余麗 劉旭倩 陳雨荷 陳瀟 聶敏海

1.西南醫(yī)科大學口頜面修復重建與再生實驗室，瀘州 646000；

2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，瀘州 646000；

3.北海道大學齒學院口腔病態(tài)學分野口腔診斷內科學教室，日本北海道 060-0808；

4.綿陽市口腔醫(yī)院正畸科，綿陽 621000

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部常見的高侵襲性腫瘤[1]，也是人類的第6大惡性腫瘤，嚴重威脅著患者的生命健康和生存質量。OSCC約占頭頸部腫瘤的95%[2]，占全身腫瘤的2%～4%以上[3]；OSCC患者的5年生存率僅為50%[4-5]。小分子鋅指蛋白（LIM domain only proteins，LMO）[6]是核轉錄家族的共同調節(jié)子，在胚胎發(fā)育過程中調控細胞的增殖分化、組織形成和器官發(fā)育，LMO通過介導蛋白質之間及蛋白質與各種轉錄因子間的相互作用，促進或抑制基因轉錄；LMO可通過調控細胞周期促進腫瘤形成。LMO家族有4個成員[7]，LMO1、LMO2、LMO3、LMO4。LMO1主要由2個呈直線排列富含半胱氨酸的LIM結構域組成，可作為蛋白質相互作用的適配器，結合其他蛋白質形成復合體，破壞其原有結構，通過調控基因轉錄活性、細胞增殖分化促進腫瘤的侵襲轉移[8-9]。李曉燕[10]在LMO1上調食管鱗癌的上皮間充質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的研究中發(fā)現，138例食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中LMO1的陽性表達率分別為86.9%和50.7%，LMO1在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001）。OSCC與食管鱗狀細胞癌同屬于上皮源性腫瘤，LMO1是否會促進口腔黏膜癌變，目前尚無相關研究，蛋白標志物作為腫瘤早期篩查的重要指標，篩選高靈敏度的標志物對腫瘤的研究和治療具有重要意義。因此，本實驗擬對4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline N-oxide，4NQO）飲水法構建的SD大鼠口腔頰黏膜組織的mRNA和蛋白進行檢測，以探究LMO1在OSCC發(fā)展進程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

PageRulerPrestained Protein Ladder、Veriti 96- Well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、高速冷凍離心機、iBright CL1000蛋白印跡智能成像系統(tǒng)（Thermofisher公司，美國），LMO1單克隆抗體（湖北省三鷹生物技術有限公司），磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（北京Abway抗體技術有限公司），LMO1引物、GAPDH引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR?Greenrealtime PCR master mix（TOYOBO公司，日本），DAB試劑盒、PV9000型免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），石蠟包埋機（湖北省亞光醫(yī)用電子技術有限公司）。

1.2 實驗樣本

本實驗動物組織均源于本課題組前期4NQO飲水法鱗狀細胞癌動物模型構建（已獲得西南醫(yī)科大學倫理委員會的同意和認可），建模方法如下。選取SPF級6周齡雄性SD大鼠84只，按照隨機數字表法將SD大鼠均分裝到21個飼養(yǎng)籠中，每3籠為一個小組，共7組。采用自動緩控系統(tǒng)控制燈光，設計晝夜光線明暗度循環(huán)，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，空氣濕度為40%～60%，保證大鼠有充足的飼料（SPF動物專用飼料由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供）和飲水，少量多次飼養(yǎng)大鼠，保證食物供給充足的同時而不至于喂養(yǎng)過度。7組大鼠中，設置1組大鼠為對照組，6組為實驗組，實驗組飲用含質量分數為0.004% 4NQO的SPF級純凈無菌水；對照組飲用SPF級純凈無菌水，其余飼養(yǎng)條件相同。

在飼養(yǎng)的12、14、16、18、20、22周，隨機取1組實驗組大鼠乙醚麻醉后，觀察記錄各處病變組織的肉眼觀，頸椎脫臼處死大鼠，立即將組織凍存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative of nucleotide PCR，RT-qPCR）和Western blot實驗，在實驗的第12、14、16、18、20、22周，采用同樣的方法，每次處死對照組大鼠2只，并獲取各病變區(qū)域的頰黏膜組織，-80 ℃冰箱凍存。

本實驗隨機選取上述7組SD大鼠的頰黏膜組織各7例共計49例用于本實驗研究。

1.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

隨機選取49例課題組前期建模所得組織切片按說明書進行染色，封片，然后分別由2位高年資病理科醫(yī)師讀片確定病理分級，參考2005年WHO分類標準，分為對照組和實驗組，實驗組包括輕度上皮異常增生組（輕度組）、中度上皮異常增生組（中度組）、重度上皮異常增生組（重度組）和OSCC組。

1.4 免疫組織化學染色實驗

將實驗用一抗兔抗鼠LMO1多克隆抗體稀釋為 1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶700共7個濃度梯度進行試驗性染色，結果示1∶400稀釋度下染色鑒別力最佳，因此，本實驗采用1∶400的稀釋度按照SP法進行LMO1染色。采用標記指數半定量分析結果：標記指數=陽性染色強度計分+陽性細胞染色率計分。陽性染色強度計分標準：在光學顯微鏡下，排除邊緣效應和非特異性染色，其中細胞質和細胞核出現棕褐色、棕黃色、黃色記為陽性，無：0分；黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。陽性細胞率：高倍鏡（× 400）下隨機選取5個視野，利用醫(yī)學圖像分析軟件（Image Pro plus）計算著色細胞所占百分比，0分：陽性細胞率＜10%；1分：11%～25%；2分：26%～49%；3分：≥50%。標記指數即為兩者相加總分：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（++）；5～6分為強陽性（+++）；其中≥2分均為陽性表達。

1.5 RT-qPCR實驗

依試劑盒說明提取各樣本的總RNA，逆轉錄為cDNA，LMO1引物序列：F：5’-CTTTCGAGATGGTGATGCG-3’；R：5’-ATCTCTGATTGCAGAGTTGG-3’。GAPDH的引物序列：F：5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’；R：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。每組4個復孔，20 μL體系進行擴增，記錄LMO1和GAPDH的CT值，采用ΔΔCT相對定量法進行計算分析：ΔCT=CT（LMO1基因）-CT（GAPDH基因）；ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組；平均相對含量=2-平均ΔΔCT，即實驗組mRNA相比對照組mRNA的變化倍數。

1.6 Western blot實驗

按蛋白試劑盒說明提取各樣本的蛋白質，測蛋白濃度；以每孔50 mg蛋白作為上樣標準，配膠，上樣，電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，顯影，分析數據。

2 結果

2.1 HE染色結果及病理分級的確定

49例SD大鼠口腔頰黏膜組織通過HE染色，依據組織異常增生的嚴重程度，經2位高年資病理科醫(yī)師讀片確定：對照組7例，輕度組6例，中度組11例，重度組9例，OSCC組16例。

對照組上皮細胞結構完整，排列規(guī)則，層次清晰；輕度組的病變組織主要累及上皮層的l/3，上皮輕度增生，過角化，棘細胞層增厚；中度組的病變組織主要累及上皮層的l/3～2/3，上皮增厚較明顯，基底細胞層數增加，上皮釘突伸長、變寬，部分釘突呈水滴狀，細胞核濃染；重度組的病變組織超過上皮層的2/3，但尚未突破基底膜，上皮顯著增生變厚，細胞核異型性、濃染，上皮釘突呈水滴狀且相互融合；OSCC組主要表現為上皮層次紊亂，棘細胞層成團角化，上皮釘突增大呈滴狀，基底細胞極性消失，核仁增大，核分裂象，細胞異形性明顯，細胞可以突破基底膜到達固有層，固有層出現癌巢（圖1）。

2.2 免疫組織化學染色實驗定性確定LMO1的表達

免疫組織化學染色將LMO1表達的部位染為黃色或棕褐色，LMO1主要表達于細胞質，少量表達于細胞核和細胞膜。LMO1在正?？谇活a黏膜組織中幾乎不表達，因此對照組上皮層無著色。隨著口腔頰黏膜上皮異常增生程度的增加，上皮細胞細胞質逐漸被染色，且隨著上皮異常增生程度的增加，上皮細胞的胞質染色越來越深，說明LMO1的表達量是逐漸增加的。此外，中度組中個別上皮細胞的細胞核核膜染為淡黃色；重度組中細胞質和細胞核核膜被染成棕褐色，細胞核染成淡黃色。而在OSCC組中，上皮細胞的細胞質、細胞核和細胞核核膜均出現棕褐色的強陽性染色反應，特別在腫瘤細胞浸潤區(qū)染色更深（表1，圖2）。

2.3 大鼠頰黏膜中LMO1 mRNA的表達情況

隨著異常增生程度的加重，LMO1 mRNA的表達逐漸增加，在OSCC組中LMO1 mRNA相對表達量最高，采用One-Way ANOVA的統(tǒng)計方法分析發(fā)現，對照組與輕度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。與對照組相比，輕度組的mRNA相對表達量上調1.12倍，中度組上調1.38倍，重度組上調1.53倍，OSCC組上調1.76倍（圖3）。

圖 1 SD大鼠口腔頰黏膜HE染色結果 HE × 200Fig 1 HE staining of the oral buccal mucosa of SD rats HE × 200

表 1 各組LMO1蛋白的陽性表達率Tab 1 The positive expression of LMO1 in the each group

2.4 大鼠頰黏膜中LMO1蛋白的表達情況

對照組和實驗組中均表達LMO1蛋白，隨著上皮異常增生程度的加重，LMO1蛋白的表達量逐漸增加，對照組LMO1表達量最少，OSCC組LMO1蛋白表達量最高。采用One-Way ANOVA的統(tǒng)計方法分析顯示：與對照組相比，實驗組的LMO1表達量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與輕度組相比，中度組、重度組和OSCC組表達均高于輕度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而在中度組、重度組和OSCC組之間LMO1表達無明顯差異（P＞0.05）（圖4）。

3 討論

口腔黏膜癌變過程中常出現組織細胞的侵襲轉移，細胞異形性，上皮細胞可突破基底膜到達固有層并形成癌巢，隨著病程的發(fā)展，癌細胞可能向周圍組織發(fā)生早期轉移[11-13]。本實驗研究口腔頰黏膜從正常發(fā)展為OSCC這一過程中LMO1的表達變化，結果顯示隨著口腔黏膜異常增生程度的增加，LMO1的表達逐漸增加，提示LMO1的表達增加可能促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移，使腫瘤的發(fā)展進程加快。同樣，有研究[14]表明，LMO1可能參與了EMT的調控，LMO1可與堿基序列結合蛋白GATA3結合，通過下調上皮標志物E-鈣黏蛋白、角蛋白等的表達，誘導EMT的發(fā)生，使上皮細胞失去分化特征，細胞極性消失，而波形蛋白等間充質標記物的表達增加；同樣在許多原發(fā)腫瘤局部浸潤的早期，可以檢測到EMT相關基因的表達，LMO1作為蛋白質相互作用的適配器，可能與EMT通道中的特定蛋白質形成復合體，調控相應癌變基因的轉錄過程，誘導細胞的異常增生和異常分化，破壞病變部位的組織結構，加快口腔黏膜癌變的進程，從而在腫瘤的發(fā)生和轉移中發(fā)揮作用。增殖、分化和凋亡是細胞的基本生命活動，在機體內環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，包括分裂間期與分裂期，所有的生命活動過程都伴隨著細胞的更新與凋亡，而在口腔黏膜癌變過程中，細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用，凋亡細胞的增加可以抑制腫瘤細胞的生長，而凋亡細胞的減少則可以促進腫瘤的生長，因此，LMO1可能通過調控病變部位細胞的細胞周期活動促進口腔黏膜癌變，誘導OSCC的發(fā)生。

圖 2 SD大鼠口腔頰黏膜免疫組織化學染色 SP × 400Fig 2 Immunohistochemical staining of the oral buccal mucosa of SD rats SP × 400

圖 3 SD大鼠頰黏膜LMO1 mRNA的相對表達量Fig 3 LMO1 mRNA expression level of buccal mucosa of SD rats

RT-qPCR結果表明，與對照組相比，輕度組、中度組、重度組和OSCC組的mRNA相對表達量分別上調了1.12倍、1.38倍、1.53倍和1.76倍；Western blot實驗中，從對照組到OSCC組，LMO1蛋白的表達量逐漸增加，而在對實驗數據進行兩兩分析時發(fā)現輕度組與對照組間mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣，Western blot檢測結果表明，組間兩兩比較發(fā)現，中度組、重度組和OSCC組間LMO1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。原因可能是組織從正常發(fā)展到OSCC需要先經歷異常增生階段，此過程中機體會出現免疫防御反應，不同大鼠免疫反應強度的不同也有可能導致某些階段LMO1蛋白表達相對減少；同時，4NQO飲水法誘導組織癌變是一連續(xù)的過程，各階段之間過渡的時間較短，病程進展較快，導致在取材時機上把握不夠準確；大鼠之間的個體差異，大鼠間飲水量的差異均有可能對實驗結果造成一定的影響。各實驗結果提示，從正常組織誘導為OSCC這一過程中，LMO1在上皮組織中的表達量是有變化的，且變化是有規(guī)律的。

圖 4 Western blot檢測各組LMO1蛋白的表達Fig 4 Western blot analysis of LMO1 protein expression in the each group

蛋白標志物作為腫瘤早期篩查的重要指標，積極尋找合適的蛋白標志物對OSCC的早期診斷和判斷預后具有重要的指導意義。本實驗在保證了病變模型連續(xù)性的同時保證了實驗的樣本量，結果具有可靠性和指導意義。理論上，為探索口腔黏膜癌變的分子機制提供了新思路，豐富了OSCC蛋白標志物的實驗研究，為阻斷OSCC侵襲轉移的途徑提供了新的理論依據，成果具有應用前景。但是LMO1的表達變化在OSCC發(fā)展進程中的具體作用機制，是否調控EMT進程還尚不明確，這將是后續(xù)進一步研究的方向。

綜上所述，在口腔黏膜癌變模型中，LMO1 mRNA和蛋白異常表達，且mRNA和蛋白表達量與上皮異常增生程度正相關，均隨著異常增生程度的增加而表達增加。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。