梁 翠，高 路，姚 瑞，李亞彭，李鵬程，劉 源，張殿紅，王 錚，張彥周

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

心肌纖維化是冠心病、心肌梗死和心肌病等心臟疾病向心力衰竭進(jìn)展的必然過程[1]。目前認(rèn)為，心肌成纖維細(xì)胞在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]。在各種致病因素作用下，成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，后者發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，表達(dá)平滑肌α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白，還可表達(dá)多種細(xì)胞因子及受體，具有收縮功能[3]。成纖維細(xì)胞大量增殖，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致心肌纖維化。C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(CTRP9)是CTRP家族成員之一[4]，研究[5]表明，CTRP9過表達(dá)可抑制糖尿病大鼠的心肌纖維化。2型糖尿病和冠心病患者血清CTRP9水平明顯升高，且與炎癥水平密切相關(guān)[6]。還有研究[7]發(fā)現(xiàn)，CTRP9可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕心肌缺血/再灌注損傷。過表達(dá)CTRP9可減輕小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[8]。此外，近期研究[9]發(fā)現(xiàn)，人源重組CTRP9可以減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷。上述研究提示CTRP9對心臟有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制仍不清楚。本研究觀察了CTRP9對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞活化、增殖的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料人重組CTRP9購于美國Abcam公司，磷酸化(p-)和總的(T-)mTOR、AMPKa及P70抗體購于美國CST公司，α-SMA抗體購于美國Abcam公司，GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司，AngⅡ購于美國Sigma公司，AMPKa抑制劑復(fù)合物C購于美國MedChem Express公司，CCK-8試劑盒購于上海碧云天公司，PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國羅氏公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取日齡1～3 d的SD大鼠乳鼠(購于北京華富康生物科技股份有限公司)心臟，置于10 mL DMEM/F12中；清洗后棄去培養(yǎng)基，用剪刀將心臟剪成1～2 mm3的組織碎塊；加入1.25 g/L的胰蛋白酶消化10 min，消化5次，棄去第1次消化液，收集后4次消化液；40 μm過濾網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。將濾液接種于兩個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，差時(shí)貼壁90 min(成纖維細(xì)胞貼壁，心肌細(xì)胞仍懸浮)，棄去心肌細(xì)胞，保留貼壁的成纖維細(xì)胞，取第2～3代的成纖維細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于6孔板用于qRT-PCR，接種于96孔板用于CCK-8檢測，接種于24孔板用于熒光染色，接種于10 cm培養(yǎng)皿用于蛋白提取。細(xì)胞用無血清的DMEM/F12孵育6 h后，按分組分別給予不同藥物進(jìn)行處理。

1.3細(xì)胞分組①為觀察CTRP9對AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的影響，將細(xì)胞分為7組：對照組(不處理)，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，10、25、50、100、200 mg/L CTRP9組(分別給予1 μmol/L AngⅡ和不同濃度CTRP9刺激48 h)。②為觀察CTRP9對AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化、膠原合成和AMPKa通路蛋白表達(dá)的影響，將細(xì)胞分為4組：對照組，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，50、200 mg/L CTRP9組(分別給予1 μmol/L AngⅡ和不同濃度CTRP9刺激48 h)。③為觀察AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細(xì)胞活化、增殖及膠原合成的作用，將細(xì)胞分為4組：對照組，AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ刺激48 h)，CTRP9+復(fù)合物C組(細(xì)胞給予復(fù)合物C 10 μmol/L處理30 min后，再給予1 μmol/L AngⅡ和200 mg/L CTRP9刺激48 h)，CTRP9組(細(xì)胞給予1 μmol/L AngⅡ和200 mg/L CTRP9刺激48 h)。

1.4細(xì)胞增殖率的CCK-8法檢測各組細(xì)胞孵育48 h后，每孔加入1∶10稀釋的CCK-8溶液100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=處理組OD/對照組OD×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5細(xì)胞中α-SMA的免疫熒光染色觀察取各組細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定，體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100通透5 min，將抗α-SMA單克隆抗體用體積分?jǐn)?shù)1%羊血清按1∶100進(jìn)行稀釋后4 ℃孵育過夜。第2天用PBS清洗5次，加入二抗(1∶1 000稀釋的Alexa FluorH 488羊抗鼠單克隆免疫球蛋白)室溫孵育60 min。用PBS清洗6次，將細(xì)胞爬片轉(zhuǎn)移到載玻片上，使用DAPI進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、結(jié)締組織生長因子mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測取各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，使用分光光度計(jì)測量純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler 480 SYBR?Green 1 Master Mix體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共42個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7AMPKa、P70和mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的Western blot檢測將各組細(xì)胞溶于裂解緩沖液中，采用BCA法測量蛋白濃度。使用SDS-PAGE膠分離組織裂解產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再使用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h。加入目的蛋白及內(nèi)參GAPDH一抗(均按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加入二抗(羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG，1∶10 000稀釋)37 ℃孵育1 h。使用雙色紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜分析，計(jì)算磷酸化蛋白灰度值與總蛋白灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間細(xì)胞增殖率，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、結(jié)締組織生長因子mRNA表達(dá)水平，p-AMPKa/T-AMPKa、p-mTOR/T-mTOR、p-P70/T-P70的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組成纖維細(xì)胞增殖率的比較AngⅡ組細(xì)胞增殖率高于對照組，5個(gè)CTRP9組細(xì)胞增殖率均低于AngⅡ組(表1)。

表1 各組成纖維細(xì)胞增殖率的比較

F=19.160，P<0.001；*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

2.2CTRP9對AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化的影響結(jié)果(圖1)顯示，AngⅡ刺激48 h后心肌成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)增多，50、200 mg/L的CTRP9均能減少α-SMA的表達(dá)。

A：對照組；B：AngⅡ組；C：50 mg/L CTRP9組；D：200 mg/L CTRP9組；綠色：α-SMA；藍(lán)色：細(xì)胞核

2.3CTRP9對AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞膠原合成的影響AngⅡ刺激48 h后，成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白以及結(jié)締組織生長因子mRNA的表達(dá)增多，50、200 mg/L的CTRP9均能減少上述促纖維化因子的表達(dá)(表2)。

表2 各組成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白以及結(jié)締組織生長因子mRNA表達(dá)的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

2.4CTRP9對AMPKa信號(hào)通路的影響結(jié)果(圖2、表3)顯示：AngⅡ刺激48 h后，成纖維細(xì)胞AMPKa蛋白的磷酸化水平較對照組下降，而其下游的mTOR和P70磷酸化水平增加。與AngⅡ組相比，200 mg/L CTRP9組AMPKa磷酸化水平增加，mTOR和P70磷酸化水平降低。

2.5AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成作用的影響結(jié)果見表4。

2.6AMPKa抑制劑對CTRP9抗成纖維細(xì)胞活化作用的影響AngⅡ組、CTRP9+復(fù)合物C組α-SMA熒光染色均強(qiáng)于CTRP9組(圖3)。

1：對照組；2：AngⅡ組；3：50 mg/L CTRP9組；4：200 mg/L CTRP9組

圖2各組成纖維細(xì)胞p-AMPKa、T-AMPKa、p-mTOR、T-mTOR、p-P70、T-P70的表達(dá)

表3 各組成纖維細(xì)胞p-AMPKa/T-AMPKa、p-mTOR/T-mTOR、p-P70/T-P70的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05

表4 各組成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成能力的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與AngⅡ組相比，P<0.05；△：與CTRP9組相比，P<0.05

A：對照組；B：AngⅡ組；C：CTRP9+復(fù)合物C組；D：CTRP9組；綠色：α-SMA；藍(lán)色：細(xì)胞核

3 討論

成纖維細(xì)胞活化、心肌纖維化的關(guān)鍵過程，是成纖維細(xì)胞對多種細(xì)胞因子及其他局部刺激的綜合應(yīng)答反應(yīng)[10]。多種細(xì)胞因子參與心肌纖維化，例如血小板源性生長因子、AngⅡ、轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子等[11]。AngⅡ介導(dǎo)纖維化微環(huán)境的形成。AngⅡ作用于其受體， 通過活性氧依賴的Rho/Rac 及FAK依賴Ca2+/c-SRC通路激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，后者轉(zhuǎn)錄進(jìn)入核內(nèi)，在CREB 結(jié)合蛋白/p300作用下，啟動(dòng)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等基因的表達(dá)[12-13]。AMPK是在細(xì)胞中廣泛表達(dá)的能量傳感器，通過影響線粒體生成、蛋白質(zhì)合成及分解等在細(xì)胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用。作為調(diào)控心肌能量代謝的關(guān)鍵因素，AMPK在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用。成纖維細(xì)胞主要表達(dá)AMPKa，AMPKa活化可以通過下調(diào)TGF-β通路抑制成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，即抑制成纖維細(xì)胞的成熟[14]。AMPKa基因缺失在無任何刺激的情況下對心臟左室結(jié)構(gòu)或功能沒有影響，但可加劇心臟纖維化和心功能障礙[15]；相反，AMPKa激活能顯著降低心肌纖維化，其可通過抑制下游的mTOR、P70抑制心肌纖維化發(fā)展[16]。

作者采用10、25、50、100、200 mg/L的CTRP9處理大鼠心肌成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5種濃度的CTRP9均能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖。因此作者采用中間和最大濃度即50和200 mg/L的CTRP9進(jìn)行后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)50和200 mg/L的CTRP9均能減少成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，即抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化，有效減少Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等促纖維化因子mRNA的表達(dá)，同時(shí)升高AMPKa的表達(dá)。最后經(jīng)AMPKa抑制劑復(fù)合物C處理成纖維細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CTRP9+復(fù)合物C組成纖維細(xì)胞的增殖率以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等促纖維化因子mRNA的表達(dá)水平高于CTRP9組，說明AMPKa抑制劑可阻斷CTRP9的抗成纖維細(xì)胞增殖、活化和膠原合成作用，提示CTRP9可能是通過AMPKa信號(hào)通路發(fā)揮其抗纖維化作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示CTRP9可通過激活A(yù)MPKa信號(hào)通路、減少促纖維化因子的表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞活化、增殖和膠原合成功能，從而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。