梅志超，位竹君，于佳慧，冀鳳丹，解莉楠

研究報告

多組學關聯(lián)分析揭示表觀等位基因在擬南芥環(huán)境適應性進化中的作用及機制

梅志超，位竹君，于佳慧，冀鳳丹，解莉楠

東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040

表觀等位基因一般是指僅由DNA甲基化差異引起的表達量不同的等位基因，對植物形態(tài)結構和各種生理過程具有重要影響。但自然條件下環(huán)境因素對植物表觀等位基因的影響還不清楚，同時表觀等位基因在植物環(huán)境適應性進化中的作用和機制還亟待探究。為了在全基組水平鑒定擬南芥()中與特定環(huán)境因素相關的表觀等位基因，并分析它們參與擬南芥環(huán)境適應性進化的可能機制，本研究利用623株擬南芥生態(tài)型的轉錄組、甲基化組和種源地氣候數據進行多組學關聯(lián)分析，并同時進行了蛋白互作網絡和基因富集分析。以春季和夏季降水量為例，本研究最終鑒定到5個基因(、、、和)可能具有相應的表觀等位基因，基因內部或附近特定區(qū)域不同甲基化水平對它們的表達可能具有調控作用。其中與種子發(fā)育有關的印記基因首次被發(fā)現(xiàn)可能作為表觀等位基因參與擬南芥環(huán)境適應性進化，其他4個基因均與生物脅迫響應有關。自然條件下降水量能影響當地病蟲害的嚴重程度，而DNA甲基化能通過影響這4個免疫基因的表達來影響擬南芥免疫能力。在長期演化過程中有利于個體適應當地降水模式的表觀等位基因受到正向選擇，這可能是這些表觀等位基因參與擬南芥降水適應性進化的潛在機制。通過蛋白互作網絡、GO功能分析和KEGG通路分析，本研究還首次發(fā)現(xiàn)可能與LSU基因家族其他成員一樣參與硫代謝網絡，并通過影響硫代葡萄糖苷代謝參與擬南芥生物脅迫響應。

植物生態(tài)表觀遺傳學；多組學關聯(lián)分析；表觀等位基因；環(huán)境適應性進化；擬南芥

生態(tài)表觀遺傳學(ecological epigenetics)是由生態(tài)學和表觀遺傳學結合而產生的一門新興交叉學科，主要利用表觀遺傳學的理論和手段分析物種演化過程和生態(tài)學研究中的一些重要現(xiàn)象和問題(如表型可塑性、生境分化、物種形成等)，從而最終解析表觀遺傳學是否參與及通過何種方式參與物種(尤其植物)的長期進化與環(huán)境適應等問題[1]。DNA胞嘧啶甲基化是最常見的表觀遺傳標記，也是目前所有表觀遺傳標記中研究最透徹的。與哺乳動物胚胎期DNA甲基化重編程不同，植物細胞中有多種機制保證DNA甲基化在很大程度上穩(wěn)定遺傳[2]。順式作用元件內部或附近的DNA甲基化能通過影響染色體結構、反式作用因子親和性等調控基因轉錄，處于基因內部的DNA甲基化也可能通過影響轉錄延伸、前體RNA加工等影響基因表達水平[3]。一般將僅由于基因組特定區(qū)域DNA甲基化差異引起表達水平改變的等位基因稱為表觀等位基因(epiallele)[4]，近年來大量表觀等位基因相繼被發(fā)現(xiàn)，揭示了表觀等位基因在植物發(fā)育和逆境響應中的重要作用[5~8]。何力等[9]鑒定到一個與擬南芥()溫度適應相關的表觀等位基因，首次發(fā)現(xiàn)表觀等位基因可能參與植物環(huán)境適應性進化。目前表觀等位基因的鑒定手段主要是經典遺傳學方法(如圖位克隆)，巨大的篩選工作量限制了表觀等位基因的鑒定。

本研究利用“擬南芥1001項目”[10]測序的623個擬南芥生態(tài)型甲基化組、轉錄組和種源地氣候數據進行多組學關聯(lián)分析，結合蛋白互作網絡分析、GO功能分析和KEGG通路分析，嘗試在全基因組范圍內挖掘與特定氣候因素相關的表觀等位基因，并探究這些表觀等位基因可能的作用機制。以春季和夏季降水量為例，本研究共挖掘到5個可能參與擬南芥對當地降水量適應的表觀等位基因。這些表觀等位基因除之外都與擬南芥生物脅迫響應有關，因此推測當地不同降水量引起的病蟲害水平差異可能是對擬南芥產生選擇壓力的直接因素，而這些表觀等位基因通過影響擬南芥對病蟲害的抵御能力參與擬南芥對當地不同降水量的適應。是受表觀遺傳因素調控的印記基因[11]，與種子發(fā)育有關[12]，本研究首次發(fā)現(xiàn)該基因可能作為表觀等位基因參與擬南芥水分適應性進化。本研究還發(fā)現(xiàn)LSU (response to low sulfur)基因家族成員參與了擬南芥硫代謝網絡，并可能通過調控硫代葡萄糖苷的生物合成影響擬南芥對生物脅迫的抵御能力，進而參與擬南芥水分適應性進化。

1 材料與方法

1.1 數據采集與關聯(lián)分析

從“擬南芥1001”項目數據庫[10]下載所有基于Illumina平臺測序的擬南芥生態(tài)型甲基化組和轉錄組數據，GEO號分別為GSE43857和GSE80744。從AraCLIM (https://github.com/CLIMtools/AraCLIM)[13]下載所有生態(tài)型種源地春季和夏季降水量數據。選取同時具有甲基化組、轉錄組和降水量數據的623個生態(tài)型作為本研究的數據來源。由于甲基化對基因表達的調控往往不是通過單個胞嘧啶位點甲基化的形式，而是以一個區(qū)域內多個胞嘧啶甲基化的區(qū)域甲基化形式發(fā)揮作用，同時考慮到單堿基突變對甲基化水平的影響，本研究以Col-0基因組為參考將擬南芥全基因組劃分為每200 bp為一個單位(bin)，以一個bin中重亞硫酸氫鹽測序所得的甲基化read數除以總read數衡量此bin甲基化水平。植物的DNA甲基化有3種序列形式，CG、CHG和CHH，但在本研究中并沒有對此做出區(qū)分，因為在考察現(xiàn)已鑒定到的植物表觀等位基因后，本研究發(fā)現(xiàn)3種甲基化的存在和對基因表達的調控作用沒有顯著差別[5~8]。使用R語言軟件包Matrix eQTL[14]基于一般線性回歸模型分別進行bin與基因表達關聯(lián)分析(eQTLepi)、基因表達與春季/夏季降水量關聯(lián)分析、bin與春季/夏季降水量關聯(lián)分析(EWAS) (圖1)。采用檢驗(student'stest)評估關聯(lián)的顯著性，使用FDR (false discovery rate)進行多重檢驗校正降低假陽性，去除FDR>0.01的結果。

1.2 表觀等位基因挖掘

利用以上關聯(lián)分析結果，分別選取與春季或夏季降水量相關分析值最小的50個bin用于表觀等位基因挖掘的后續(xù)分析，具體分析流程見圖1。提取這100個bin中至少有1個位于內部或附近(上下游2 kb以內)的基因，且要求對應bin的甲基化與該基因表達量相關。再從這些基因中篩選與春季或夏季降水量也相關的基因，即為潛在的與擬南芥降水適應相關的表觀等位基因。值得注意的是，甲基化可能通過增強子或改變染色體結構遠程調控基因表達，但依賴現(xiàn)有研究成果和數據還難以準確預測。因此，本研究中只關注基因內部或附近甲基化對基因表達的調控，而不考慮甲基化遠程調控基因表達的情況。

圖1 本研究分析流程

通過eQTLepi(methylation-dependent eQTL)、EWAS (epigenome-wide association study)和轉錄組–降水量關聯(lián)分析獲得甲基化位點、基因、降水量兩兩關聯(lián)的結果，再篩選甲基化位點在基因附近(上游2 kb、內部和下游2 kb)的結果，即獲得潛在的表觀等位基因，對所有與此甲基化位點關聯(lián)的基因進行蛋白互作網絡(protein-protein interaction, PPI)分析、GO注釋富集分析和KEGG通路富集分析，最終獲得表觀等位基因潛在的作用機制。

1.3 表觀等位基因作用機制分析

采用蛋白互作網絡、GO和KEGG富集分析進一步挖掘甲基化通過調控基因表達影響擬南芥表型，最終參與擬南芥環(huán)境適應的具體機制。對每一甲基化區(qū)域取表達量與其甲基化水平相關的所有基因，再從這些基因中篩選與降水量也相關的基因，最終獲得每一個表觀等位基因對應的“基因集”。利用STRING (https://string-db.org/)對每一基因集進行蛋白互作網絡分析，并使用Cytoscape[15]進行互作網絡可視化。采用omicshare (https://www.omicshare.com/ tools/)在線分析工具分別對每一基因集進行GO功能分析和KEGG通路分析。根據分析結果推斷這些表觀等位基因是否及如何通過蛋白互作網絡影響了某些代謝通路，進而影響擬南芥相關生理功能，最終影響擬南芥對春季或夏季不同降水模式的適應。

2 結果與分析

2.1 與春季降水量相關的表觀等位基因

經甲基化組、轉錄組和春季降水數據兩兩關聯(lián)分析和結果篩選，本研究共鑒定到兩個(和)與春季降水量相關的表觀等位基因(表1，圖2A)。

bin01位于內部(圖3A)，甲基化水平與基因表達量、基因表達量與春季降水量、春季降水量與甲基化水平均呈顯著正相關(圖3F)。說明春季低降水量對bin01的低甲基化水平可能具有正向選擇，bin01的低甲基化可能抑制表達，而該基因的高表達可能不利于擬南芥對春季低降水量的適應。參與擬南芥無義介導的mRNA降解途徑(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)。NMD是真核細胞中一種重要的RNA監(jiān)控系統(tǒng)，能識別并降解含有提前終止密碼子的mRNA，避免因截短的蛋白產物積累而對細胞造成毒害[16]。同時NMD能特異性降解植物免疫受體的轉錄產物，當植物受到病蟲害侵襲時NMD的活動受到抑制，胞內轉錄產物得到積累，啟動植物免疫反應[17]。降水量是影響很多病原菌侵染、繁殖、擴散和害蟲種群數量、遷入遷出率的主要原因之一[18,19]。在春季低降水量的氣候條件下，病蟲害發(fā)生水平較高，具有bin01高甲基化的植株表達量較高，NMD對的降解作用較強，不利于植物及時啟動免疫反應，最終造成這些植株逐漸被自然選擇淘汰(圖4)。

bin02–08位于基因內部(圖3B)，甲基化水平與基因表達量呈顯著負相關，與春季降水量呈顯著正相關，而該基因表達量與春季降水量呈負相關(圖3G)。屬于擬南芥免疫受體家族，參與擬南芥對病蟲害的免疫反應[20]。因此本研究推測，該表觀等位基因可能與的表觀等位基因一樣直接受當地病蟲害發(fā)生水平的選擇壓力。bin02–08低甲基化的植株中具有較高的表達量，因此免疫能力相對較強。在春季低降水量引起的較高病蟲害氣候條件下，這樣的植株具有更強的適應能力，在自然選擇中更易被保留(圖4)。

表1 與降水量相關的表觀等位基因

圖2 曼哈頓圖展示EWAS分析結果

A：春季降水量全甲基化組關聯(lián)分析。虛線以上紅點表示值最小的50個bin，黑色箭頭標注本研究鑒定到的2個與春季降水量相關的表觀等位基因對應的甲基化區(qū)域。B：夏季降水量全甲基化組關聯(lián)分析。黑色箭頭標注本研究鑒定到的3個與夏季降水量相關的表觀等位基因對應的甲基化區(qū)域。

2.2 與夏季降水量相關的表觀等位基因

經甲基化組、轉錄組和夏季降水量數據兩兩關聯(lián)分析和結果篩選，獲得3個(、和)與夏季降水量相關的表觀等位基因(表1，圖2B)。

bin09–11位于基因內部(圖3C)，bin12–14位于(AGAMOUS-like 36)基因下游1400 bp左右(圖3D)。這兩個甲基化區(qū)域的甲基化水平分別與對應基因的表達量負相關，與夏季降水量正相關，而兩個基因的表達量均與夏季降水量負相關(圖3，H和I)。擬南芥中LSU基因家族共有4個成員，其他3個成員均參與擬南芥低硫脅迫響應，是擬南芥硫代謝途徑的關鍵基因[21]，但目前還沒有研究闡明是否參與擬南芥硫代謝途徑。編碼蛋白為I型MADS-box轉錄因子，有研究表明是與種子發(fā)育相關的印記基因，可能參與胚乳從合胞體向細胞化的發(fā)育轉化，但其在種子發(fā)育中的具體作用和機制尚不清楚[11,12]。種子發(fā)育的不同模式對擬南芥適應不同夏季降水條件具有重要影響，本研究推測bin12–14的甲基能抑制的表達，不利于擬南芥對夏季低降水量的適應，在夏季低降水量的氣候條件下受到凈化選擇(圖4)。

bin15位于下游740 bp左右(圖3E)，甲基化水平與該基因表達量、該基因表達量與夏季降水量、夏季降水量與甲基化水平均呈顯著正相關(圖3J)。說明夏季低降水量可能對bin15的低甲基化有正向選擇，其原因可能是bin15的低甲基化抑制表達，而該基因的高表達不利于擬南芥對夏季低降水量的適應。編碼的蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteinase inhi-bitor, CPI)保守結構域，可能對半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase, CP)具有抑制作用。CP通過促進蛋白質的降解參與植物組織衰老和細胞編程性死亡，在植物受病蟲害侵襲時啟動的局部超敏反應中起重要作用[22]。降低CPI的積累水平能提高CP的活性，促進受損組織的衰老和程序性死亡，限制病原體進一步擴散，提高植物對病蟲害的抵御能力。因此，本研究推測受到的直接選擇壓力可能也是當地病蟲害的發(fā)生水平，具有bin15低甲基化的植株表達水平較低，胞內CP活性較高，受病蟲侵襲時局部超敏反應較強，在夏季低降水條件下受到正向選擇(圖4)。

圖3 與降水相關表觀等位基因基因組位置及相關分析

A~E：Anno-J瀏覽器[10]截圖，分別展示本研究在擬南芥中鑒定到的與降水相關的基因與可能調控它們表達甲基化區(qū)域的基因組位置。每小圖上半部分展示基因位置，下半部分展示擬南芥Col-0生態(tài)型基因組甲基化水平，其中每一個柱形代表一個甲基化位點，顏色、高度和上下方向分別表示甲基化的類型、水平和DNA兩條鏈。F~J：甲基化水平、基因表達量、降水量相關系數。分別以數字和圖形兩種方式展示(圓圈大小展示關聯(lián)系數絕對值，從藍到紅對應關聯(lián)系數1到–1)，bin之間高的甲基化正相關性表明它們可能作為一個整體起作用。PreSpr：春季降水量；PreSum：夏季降水量。

圖4 DNA甲基化通過影響基因表達參與擬南芥降水量適應性進化

bin表示此區(qū)域的甲基化。對種子發(fā)育可能有影響，但具體模式和機制仍不清楚，因此用虛線表示。

2.3 蛋白互作網絡和基因富集分析

本研究鑒定到5個可能參與擬南芥對當地降水量適應的基因，而它們附近特定區(qū)域的差異甲基化能影響它們的表達，產生對應的“表觀等位基因”。為進一步挖掘這些表觀等位基因影響擬南芥水分適應的具體機制，提取與這些表觀等位基因所涉及的bin相關且與春季或夏季降水量也相關的所有基因(基因集)，對每一基因集進行蛋白互作網絡、GO功能和KEGG通路分析。結果表明，只有同時與bin09–11和夏季降水量關聯(lián)的基因集形成了明顯的蛋白互作網絡(圖5A)，且基因功能和代謝通路具有顯著富集。

對同時與bin09–11、夏季降水量相關的基因集進行GO富集分析，結果表明，“生物學過程”顯著富集于硫化合物特別是硫代葡萄糖苷(glucosinolate)代謝途徑(圖5B)，“細胞組分”顯著富集于高爾基體和內膜系統(tǒng)(圖5C)。KEGG富集分析結果進一步表明這些基因只顯著富集于硫代葡萄糖苷代謝途徑(圖5，D和E)。硫代葡萄糖苷是十字花科植物中一種富含氮和硫的次生代謝產物，在植物生長發(fā)育和免疫防御中具有重要作用。芥子酶與硫代葡萄糖苷共存于不同細胞中，當植物組織受損時芥子酶水解硫代葡萄糖苷產生異硫氰酸鹽和腈類化合物，前者對多數病原菌和昆蟲具有毒害作用[23]。此外，硫代葡萄糖苷及其水解產物能參與植物硫代謝平衡，緩解硫脅迫[24]。在蛋白互作網絡中，LSU4蛋白通過直接與APR1、KCS13兩個蛋白互作參與整個蛋白互作網絡(圖5A)。是植物LSU基因家族成員，該基因家族主要與擬南芥低硫脅迫響應相關，但目前還沒有研究報道在植物硫代謝途徑中的作用[21]?；谝陨辖Y果，本研究推測可能也參與擬南芥硫代謝網絡，并能通過影響硫代葡萄糖苷的代謝參與擬南芥對生物脅迫的響應。bin09–11的甲基化可能通過抑制的表達降低擬南芥對生物脅迫的抵御能力，而低降水量可能促進當地病蟲害的發(fā)生，因此在當地夏季低降水量的氣候條件下具有bin09–11高甲基化的植株在進化中逐漸被淘汰(圖4)。

圖5 與bin09–11和夏季降水量相關基因PPI、GO和KEGG分析

A：蛋白互作網絡。LSU4通過直接與APR1和KCS13互作參與整個蛋白互作網絡。B：GO“生物學過程”分析。C：GO“細胞組分”分析。D：KEGG通路分析。E：相關基因在硫代葡萄糖苷代謝途徑中的分布。紅色線條標注該過程相關基因存在于本研究的基因集中。

3 討論

從植物自然種群中鑒定表觀等位基因并進行功能分析是植物生態(tài)表觀遺傳學研究的重要方面，本研究結果為探究擬南芥中與降水相關表觀等位基因的鑒定和功能分析奠定了基礎，該方法也同樣適用于其他物種和環(huán)境因子。利用“擬南芥1001”項目測序的不同擬南芥生態(tài)型的甲基化組、轉錄組和氣候數據進行兩兩關聯(lián)分析，能挖掘與特定環(huán)境因素適應有關的表觀等位基因。同時結合蛋白互作網絡和基因富集分析，能進一步分析從特定甲基化模式到環(huán)境適應的具體機制。參考目前擬南芥和其他物種中已鑒定到的表觀等位基因，對基因表達有調控作用的甲基化區(qū)域一般位于基因內部或附近，因此在進行關聯(lián)分析時應著重考慮位于基因內部和附近的甲基化區(qū)域。需要特別指出的是，表觀等位基因一般是指僅由于DNA甲基化差異引起表達量不同的等位基因，因此在鑒定過程中需排除DNA序列變異的影響。雖然從理論上來說DNA序列變異也會影響甲基化水平，但事實上即便基因組區(qū)域存在遺傳變異，整體甲基化水平也可能不受影響。如何力等[9]鑒定到控制基因表達的NMR19區(qū)域甲基化是獨立于該區(qū)域遺傳變異的。由此可見，遺傳因素對表觀等位基因的影響是復雜的，單純依賴生物信息學方法很難分析遺傳變異對表觀等位基因的影響，本研究鑒定到的表觀等位基因仍需設計相關分子遺傳學實驗進一步驗證。此外甲基化與基因表達、基因表達與環(huán)境適應(表型)之間的因果性和充分性也需要設計進一步的實驗驗證。即便如此，本研究的方法和結果仍能為表觀等位基因的進一步實驗驗證和功能分析提供參考，特別是能與基因組定向甲基化編輯技術結合，加快表觀等位基因的篩選工作[25]。

本研究以降水量為例鑒定到5個可能參與擬南芥降水量適應性進化的表觀等位基因(表1，圖4)。這5個基因中，和個基因均直接參與擬南芥免疫反應。其中bin01甲基化對的表達可能具有促進作用，該基因參與擬南芥NMD途徑，而NMD途徑被證明對擬南芥免疫反應有調節(jié)作用。bin02–08的甲基化對可能有抑制作用，該基因是擬南芥免疫受體基因家族成員。編碼的蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，與植物局部超敏反應有關，bin15甲基化對該基因表達可能具有促進作用。bin09–11甲基化對可能具有抑制作用，通過蛋白互作網絡、GO和KEGG富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)可能通過影響硫代葡萄糖苷代謝途徑參與擬南芥對病蟲害的防御。降水量是影響當地病蟲害嚴重程度的重要因素之一，因此本研究推測當地不同的病蟲害發(fā)生水平可能是對以上、、和這4個基因表達量產生選擇壓力的直接原因。是受表觀遺傳因素調控的印記基因，與擬南芥種子發(fā)育有關。本研究首次發(fā)現(xiàn)可能存在表觀等位基因，基因下游1400 bp左右區(qū)域的bin12–14甲基化對該基因表達可能具有抑制作用，而該基因能通過調控種子發(fā)育影響擬南芥對不同降水條件的適應。

氣候數據的全甲基化組關聯(lián)分析能夠揭示環(huán)境條件與基因組甲基化位點之間的關系。本研究結果表明基因組大量位點的DNA甲基化與當地氣候特征具有很強的關聯(lián)性，產生這種關聯(lián)的原因很大程度上是由于這些甲基化位點能控制某些功能基因的表達，而這些基因能影響植物對不同環(huán)境條件的適應能力。表觀遺傳突變在擬南芥自然種群中能產生豐富的表觀遺傳多樣性[26]，有利于個體環(huán)境適應的突變受到正向選擇，這可能是表觀等位基因參與植物環(huán)境適應性進化的潛在機制。此外，表觀等位基因可能介導了植物的拉馬克進化，即環(huán)境條件直接誘導相關等位基因的產生，使植物對環(huán)境產生快 速適應[27]，但其中的具體機制還有待進一步證實和解析。

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Multi-omics association analysis revealed the role and mechanism of epialleles in environmental adaptive evolution of

Zhichao Mei, Zhujun Wei, Jiahui Yu, Fengdan Ji, Linan Xie

Epialleles, generally referring to alleles whose expression is altered due to differential DNA methylation levels, have important roles in plant morphology, development, and various physiological processes. However, the influence of environmental factors on the plant epialleles under natural conditions is unclear. Meanwhile, the role and mechanism of epialleles in the environmental adaptive evolution of plants remain elusive. In this study, we collected the transcriptome, methylome and climate data from 623accessions, derived from worldwide distributions. Then the data were subject to multi-omics association analysis combined with protein interaction network and gene enrichment analysis to identify epialleles related to specific environmental factors and to explore their possible mechanisms involved in the environmental adaptive evolution of. We focused on spring and summer precipitation and identified five potential epialleles with differential DNA methylation levels located in specific regions of the genes:, AT2G34100, AT4G09360,and AT5G56910. Interestingly, the imprinted generelated to seed development was discovered as an epiallele involved in the environmental adaptive evolution of, and the other four genes are related to the response to biotic stress. By protein interaction, GO enrichment, and KEGG pathway analysis, we also found thatmay participate in the sulfur metabolism network like other members of theLSU gene family, and be involved in the biotic stress response by affecting glucosinolate metabolism. In natural conditions low precipitation may affect the severity of local pests and diseases. Therefore, we speculate that DNA methylation associates with the expression of the four genes to regulate the resistance ofto local pests and diseases, and ultimately participates in the adaptation to local environments.

plant ecological epigenetics; multi-omics association analysis; epiallele; environmental adaptive evolution;

2019-11-15;

2020-02-29

國家自然科學基金項目(編號：31871220)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(編號：2572017DA06)和東北林業(yè)大學教育教學改革專項資金項目資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31871220), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2572017DA06), and Special Funds for Education and Teaching Reform of Northeast Forestry University]

梅志超，本科生，專業(yè)方向：生物科學。E-mail: zcmei9901@outlook.com

解莉楠，博士，副教授，研究方向：植物抗逆分子生物學。E-mail: linanxie@nefu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-348

2020/3/14 7:00:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200313.1458.002.html

(責任編委: 劉寶)