王敬博，盧萍，梁珍，郭瑩，張振，張俊杰

(河南省人民醫(yī)院/河南省眼科研究所/河南大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

近年來，固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)作為一種眼用藥物載體引起了人們極大的興趣，其在藥物傳遞，特別是在藥物釋放控制和靶向特定組織方面具有巨大的應(yīng)用潛力[1]。伊曲康唑(itraconazole，ITZ)是一種唑類抗真菌藥物，臨床上廣泛用于治療各種嚴重的真菌感染，包括曲霉病、隱球菌病、念珠菌病、囊胚菌病、播散性青霉病、莢膜組織漿菌病等[2]。ITZ通過抑制細胞色素P450氧化酶介導(dǎo)的麥角甾醇的合成而起作用[3]。目前市售的伊曲康唑主要是全身應(yīng)用的劑型，包括膠囊劑、口服液和注射液，全身用藥難以在角膜中取得有效的抗真菌藥物濃度，且治療真菌容易造成較嚴重的肝腎毒性。因此，本實驗嘗試制備局部滴眼液來達到治療目的。

1 材料與方法

1.1 儀器Nano ZS-90型納米粒度儀(英國馬爾文公司)；2695型高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography，HPLC)系統(tǒng)(美國Waters公司)；TS-100C恒溫振蕩器(匡貝實業(yè)有限公司，中國)；梅特勒AE260電子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；ZNCL-BS磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；Eppendorf高速離心機(Abbott公司，德國)；Eppendorf 5810R低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.2 試劑伊曲康唑(上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)；Precirol ATO5(源葉生物)；甘油(南昌白云藥業(yè)有限公司)；Kolliphor@HS 15(德國巴斯夫公司)；Capryol 90(源葉生物)；植物凝膠(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號J0212A)；二氯甲烷(美國Tedia公司)；吐溫80、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲醇(美國Tedia公司，批號15065035，HPLC級)。

1.3 實驗方法

1.3.1納米粒的制備 采用微乳法及低溫固化法，精密稱取處方量的伊曲康唑原料藥加入1 mL的二氯甲烷溶解，精密稱取處方量的Capryol 90，Precirol ATO5，70 ℃水浴使其溶解，作為油相，將二氯甲烷溶解后的藥物加入油相中，70 ℃水浴10 min使二氯甲烷完全揮發(fā)。另取處方量的Kolliphor@HS 15、甘油于油相中，70 ℃水浴使其混合均勻，加入約20 mL同溫純化水，持續(xù)攪拌5 min，然后加入20 mL質(zhì)量分數(shù)為8 g·L-1的植物凝膠溶液，冰水浴中持續(xù)攪拌30 min，加水定容至50 mL，即得無色透明ITZ-SLN溶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.2ITZ-SLN含量方法的建立 (1)色譜條件。色譜柱：Waters X-Bridge C18(150 mm×3.0 mm，3.5 μm)。流動相：V純水∶V甲醇=20∶80。流速：0.4 mL·min-1。柱溫：40 ℃。進樣量：10 μL。檢測波長：262 nm。(2)標準曲線的建立。取伊曲康唑?qū)φ掌?，精密稱取5 mg，甲醇溶解，用甲醇定容至50 mL量瓶中，得伊曲康唑儲備液100 μg·mL-1。精密量取伊曲康唑儲備液0.8 mL，加入3.2 mL甲醇，配制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1對照品溶液，依次倍比稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1伊曲康唑?qū)φ掌啡芤海咝б合喾y峰面積，以峰面積A對濃度C進行回歸，得到標準曲線方程為：A=77 143C-2 405.4(R2=0.999 9，n=5)，表明伊曲康唑在0.625～10 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。

1.3.3精密度 精密量取適量伊曲康唑儲備液，用甲醇配制低、中、高(5、2.5、1.25 μg·mL-1)3個濃度的標準液，按“1.3.2”項下色譜條件，1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，計算日內(nèi)精密度。同法取3種濃度的樣品，連續(xù)測5 d，計算日間精密度。

1.3.4回收率試驗 精密量取適量濃儲備液，用甲醇配制成8、10、12 μg·mL-1(低、中、高)3種濃度的伊曲康唑溶液，加入適量(200 μL)空白脂質(zhì)納米粒，按“1.3.2”色譜條件進樣，每種濃度平行操作3次，計算平均回收率。

1.3.5包封率和載藥量 采用超濾離心法，精密量取ITZ-SLN 4 mL于超濾管套管(分子量為10 000)中，以4 000 r·min-1離心30 min，取濾液。按“1.3.2”項下色譜條件測面積，代入回歸方程，計算游離藥物濃度(Cfree)。精密量取ITZ-SLN 1 mL，加適量甲醇破乳，取破乳后溶液，用甲醇稀釋一定倍數(shù)，按“1.3.2”項下色譜條件測面積，代入回歸方程，計算總藥物濃度(Ctotal)。包封率(EE%)及載藥量(DL%)按下列公式計算：EE% =(Ctotal-Cfree)/Ctotal×100%；DL%=(Ctotal-Cfree)/M×100%。式中Ctotal為納米粒中總藥物濃度，Cfree為游離藥物含量，M為納米粒中脂質(zhì)的質(zhì)量。

1.3.6粒徑與電位 取適量樣品稀釋后，采用馬爾文激光粒度儀(英國馬爾文公司)測定納米粒的Zeta電位與粒度分布。

1.4 體外釋放的考察

1.4.1介質(zhì)的選擇 在人工淚液中加入20 g·L-1吐溫-80，制成20 g·L-1吐溫80-AFT溶液混合液，精密量取20 mL該混合液于玻璃瓶中，精密稱量0.020 0 g 伊曲康唑原料藥于該玻璃瓶中，恒溫震蕩過夜，取2 mL樣品4 000 r·min-1離心，取上清，HPLC法測濃度，計算溶解度約為12.51 μg·mL-1，可滿足漏槽條件。在人工淚液中加入20 g·L-1的SDS制成20 g·L-1的SDS-AFT溶液，精密量取20 mL于玻璃瓶中，精密稱量0.020 0 g伊曲康唑原料藥于該玻璃瓶中，恒溫震蕩過夜，取2 mL樣品4 000 r·min-1離心，取上清，稀釋10倍后HPLC法測濃度，計算溶解度約為80 μg·mL-1，可滿足漏槽條件。上述兩種介質(zhì)可供選擇。

1.4.2方法的選擇 (1)動態(tài)透析法。取2 mL ITZ-SLN于透析袋中，透析袋放入玻璃釋放瓶中加入150 mL含有20 g·L-1吐溫80-AFT的混合液，將玻璃釋放瓶放入恒溫振蕩器中，37 ℃輕微震蕩。分別于不同時間點(0、30、60、120、360、720、1 440 min)從釋放瓶中取出釋放液2 mL，同時補充新鮮介質(zhì)2 mL，用HPLC-UV檢測其含量。(2)新動態(tài)透析法。取2 mL ITZ-SLN于透析袋中，透析袋放入玻璃釋放瓶中，加入150 mL含有20 g·L-1吐溫80-AFT的混合液，將玻璃釋放瓶放入恒溫振蕩器中，37 ℃輕微震蕩。分別于不同時間點(0、30、60、120、360、720、1 440 min)從釋放瓶中取出釋放液2 mL，同時將介質(zhì)倒掉，換上新鮮介質(zhì)150 mL，用HPLC-UV檢測其含量。(3)直接擴散法[4-6]。精密量取20 μL ITZ-SLN于1 mL EP管中，加入480 μL人工淚液，放入恒溫震蕩器中，37 ℃輕微震蕩。分別于不同時間點(30、60、120、360、720、1 440 min)取出對應(yīng)的EP管，3 000 r·min-1離心5 min，取沉淀，加500 μL甲醇溶解，用HPLC-UV檢測沉淀中藥物的含量。(4)擴散-超濾離心法[7]。取新鮮配制的質(zhì)量濃度為20 g·L-1的SDS-ATF 50 mL作為釋放液置于30 mL的玻璃釋放瓶中。取2 mL質(zhì)量濃度為1 g·L-1的ITZ-SLN制劑處方于上述玻璃釋放瓶中，每個處方平行制備3份，置于TS-100C恒溫振蕩器中，37 ℃，120 r·min-1恒溫振蕩，分別于30、60、120、360、720、1 440 min后從釋放瓶內(nèi)取出釋放液2 mL，加入分子量為10 000的超濾管中，4 000 r·min-1離心5 min，取濾液，用HPLC-UV檢測，同時在釋放瓶中補加37 ℃等體積的空白釋放液，每組平行做3份，采用“1.3.2”項下的色譜條件測面積。

2 結(jié)果

2.1 精密度日內(nèi)精密度RSD分別為0.56%、0.48%、0.74%(n=5)，日間精密度RSD分別為0.60%、1.47%、0.68%(n=5)，證明方法準確度良好，符合方法學(xué)要求。

2.2 回收率3種質(zhì)量濃度的回收率分別為(99.47±0.71)%、(98.53±0.77)%、(99.57±0.94)%，RSD分別為0.88%、0.96%、1.16%，RSD均小于2%，符合藥典要求。

2.3 包封率和載藥量按“1.3.1”制備工藝同時制備5份ITZ-SLN測得包封率及載藥量分別為(96.02±2.10)%、(0.15±0.02)%。

2.4 粒徑與電位其粒徑與電位分別為(15.23±2.10)nm、(-22.65±0.91)mV。

2.5 體外釋放4種檢測體外釋放的方法中，只有擴散-超濾離心法可檢測到釋放藥物含量，ITZ-SLN在30、60、120、360、720、1 440 min分別釋放了8.04%、17.70%、29.9%、60.70%、65.30%、71.78%。計算各個時間點累計釋放量，并對時間作圖，釋放曲線見圖1。

圖1 伊曲康唑固體脂質(zhì)納米粒(ITZ-SLN)

體外釋放擬合方程：對上述體外釋放曲線使用Origin Pro 8.0軟件進行動力學(xué)模型擬合[8-10]，如零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程，詳見表1。

表1 不同方程擬合伊曲康唑固體脂質(zhì)納米粒(ITZ-SLN)的 體外釋放度(n=3)

通過比較不同公式的零級、一級、Higuchi模型的相關(guān)系數(shù)(R2)，發(fā)現(xiàn)該釋放的最佳擬合模型為一級動力學(xué)方程。

3 討論

SLN是一種新型膠體給藥系統(tǒng)[11]，具有良好的生理相容性，且具有緩釋、控釋的特性，可提高藥物的生物利用度，適用于包裹親脂性藥物[12]，其作為眼部給藥的載體，安全性高。而伊曲康唑為極難溶于水的脂溶性藥物，因此ITZ-SLN是一種理想制劑。目前SLN的制備工藝方法主要有微乳法、高壓勻質(zhì)法、溶劑擴散法、低溫固化法和薄膜超聲分散法[13]。與其他需要額外能量輸入的技術(shù)相比，微乳法簡單，省時，易于應(yīng)用[14]，且具有實驗條件溫和，易于得到較小粒徑(10～100 nm)納米粒的優(yōu)點。因伊曲康唑在Precirol ATO5[15]、Capryol 90[16]中溶解度較高，所以本實驗將選擇這兩種脂質(zhì)作為油相，采用微乳法及低溫固化法制備的3批ITZ-SLN，其粒徑約為15.23 nm，分布均勻，表明制備工藝穩(wěn)定。Zeta電位約為-22.65 mV，帶有負電荷，屬于熱力學(xué)穩(wěn)定體系。其含量測定采用反HPLC法，具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點，測得該處方的包封率為(96.02±2.10)%，較高，但是載藥量僅為(0.15±0.02)%，所以需要進一步優(yōu)化，以得到較高載藥量的處方。

體外釋放的考察，本實驗采用混合介質(zhì)作為釋放介質(zhì)，因為伊曲康唑極難溶于水，常規(guī)的人工淚液作為釋放介質(zhì)很難滿足漏槽條件。采用透析法考察伊曲康唑固體脂質(zhì)納米的體外釋放，并未檢測到藥物釋放含量，考慮其原因可能為介質(zhì)中吐溫-80和SDS的含量超過了臨界膠束，使其形成了膠束溶液，而膠束難以從透析袋中釋放出來。采用直接擴散法未檢測到藥物含量的可能原因有待于進一步探討。擴散-超濾離心法未經(jīng)過透析袋，藥物緩慢釋放后在釋放液中形成新的膠束溶液，經(jīng)超濾管過濾掉未釋放的藥物，檢測濾液中的藥物含量即為所釋放的含量，此方法可適用于難溶性藥物。體外釋放試驗表明，在最初的3 h內(nèi)，藥物釋放較快，而接下來的24 h，藥物釋放相對較緩慢，這種緩釋作用可以在眼部維持藥物的治療濃度。本實驗嘗試采用此工藝制備的ITZ-SLN達到了預(yù)期的緩釋目的。其后續(xù)的離體角膜滲透及藥物代謝動力學(xué)仍需進一步研究。