張 穎，白 晶，呂 振，瞿志杰，李美麗，徐 濤，李 莉△

（1.哈爾濱商業(yè)大學藥學院·藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱150076；2.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾161006）

玉竹是百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根莖，藥食同源[1]，富含20余種高異黃酮成分[2-11]，其中4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ含量相對較高，且具有較強的生物活性。高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ均具有較強的抑菌活性[12]，高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ對蛋白質(zhì)非酶糖基化半數(shù)抑制量（IC50）分別為107.10，46.05，56.30 μmol/L[13]，高異黃烷酮Ⅲ，Ⅳ對人白血病細胞（K562）、人肺癌細胞（A549）、人結(jié)腸癌細胞（HCT-15）的IC50分別為6.5，20.8，8.5 μg/mL和26.2，25.2，15.3 μg/mL[14]。2015年版《中國藥典（一部）》中玉竹中藥效物質(zhì)的檢測方法僅有多糖總量不低于6.0%與醇提物總量不低于50.0%，未對高異黃烷酮成分進行質(zhì)量控制[15]，不能全面反映玉竹質(zhì)量。本研究中建立了玉竹中4種高異黃烷酮活性成分的薄層色譜（TLC）鑒別方法，旨在進一步控制其質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

C18-H固相萃取柱（4 000 mg/20 mL，BESEP，Germany）；GF254鋁制薄層板（10 cm×10 cm，10 cm×11 cm，Merck KGaA Darmstadt，Germany）；XS3DU型電子分析天平（Mettler Toledo公司，精度為0.000 001 g）；SC-5型紫外分析儀（北京金劍之光醫(yī)藥信息技術(shù)中心）；雙槽層析缸（120 mm×115 mm×5 mm，上海鼎杰生物科技有限公司）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；微量進樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司，10 μL）；定量毛細管（杭州馳成醫(yī)藥科技有限公司，10 μL）。

1.2 試藥

二氯甲烷、甲醇、甲酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為市售分析純；高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品[自制，經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）法和核磁共振波譜法（NMR）鑒定，純度均大于98.0%]；20批玉竹（按2015年版《中國藥典（一部）》檢驗均符合規(guī)定）來源見表1，其中編號1～15為飲片、16～20為藥材。

表1 不同批次玉竹的基本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對照品溶液：分別取4種高異黃烷酮對照品Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ適量，精密稱定，分別用甲醇配制成0.4 mg/mL的溶液，置棕色瓶中，密閉，即得。

供試品溶液：取干燥玉竹粗粉約3.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加乙醇14 mL，浸泡15 h，水?。?0℃）加熱回流2 h，取上清液，如上重復提取1次，合并2次上清液，趁熱抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水?。?8℃）蒸干，加入7 mL水，振搖，得渾濁液，轉(zhuǎn)移至C18-H固相萃取柱中，將水溶液濾凈，再用7 mL水洗脫，棄去水溶液；用10 mL甲醇緩緩洗脫上述C18-H固相萃取柱，將洗脫液置蒸發(fā)皿中，水?。?8℃）蒸至約1 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL棕色瓶中，用氮氣吹干，再用100 μL甲醇定容，密閉。

陽性樣品溶液：以玉竹S1和S6[采用超高效液相色譜（UPLC）法檢測，高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量大于40 μg/g，高異黃烷酮Ⅰ及Ⅴ的含量大于6 μg/g]作為陽性樣品或?qū)φ账幉摹７謩e取其粗粉約3.3 g，按供試品溶液制備方法制得。

陰性樣品溶液：以玉竹S16（采用UPLC檢測，高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量低于3 μg，高異黃烷酮Ⅰ及Ⅴ的含量低于0.6 μg/g）作為陰性樣品。取其粗粉約3.3 g，按供試品溶液制備方法制得。

模擬陽性樣品溶液：取陰性樣品粗粉約3.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入高異黃烷酮Ⅲ90 μg，高異黃烷酮Ⅳ80 μg，高異黃烷酮Ⅴ24 μg，高異黃烷酮Ⅰ8 μg，作為模擬陽性樣品。按供試品溶液制備方法制得。

2.2 薄層色譜法建立

2.2.1 色譜條件選擇

4種高異黃烷酮化學結(jié)構(gòu)（圖1）相近，極性差異小，主要區(qū)別在于8位與4′取代基是甲基、甲氧基還是羥基，故在同一色譜條件下，很難將4個化合物有效分離。

圖14 種高異黃烷酮化學結(jié)構(gòu)式

采用GF254薄層板，以三氯化鐵試液顯色，分別考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-甲醇-甲酸、石油醚-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯-甲酸5個非極性及弱極性展開系統(tǒng)的TLC。結(jié)果顯示，石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）對4種高異黃烷酮的分離效果最佳，但無法有效分離高異黃烷酮Ⅳ及Ⅴ。詳見圖2A。

采用GF254薄層板，以254 nm波長檢視，分別考察了二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇-甲酸、二氯甲烷-甲醇-水3個中等極性展開系統(tǒng)的TLC。結(jié)果顯示，二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）對4種高異黃烷酮的分離效果最佳，但無法有效分離高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ。見圖2 B。

2.2.2 二次層析薄層色譜法

分別取4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品溶液、對照藥材與供試品溶液各10 μL，點于同一GF254薄層板上，置含有10 mL二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）的層析缸中，飽和，層析，取出，晾干，于254 nm或365 nm波長處檢視與定位（通常高異黃烷酮Ⅲ，Ⅳ不能有效分離），在對照品高異黃烷酮Ⅴ與高異黃烷酮Ⅳ間畫一條平行于底邊的直線，沿此線將該TLC板剪裁成兩部分。立即將下半部分用三氯化鐵試液噴霧，并用濾紙將水吸干，對照藥材、供試品溶液主斑點的位置及顏色均應與高異黃烷酮Ⅴ對照品主斑點相同；將上半部分用6 mL石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）二次層析，立即用三氯化鐵試液檢視，對照藥材、供試樣品主斑點的位置及顏色均應分別與高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ對照品主斑點相同。

圖2 薄層色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 陰性樣品干擾試驗

分別取4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品、陽性樣品、模擬陽性樣品與陰性樣品溶液，各10 μL，點于同一GF254薄層板上，按2.2.2項下方法操作。結(jié)果見圖3。陽性樣品、模擬陽性樣品主斑點的位置、顏色分別與4種對照品的主斑點相同，而陰性樣品無相應斑點，說明玉竹中其他成分對高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ檢測結(jié)果無干擾，方法有較強的專屬性。

圖3 陰性樣品對4種高異黃烷酮薄層色譜的干擾試驗

2.3.2 檢測限（LOD）考察

分別量取0.7，1.3，2.5，5.0，10.0 μL高異黃烷酮Ⅰ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅴ對照品溶液（相當于高異黃烷酮0.3，0.5，1.0，2.0，4.0 μg），依次點于同一塊GF254薄層板上，按2.2.2項下方法操作，高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ的展開劑為二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V），高異黃烷酮Ⅴ的展開劑為石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V），依次在254nm和365 nm波長處與三氯化鐵試液顯色項下檢視，結(jié)果見表2與圖4。三氯化鐵試液檢視的靈敏度較高，高異黃烷酮Ⅰ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅴ的LOD分別為2.0，2.0，1.0，1.0 μg。

表2 不同檢視方法下4種高異黃烷酮TLC的LOD（μg）

圖44 種高異黃烷酮薄層色譜的檢測限

2.3.3 穩(wěn)定性考察

供試品溶液：分別取4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品與供試品溶液適量，置1.5 mL加蓋棕色瓶中，放置0，1，2，4，8，24 h后，按2.2.2項下方法操作，依次在254 nm和365 nm波長處與三氯化鐵試液顯色項下檢視，結(jié)果6個時間點的TLC主斑點無顯著差異，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

TLC三氯化鐵試液顯色：按2.2.2項下方法操作，分別取4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品溶液，點于同一GF254薄層板上，在365 nm波長下檢視。在室溫下，1 h后Ⅲ，Ⅴ主斑點的顏色與面積逐漸變淡、變小，高異黃烷酮Ⅰ，Ⅳ24 h內(nèi)未變，詳見圖5 A；在加熱（80℃）條件下，10 min后高異黃烷酮Ⅲ，Ⅴ主斑點的顏色與面積逐漸變淡、變小，高異黃烷酮Ⅰ，Ⅳ60 min內(nèi)未變，詳見圖5 B。可見，高異黃烷酮Ⅲ，Ⅴ在空氣中的穩(wěn)定性較差，且加熱可加速其氧化變質(zhì)。按2.2.2項下方法操作，將4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ對照品和供試品溶液的TLC用三氯化鐵顯色后，觀察室溫下0，1，2，4，8，24h時的變化，24 h內(nèi)主斑點的顏色與大小無顯著差異，表明顯色后的成分較穩(wěn)定。

可見，4種高異黃烷酮溶液及其TLC三氯化鐵試液顯色后均較穩(wěn)定，但TLC主斑點顯色前不穩(wěn)定，特別是高異黃烷酮Ⅲ，Ⅴ在加熱條件下極不穩(wěn)定，可能源于高異黃烷酮Ⅲ，Ⅴ結(jié)構(gòu)中8位含有游離的酚羥基（見圖1），在空氣中極易被氧化。建議2.2.2項下層析后采用自然晾干，并立即用三氯化鐵試液顯色，可有效避免假陰性現(xiàn)象。

圖5 不同條件下4種高異黃烷酮薄層色譜圖（365 nm）

2.4 樣品檢測

將4種高異黃烷酮對照品Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和20批玉竹樣品（S6為對照藥材）溶液按序號依次點于同一GF254薄層板上，按2.2.2項下方法操作，結(jié)果見圖6與表3?？梢姡?批玉竹（S1～S4，S6）檢出高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，8批玉竹（S5，S7～S10，S12～S14）僅檢出高異黃烷酮Ⅲ，Ⅳ，7批玉竹（S11，S15～S20）未檢出高異黃烷酮。

圖6 二次層析薄層色譜法鑒別玉竹中4種高異黃烷酮（藍底-365 nm；灰底-三氯化鐵顯色）

表320 批玉竹中高異黃烷酮檢測結(jié)果

圖720 批玉竹中4種高異黃烷酮的檢出情況

2.5 不同產(chǎn)地玉竹質(zhì)量差異

按表3將玉竹中高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ檢測結(jié)果進行歸類分析，結(jié)果見圖7。可見，20批玉竹中檢出高異黃烷酮Ⅲ，Ⅳ的共13批，其中5批均檢出高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，8批檢出高異黃烷酮Ⅲ，Ⅳ。此外，還有7批玉竹中均未檢出高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。說明不同產(chǎn)地玉竹中高異黃烷酮存在顯著差異。

3 討論

3.1 樣品提取條件選擇

取同一批玉竹，按2.1.2項下方法操作，分別將不同條件下獲得的玉竹提取液用UPLC及TLC檢測。結(jié)果，分別用粗粉與碎塊2種形態(tài)進行提取，前者提取效率較高；分別以70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、甲醇作為提取溶劑[16]，除前2種提取效率較低外，其他提取效率相近，因95%乙醇無害、價廉，故以此作為本研究中的提取溶劑；分別采用超聲與回流提取，后者提取效率更高[17]；分別采用水沉后離心過濾與水沉后用C18-H固相萃取柱處理作為純化手段，后者TLC對主斑點干擾小。

3.2 薄層色譜展開方式選擇

由4種高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的TLC圖譜可見，在石油醚-乙酸乙酯（3∶2，V/V）中高異黃烷酮Ⅳ，Ⅴ未分離，僅能鑒別高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ；而在二氯甲烷-甲醇-甲酸（150∶5∶3，V/V/V）中，Ⅲ，Ⅳ不能分離，僅能鑒別高異黃烷酮Ⅰ，Ⅴ。由2.2.2項下可見，通過將上述2種展開方式整合，剪掉首次層析后TLC中Rf值最低的主斑點（Ⅴ），對混合物斑點（Ⅲ，Ⅳ）進行二次層析，可實現(xiàn)在同一薄層板上有效分離4種高異黃烷酮成分。

3.3 不同產(chǎn)地玉竹質(zhì)量分析

20批玉竹中有7批未檢出高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。根據(jù)TLC點樣量、LOD及供試品溶液取樣量進行推算，每1 g玉竹中高異黃烷酮Ⅰ及Ⅲ的含量低于6 μg，高異黃烷酮Ⅳ及Ⅴ的含量低于3 μg時，即不能用本研究中的方法檢出。故該方法實質(zhì)是對4種高異黃烷酮進行限量控制的基本方法，可對不同產(chǎn)地玉竹質(zhì)量進行初步評價。20批玉竹中，13批檢出高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ。該成分不僅具有抗癌活性，且在TLC中斑點顏色明顯深于高異黃烷酮Ⅰ及Ⅴ；經(jīng)UPLC驗證，高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ的含量是高異黃烷酮Ⅰ及Ⅴ的3～5倍，現(xiàn)有玉竹質(zhì)量標準可增設(shè)Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的TLC鑒別與Ⅲ及Ⅳ的含量測定方法。

綜上所述，本研究中依據(jù)2015年版《中國藥典（一部）》，分別對20批市售玉竹進行了檢驗，其靈敏度、專屬性強，結(jié)果均符合規(guī)定，但7批未檢出高異黃烷酮Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的玉竹中多糖含量明顯高于13批檢出高異黃烷酮Ⅲ及Ⅳ的玉竹。這種成分差異很可能會導致不同產(chǎn)地玉竹的療效與保健功能的不同，希望能引起關(guān)注，進一步研究不同產(chǎn)地玉竹藥理作用與保健功能的異同。