孫凌霄， 金曉玲，2*， 胡希軍，2， 譚殷殷， 羅峰， 張哲， 陳燕

(1.中南林業(yè)科技大學 風景園林學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004)

廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)又名荷花玉蘭、洋玉蘭，為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)常綠喬木，樹高7 m～13 m，在原產(chǎn)地最高可達30 m，胸徑20 cm～39 cm；樹皮深灰色，嫩枝和芽均密被銹色短絨毛，具有很大的向北方地區(qū)引種的潛力[1].

木蘭科植物的抗寒性研究一直以來都是一個比較熱門的研究方向，大量試驗研究都認為廣玉蘭是木蘭科中抗寒性較強的植物[2].劉艷萍等[3]通過測定幾種廣玉蘭品種的相對電導率計算出半致死溫度，并進行比較.相對電導率隨著溫度的降低，先緩慢上升，然后急劇升高，最后趨于穩(wěn)定，每個品種的變化趨勢均一致.開始降溫時相對電導率緩慢增加，說明在此溫度范圍內(nèi)能夠適應，但溫度下降到-5 ℃～-10 ℃時，相對電導率開始急劇升高，而且溫度進一步降低到-20 ℃～-25 ℃時，廣玉蘭葉片的相對電導率趨于穩(wěn)定，說明此時細胞已受到嚴重傷害.幾個廣玉蘭品種的半致死溫度最高為-18.86 ℃，最低可達-22.56 ℃.李杰等[4]研究了低溫脅迫對廣玉蘭生理特性的影響，在人工低溫脅迫條件下，探討廣玉蘭細胞質(zhì)膜相對透性[5]、SOD活性[6]和可溶性糖含量[7]動態(tài)變化規(guī)律得出結(jié)論：廣玉蘭細胞質(zhì)膜相對透性隨溫度下降而呈“S”型曲線變化，與溫度成負相關(guān)，不同溫度處理下SOD活性變化呈雙峰曲線，且與溫度呈正相關(guān)；可溶性糖含量呈先升高后下降的變化趨勢.

對廣玉蘭的雜交后代和變種的研究較少，本研究以4年生新品種‘碧翠’和4年生‘埃克斯茅斯’(園林綠化中普遍使用的廣玉蘭品種)為試驗材料，研究在人工低溫脅迫過程中植株的抗寒性，旨在了解該品種的抗寒性強弱，便于進一步推廣，同時篩選廣玉蘭的抗寒性評價指標，為廣玉蘭在園林中引種馴化和推廣提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植于中南林業(yè)科技大學校園內(nèi)的四年生‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭(Magnoliagrandiflora‘Exmouth’)和四年生‘碧翠’廣玉蘭(Magnoliagrandiflora‘Bicui’)，選擇長勢和管理良好的植株進行試驗.

‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭葉片深綠色，葉形較窄，葉背面有棕色絨毛.‘碧翠’廣玉蘭葉片顏色翠綠，葉形較寬，葉背面無毛.

1.2 試驗方法

在2017年2月23日進行采樣.從兩植株上隨機采集位于中上部的當年生側(cè)枝上的第3枚～5枚完整無破損大小相近的成熟葉片，每株采8片(2片備用)，采摘后立即放入密封塑料袋帶回實驗室.將葉片用蒸餾水洗凈再用去離子水清洗，用濾紙擦干凈后分別取兩棵植株的6片葉片，放入6個潔凈的密封袋中，共12片葉片.把裝袋的葉片放置低溫恒溫槽中，試驗設(shè)6個溫度梯度，分別為：5 ℃(常溫)、0 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-15 ℃、-20 ℃，每個梯度均處理2 h，之后將材料取出放入冰箱解凍，次日測定各材料的生理生化指標，將每組平均分成3份，重復3次，測得結(jié)果求平均值.

采用電導儀測定法測定相對電導率，儀器為雷磁DJS-1D電導儀；采用酸性茚三酮法進行游離脯氨酸含量測定；采用硫代巴比妥酸比色法進行丙二醛含量測定；采用考馬斯亮藍G-250染色法進行可溶性蛋白含量測定；采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010及SPSS 18.0軟件處理，對各項指標進行方差分析和相關(guān)性分析，采用Logistic擬合求得半致死溫度，應用模糊隸屬函數(shù)對‘碧翠’廣玉蘭和‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭進行抗寒性綜合評價.將每個品種各階段各指標的隸屬函數(shù)值相加求平均值，隸屬函數(shù)均值越大的品種抗寒性越強.

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對相對電導率的影響

葉片受低溫脅迫，由于細胞膜受到破壞致使胞內(nèi)物質(zhì)外滲，溫度的降低會使外滲物質(zhì)增多，相對電導率(REC)便會逐漸增大，隨著人工低溫脅迫的加強，兩個廣玉蘭品種的離體葉片REC不斷增大，與低溫脅迫程度呈負相關(guān).在不同的溫度段，REC增加的程度不同，從兩個品種的REC變化曲線可以看出，當溫度不斷降低達到臨界值時，REC的變化趨勢由緩慢上升變?yōu)榧眲∩仙?，不同品種的這個臨界值會有所不同，由圖1可知，‘碧翠’的臨界值在0 ℃～-5 ℃之間，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的臨界值在-5 ℃～-10 ℃之間，‘埃克斯茅斯’廣玉蘭細胞膜通透性發(fā)生大幅度變化的臨界溫度低于‘碧翠’廣玉蘭.

圖1 低溫脅迫對相對電導率的影響Fig.1 Effect of low temperature stress on REC

兩個廣玉蘭品種的的REC擬合的Logistic方程，均達到極顯著水平.得到‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的半致死溫度為-4.28 ℃，‘碧翠’廣玉蘭的半致死溫度為-3.03 ℃(表1).

表1 相對電導率的Logistic方程參數(shù)值及半致死

e自然對數(shù)的底數(shù)約等于2.71828

2.2 低溫脅迫對MDA含量影響

由圖2可知，低溫脅迫下，兩個品種MDA含量變化趨勢相同，均隨溫度下降而增加，與低溫脅迫呈極顯著負相關(guān).‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的MDA含量高于‘碧翠’廣玉蘭.兩者在-10 ℃～-15 ℃之間增加較多，在-20 ℃時MDA含量達到最大值，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭為24.63 umol/g FW，‘碧翠’廣玉蘭為22.83 umol/g FW.

圖2 低溫脅迫對MDA含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on MDA content

2.3 低溫脅迫對游離脯氨酸含量影響

通常植物體內(nèi)游離脯氨酸(Pro)含量不高，當植物受到脅迫時，Pro含量會迅速增加，該指標可以反映植物受低溫傷害程度及對低溫的承受能力.從圖3可以看出，兩個廣玉蘭品種的Pro含量隨著溫度的降低呈先升后降的趨勢，但積累的量與積累速率有差異.不同溫度下兩個廣玉蘭品種的Pro含量存在明顯差異，‘埃克斯茅斯’廣玉蘭明顯高于‘碧翠’廣玉蘭.兩種廣玉蘭的Pro含量均在-5 ℃時達到最大值，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭為152.90 ug/g FW，‘碧翠’廣玉蘭為150.29 ug/g FW.

圖3 低溫脅迫對游離脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on free proline content

2.4 低溫脅迫對可溶性蛋白含量影響

可溶性蛋白(SP)具有較強的親水性，能夠增強細胞的保水能力，從而提高植物的抗寒性.由圖4可知，隨著溫度的降低，兩個廣玉蘭品種的SP含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，SP含量整體與低溫脅迫溫度呈極顯著正相關(guān)，均在-5 ℃達到最大值，且在溫度低于-5 ℃時兩個品種的SP含量差異顯著，‘碧翠’廣玉蘭的下降幅度和速率大于‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭.因此，在低溫環(huán)境下‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭的SP含量高于‘碧翠’廣玉蘭，其保水能力及抗寒性更強.

圖4 低溫脅迫對可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on soluble protein content

2.5 低溫脅迫對POD、SOD活性影響

在植物受到低溫脅迫時，體內(nèi)的活性氧和自由基會積累，會導致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，而POD和SOD可以有效清除細胞內(nèi)的這些有害物質(zhì)，避免植物受到傷害.由圖5可知，隨著溫度降低，兩個廣玉蘭品種的SOD活性差異較大，變化趨勢基本相同，但酶活性達到最大值的溫度不同.隨著溫度降低‘埃克斯茅斯’廣玉蘭的SOD活性逐漸增大，-15 ℃時達到最大值；隨著溫度降低，‘碧翠’廣玉蘭的SOD活性逐漸增大，-5 ℃時達到最大值.當溫度在一定范圍內(nèi)小幅度降低時，植物的抗逆性使SOD活性增強，以清除細胞內(nèi)的活性氧和自由基，而過低的溫度會使酶活性降低.

由圖6可知，溫度降低對兩種廣玉蘭POD活性影響不一致.溫度降低‘埃克斯茅斯’廣玉蘭POD活性先降低，-5 ℃時達到最小值，然后增大，-15 ℃達到最大值；溫度降低‘碧翠’廣玉蘭POD活性先升高，-5 ℃時達到最大值，兩個品種無明顯變化規(guī)律.

2.6 兩個廣玉蘭品種抗寒性綜合評價

植物的抗寒機制十分復雜，只用某個指標判斷抗寒性具有片面性，不同的抗寒指標在不同植物上的響應程度也會有一定差異，因此應對多個抗寒指標進行綜合分析才能全面地反映抗寒性.采用模糊數(shù)學的隸屬函數(shù)進行轉(zhuǎn)換，將兩個品種各梯度的隸屬函數(shù)值相加求均值，均值越大，品種的抗寒性就越強[8-10].由表2可知，‘埃克斯茅斯’廣玉蘭各隸屬函數(shù)均值大于‘碧翠’廣玉蘭，‘?？怂姑┧埂瘡V玉蘭抗寒性大于‘碧翠’廣玉蘭.

圖5 低溫脅迫對SOD活性的影響Fig.5 Effect of low temperature stress on SOD activity

圖6 低溫脅迫對POD活性的影響Fig.6 Effect of low temperature stress on POD activity

表2 兩個廣玉蘭品種抗寒性評價

3 討論

由于自然環(huán)境中有極端天氣等不可控因素，同一物種栽培于不同地理區(qū)域時，其低溫半致死溫度也會有所改變.同時，不同試驗條件下測出的低溫半致死溫度也有一定差別.所以，低溫半致死溫度應是一個相對的概念，它只能夠用于衡量幾個種之間的相對抗寒性強弱，而不能直接用來指導植物栽培.

陳潔等[11]對幾種含笑屬植物抗寒生理指標篩選進行研究，認為REC、MDA和SP等三個指標能夠反映出含笑屬植物抗寒性.本研究認為廣玉蘭的抗寒生理指標是REC和SP，相比之下少了MDA指標.含笑屬抗寒指標篩選研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下MDA含量與抗寒性呈正相關(guān)[11]，但本研究認為低溫脅迫下兩個廣玉蘭品種的MDA含量的增加無明顯差別，因此，MDA不能作為廣玉蘭品種抗寒性的生理指標.MDA是由于植物細胞受到傷害后應激反應的產(chǎn)物，傷害越大MDA含量越高，MDA含量越高植物抗寒性越弱[8，9].但有些研究結(jié)果卻相反，MDA含量與其抗寒性強弱呈正比，本研究的結(jié)果也是MDA含量高的品種抗寒性更強.MDA含量作為植物抗寒性生理指標以及對木蘭科植物的抗寒性作用機理還有待進一步研究.

4 結(jié)論

兩個廣玉蘭品種的抗寒能力存在差異，‘埃克斯茅斯’廣玉蘭半致死溫度低于‘碧翠’廣玉蘭.對6個生理生化指標進行綜合評價，REC、SP兩個生理生化指標是反應抗寒性強弱的較佳指標.