H),7.06(d,J=8.2 Hz,2H),6.80(d,J=8.4 Hz,2H),5.17(s,2H),4.74～4.59(m,1H),4.55～4.45(m,1H),3.97(t,J=5.9 Hz,2H),3.58(s,3H),3.11～3.02(m,1H),3.02～2.94(m,2H),2.93～2.83(m,1H),2.58(t,J=5.7 Hz,2H),2.19(s,6H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.3,172.3,166.1,161.1,157.4,137.5,137.2,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.7,128.4,128.2,127.0,126.9,114.7,114.5,69.8,66.0,58.2,55.2,54.2,52.3,45.9,37.1,36.5;MS(ESI)m/z:624.2{[M+H]+}。

1.3 抗腫瘤活性測(cè)試

以阿霉素為陽性對(duì)照，采用MTT法[20]測(cè)試了化合物對(duì)白血病細(xì)胞(K562)、人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)的體外抑制活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽為原料與對(duì)芐氧基苯甲酸縮合時(shí)，若采用混酐法縮合，所需產(chǎn)物收率很低，可能是由于對(duì)芐氧基對(duì)苯甲酸的供電子作用，使其反應(yīng)性降低所致。本實(shí)驗(yàn)采用碳二亞胺類縮合劑EDCI與DMAP、NMM在DMF-DCM溶劑系統(tǒng)下高效、專一的促進(jìn)酰胺鍵的形成。該方法不僅收率較高(80.3%～84.3%)，且后處理較為簡(jiǎn)便，副產(chǎn)物水溶性脲經(jīng)溶劑萃取即可除去。

2.1 抗腫瘤活性

目標(biāo)化合物3b和4a～4h對(duì)白血病細(xì)胞(K562)、人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)等3種細(xì)胞株的抗腫瘤活性測(cè)試抑制活性見表1。從表1可以看出：①合成的化合物對(duì)HepG2細(xì)胞有一定的抑制活性，化合物4e、4g和4h對(duì)三種細(xì)胞株均有一定的抑制活性。②通過對(duì)比，當(dāng)R1為-(CH2)2N(CH3)2或-(CH2)3N(CH3)2時(shí)，抑制活性明顯增強(qiáng)。其中化合物4e對(duì)HepG2和K562細(xì)胞的抑制活性均優(yōu)于陽性對(duì)照藥阿霉素，其IC50分別為0.41和11.77 μmol·L-1，具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。

表 1 3b和4a～4h的體外抗腫瘤活性*Table 1 In vitro antitumor activities of 3b and 4a～4h

*N/A:not available。

合成了9個(gè)新型的酪氨酸二肽類衍生物(3b,4a～4h)，并采用MTT法測(cè)試了化合物對(duì)A549、K562和HepG2腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。所有化合物對(duì)HepG2具有抑制活性，化合物4e、4g和4h對(duì)3種細(xì)胞株均有一定的抑制活性，特別是4e對(duì)HepG2和K562細(xì)胞的抑制活性均優(yōu)于陽性對(duì)照阿霉素，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。