劉志凱 喬翔鶴 茍黎明 李春潔

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科，成都 610041；

2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147

分支形態(tài)發(fā)生過程可見于哺乳動物的多種器官發(fā)生及發(fā)育過程中，這一分支形態(tài)的形成對于保證器官可以在有限的體積內(nèi)獲得最有效的功能形態(tài)具有重要意義，這一過程在多種器官（如腎、肺、下頜下腺等）中的具體發(fā)生及發(fā)展過程的研究已取得長足的進(jìn)展[1-3]。最初對于這一過程的研究多是利用體內(nèi)各發(fā)育階段的器官進(jìn)行組織切片及免疫組化染色來進(jìn)行觀察，但體外切片染色具有切片難度較大、形態(tài)不易維持等缺點。隨著體外器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，可以利用體外器官培養(yǎng)模型進(jìn)行研究，便于直接地對相應(yīng)器官上皮系統(tǒng)分支形態(tài)發(fā)生的具體過程進(jìn)行連續(xù)地觀察和干預(yù)[4]。

下頜下腺是研究器官分支形態(tài)發(fā)生過程的重要模型，在小鼠胚胎中獲取下頜下腺組織進(jìn)行體外器官培養(yǎng)是一種重要的研究方法。小鼠下頜下腺位于小鼠下頜骨內(nèi)側(cè)稍下方，解剖皮膚及筋膜即可見（如圖1所示）。對妊娠13 d（E13）的小鼠胚胎而言，其唾液腺組織處于發(fā)育初期，始見5～6個初始分支[5]。兩側(cè)腺體位于下頜體與下頜角轉(zhuǎn)折處內(nèi)側(cè)，緊貼于舌根兩側(cè)，表面有下頜皮膚及軟組織覆蓋，因此較難定位及分離。本研究對小鼠胚胎下頜下腺的獲取方法進(jìn)行改良，以有效地定位腺體組織，降低腺體獲取的難度，保證獲取腺體的完整性，為培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)；同時建立小鼠胚胎下頜下腺的體外器官培養(yǎng)模型，以對其在體內(nèi)發(fā)育過程中的分支形態(tài)發(fā)生過程進(jìn)行更好體外的模擬。

圖 1 胚胎下頜下腺解剖位置（舌腹側(cè)）Fig 1 Position of the embryonic submandibular salivarygland (ven- tral tongue side)

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑、器械及設(shè)備

實驗動物為健康清潔級適齡（6周～4月齡）ICR小鼠（雄性∶雌性為1∶2，由成都達(dá)碩實驗動物公司提供）。解剖顯微鏡（Nikon公司，日本），顯微彎鑷，尖端直徑為0.05 mm×0.02 mm的顯微直解剖鑷及尖端直徑為0.05 mm×0.01 mm的顯微直解剖鑷各2個（Dumont公司，瑞士），眼科剪，11號手術(shù)刀片及手術(shù)刀柄，紋式血管鉗4個。滅菌橡膠手套、防護(hù)服、口罩、帽子等。

DMEM/F12培養(yǎng)液，青霉素溶液，鏈霉素溶液，L-抗壞血酸（Sigma公司，美國），小牛轉(zhuǎn)鐵蛋白（北京索萊寶科技有限公司），100 mm普通培養(yǎng)皿及50 mm玻底培養(yǎng)皿若干，Whatman Nuclepore Track-etch Membranes濾膜（直徑13 mm，孔徑0.1 μm，Whatman公司，英國），二氧化碳培養(yǎng)箱，pH試紙或pH計，碳酸氫鈉，其他如移液器、移液器槍頭、容量瓶、量筒、天平等實驗室常用儀器。

1.2 ICR小鼠自然交配獲得小鼠胚胎

給予ICR小鼠恒定的光照—黑暗周期，待ICR小鼠適應(yīng)環(huán)境后（5～7 d），在光照周期結(jié)束前選擇發(fā)情期雌鼠與雄鼠合籠（1只雄鼠與2只雌鼠），第二天上午8:00～9:00檢查陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓者自籠中取出單獨飼養(yǎng)，并將發(fā)現(xiàn)陰道栓的當(dāng)日早晨記為懷孕第0天（E0）。

1.3 獲取小鼠胚胎下頜下腺

1.3.1 制備暫時存放組織用的儲存用培養(yǎng)基 在DMEM/F12液體培養(yǎng)基中，加入青霉素溶液和鏈霉素溶液，使其最終濃度分別達(dá)到100 U·mL-1和100 μg·mL-1，存儲于4 ℃冰箱中。

1.3.2 游離子宮 以頸椎脫位法處死E13的懷孕ICR小鼠，75%乙醇浸泡消毒小鼠胸腹部，在小鼠腹部中線由恥骨聯(lián)合直線剪開皮膚、肌肉及腹膜，暴露腹腔至劍突下方，牽開腹部皮膚及肌肉顯露子宮，以小彎鉗抬起子宮，剪刀剪開并分離子宮系膜游離子宮，在此過程中防止擠壓子宮及胚胎，將游離出的包含胚胎的子宮置于盛有25 mL儲存用培養(yǎng)基的100 mm培養(yǎng)皿中暫存（4 ℃，下同）。

1.3.3 游離胚胎 以顯微直解剖鑷打開子宮壁，并小心將胚胎從子宮分離，此過程中為了防止擠壓損傷下頜下腺，操作時應(yīng)夾持遠(yuǎn)離下頜下腺的組織部分，將游離出的胚胎置于盛有25 mL儲存用培養(yǎng)基的100 mm培養(yǎng)皿中暫存。

1.3.4 獲取胚胎下頜組織（顯微鏡下操作） 將胚胎置于解剖顯微鏡下，調(diào)節(jié)至適當(dāng)放大倍數(shù)，側(cè)向放置胚胎，以直鑷固定胚胎體部，自頸部與頦部之間切下胚胎頭部，再于口裂處舌頭上方自前向后由平行于下頜長軸的方向切下下頜組織（主要包含麥克爾軟骨、舌、下頜下腺、舌下腺、脊髓頸段及少量其他軟組織），將切下的下頜組織置于盛有3 mL儲存用培養(yǎng)基的35 mm培養(yǎng)皿中暫存。

1.3.5 獲取胚胎下頜下腺（顯微鏡下操作） 傳統(tǒng)方法為正中聯(lián)合處向后分離下頜骨，最后留下的組織主要包含舌及下頜下腺。但此方法在旋轉(zhuǎn)分離下頜骨及周圍組織時，極易因組織間粘連使得下頜下腺與下頜組織一同分離，從而不能獲得下頜下腺組織，降低獲取成功率。本研究對此方法進(jìn)行改良（如圖2所示），舌尖指向十二點鐘方向后，頸部皮膚及軟組織失去張力向下頜前部退縮，以頸總動脈斷裂后出血點為定位點，所需要的下頜下腺組織即在定位點正下方，通常鏡下直接可見。首先將下頜下腺周圍軟組織粘連稍作分離，整個操作過程中應(yīng)防止損傷下頜下腺腺體。隨后從下頜下腺外側(cè)離斷下頜骨，兩側(cè)向前旋轉(zhuǎn)分離，在不完全分離下頜骨的前提下即可見游離的下頜下腺。游離后從導(dǎo)管處將腺體銳性分離即可得到下頜下腺組織。這種方法獲取下頜下腺組織的成功率較高，且獲得的腺體更為完整。

圖 2 改良的小鼠胚胎下頜下腺獲取方法（從游離胚胎開始）Fig 2 Improved method for obtaining submandibular gland of embryo (starting from freeing embryo)

1.4 體外培養(yǎng)胚胎下頜下腺

1.4.1 制備培養(yǎng)下頜下腺用的培養(yǎng)用培養(yǎng)基 將儲存用培養(yǎng)基在使用前即時加入L-抗壞血酸和小牛轉(zhuǎn)鐵蛋白，使其最終濃度分別達(dá)到150 μg·mL-1和50 μg·mL-1。

1.4.2 體外培養(yǎng)胚胎下頜下腺 將Whatman濾紙光面朝上，以鑷子夾持將其漂浮于盛有200 μL培養(yǎng)用培養(yǎng)基的50 mm玻底培養(yǎng)皿中；用鉗子將下頜下腺小心置于濾紙上（將腺體置于一滴培養(yǎng)液中，水平張開鑷子然后慢慢合攏，借助液體的表面張力將液體及腺體同時抬起），將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d或根據(jù)實驗內(nèi)容選擇需要培養(yǎng)時長。培養(yǎng)24、48、72 h后，利用配備尼康攝像系統(tǒng)的倒置顯微鏡拍照記錄下頜下腺分支形成情況。

2 結(jié)果

通過小鼠自然交配后懷孕，1只孕鼠可獲得的胚胎數(shù)量不一，多為6～8枚，多者可達(dá)10枚以上，而同一胎中各胚胎發(fā)育程度并不完全一樣。本文通過對胚胎下頜下腺進(jìn)行了體外培養(yǎng)，為保證腺體生長營養(yǎng)供給，1張濾膜上最多放置培養(yǎng)6枚下頜下腺。

獲得的所謂下頜下腺組織其實包含下頜下腺及舌下腺，二者通常難以分開，在玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時在倒置顯微鏡下可以看到舌下腺稍小，上皮芽較少，E13的胚胎中常只有1個上皮芽出現(xiàn)，與下頜下腺緊密相鄰（此時的下頜下腺一般已有3～5個上皮芽）。剛解剖出的下頜下腺放在濾膜上經(jīng)倒置顯微鏡觀察時可見腺體形態(tài)尚未舒展，部分區(qū)域可見上皮芽組織重疊，而培養(yǎng)約2 h后，上皮芽形態(tài)尚未有明顯變化，但腺體形態(tài)鋪展開來，更有利于對其形態(tài)的觀察和對上皮芽進(jìn)行計數(shù)，故本實驗中將解剖出來的腺體經(jīng)濾膜法培養(yǎng)2 h后再行計數(shù)比較。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的下頜下腺上皮分支形態(tài)發(fā)生過程即使在體外培養(yǎng)條件下仍然是十分活躍的。體外培養(yǎng)的下頜下腺可培養(yǎng)至72 h，若繼續(xù)培養(yǎng)上皮芽數(shù)量將繼續(xù)增加，但相互之間的重疊也將進(jìn)一步加重，不利于計數(shù)觀察。大多數(shù)腺體72 h后上皮分支數(shù)量仍會繼續(xù)增加，但未見明顯導(dǎo)管腔隙或腺泡腔形成。E14胚胎或稍更大的胚胎獲得的下頜下腺腺體部分培養(yǎng)72 h后可見導(dǎo)管形成（圖3、4）。在建立體外培養(yǎng)模型的過程中，部分下頜下腺存在形態(tài)溶解的現(xiàn)象，原因可能與培養(yǎng)時攜帶過多血液有關(guān)（如圖3所示）。

3 討論

唾液腺作為維持口腔正常功能的重要器官，其分泌唾液的功能在口腔衛(wèi)生與食物消化方面具有重要作用。唾液腺損傷后的功能恢復(fù)與重建是研究的一個重要方向，而胚胎唾液腺的發(fā)育及其影響因素對下頜下腺功能重建具有積極意義[6-7]。同時，下頜下腺作為一個良好的研究模型是開展相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)[8]。國外相關(guān)的研究在20多年前就已開展[9]，Sakai等[10]在2008年對胚胎相關(guān)的器官的培養(yǎng)進(jìn)行了總結(jié)。國內(nèi)的相關(guān)研究近年來有逐漸開展[11]，但研究仍較少，其中胚胎器官的獲取及培養(yǎng)的困難性是妨礙研究開展的重要因素。

圖 3 培養(yǎng)不同時間的下頜下腺組織情況 倒置顯微鏡 × 40Fig 3 Submandibular gland tissue cultured for different times inverted microscope × 40

圖 4 培養(yǎng)72 h的下頜下腺組織 免疫熒光染色 × 35Fig 4 Submandibular gland tissue cultured after 72 h immuno- fluorescent staining × 35

本文對傳統(tǒng)的胚胎下頜下腺獲取及培養(yǎng)方法進(jìn)行改良，相較于傳統(tǒng)的從下頜前部分離旋轉(zhuǎn)的方法，采用腺體兩側(cè)旋轉(zhuǎn)分離，能夠有效地避免傳統(tǒng)方法中腺體隨頜骨一起被分離，造成不能獲得腺體組織的結(jié)果，從而提高了腺體獲取的成功率和腺體組織的完整性。而在獲取后的培養(yǎng)過程中，通過加入各種發(fā)育相關(guān)影響因子的刺激，可在顯微鏡下直接觀察到腺體發(fā)育情況。與從胚胎獲取組織進(jìn)行切片及免疫組化實驗的方法相比，體外器官培養(yǎng)的方法結(jié)果觀察更為直觀，不易受切片及染色技術(shù)等因素的影響。但此方法不能對特定的分子進(jìn)行定位，有一定的局限性。

E13胚胎下頜下腺一般已有3～5個上皮芽，同一胎中下頜下腺上皮分支最少者可僅出現(xiàn)2～3個上皮芽，處于E12左右的發(fā)展階段。以往研究中常采用E12或E12.5的胚胎獲取下頜下腺，然而實際操作中E12左右的胚胎下頜下腺因組織脆嫩黏稠而解剖困難，故最終本研究采用E13左右的胚胎下頜下腺進(jìn)行實驗。E13胚胎下頜下腺組織培養(yǎng)72 h后少見導(dǎo)管形成（如圖4所示），而E14或孕期更長的胚胎腺體部分培養(yǎng)72 h即可見導(dǎo)管組織，推測原因可能是胚胎在孕鼠體內(nèi)時間更長，下頜下腺導(dǎo)管上皮發(fā)育更為充分，使其在體外能夠生長，具體原因仍待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，部分下頜下腺在培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)了腺體形態(tài)溶解的情況，之前的體外培養(yǎng)研究中未提及此種現(xiàn)象。筆者認(rèn)為出現(xiàn)這種情況的原因，可能是在獲取下頜下腺組織的過程中，攜帶了過多的血液進(jìn)入培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，紅細(xì)胞破裂溶解，其內(nèi)含有的相關(guān)組織溶解酶將腺體基質(zhì)和腺泡溶解，造成腺體形態(tài)破壞消失。因此在獲取下頜下腺的過程中，應(yīng)將獲得的組織與儲存的胚胎分開保存，避免攜帶過多的血液進(jìn)入下頜下腺培養(yǎng)基。

本文介紹了小鼠胚胎下頜下腺的體外器官培養(yǎng)模型的建立過程，改良了目前已有的胚胎下頜下腺獲取方法，使得小鼠胚胎下頜下腺更容易獲?。煌瑫r體外器官培養(yǎng)模型的建立，使得更直接地研究小鼠頜下腺發(fā)育及相關(guān)影響因素成為可能，為之后其他下頜下腺發(fā)育相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。