張強，顧明亮

綜 述

單細胞測序技術及其在乳腺癌研究中的應用

張強，顧明亮

聊城市人民醫(yī)院，轉化醫(yī)學研究聯(lián)合實驗室，聊城 252000

乳腺癌是起源于乳腺各級導管和乳腺上皮細胞，由增生到不典型增生而逐步發(fā)展成原位癌、早期浸潤癌至浸潤性癌的一種惡性腫瘤。傳統(tǒng)高通量測序技術對乳腺癌的研究主要是鑒定與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關的“驅動基因”，但是對于乳腺癌基因組結構變化以及亞克隆的鑒定等存在一定的局限性，并且忽略了乳腺癌腫瘤細胞之間的異質性。近年來興起的單細胞測序技術是以單個細胞為研究對象，對基因拷貝和基因表達等數(shù)據(jù)進行分析，探究乳腺癌的細胞組成、細胞狀態(tài)和細胞命運，繪制乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)圖譜，對臨床患者進行精準分層，為實現(xiàn)個體化治療提供支持。同時，還可以揭示乳腺癌與T細胞、巨噬細胞等免疫細胞間的相關性，為發(fā)現(xiàn)乳腺癌新的治療靶點、免疫檢查點等提供參考。本文對單細胞測序技術及其在乳腺癌研究中的應用和研究進展進行了綜述，以期為單細胞測序技術的進一步發(fā)展提供參考，同時為理解乳腺癌的發(fā)病機制和免疫治療提供基礎支持。

單細胞測序；乳腺癌；腫瘤微環(huán)境；免疫治療

乳腺癌是乳腺組織中各級導管和乳腺上皮細胞惡性增生的一種癌癥，其臨床表現(xiàn)為乳房腫塊、乳腺形狀改變、皮膚上的酒窩、乳頭溢出液或出現(xiàn)紅色或有鱗的皮膚。乳腺癌分為原位癌和浸潤性癌，一般原位癌并不致命，但由于癌細胞間的粘連性降低，癌細胞一旦脫落，會隨血液或淋巴液擴散至全身形成轉移，引發(fā)浸潤性癌。據(jù)全球癌癥監(jiān)測臺(global cancer observatory, GLOBOCAN)的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌高居中國女性癌癥發(fā)病率首位，嚴重威脅女性健康[1]。目前的研究表明，環(huán)境、遺傳與生活方式和乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關，營養(yǎng)干預、減輕體重已被證實是有效的一級預防措施[2]。近年來大規(guī)模的研究已較為系統(tǒng)地描繪了乳腺癌的致癌因素并勾勒出基因相互作用的網(wǎng)絡，揭示了乳腺癌的生物學復雜性，擴大了病患早期診斷、分級治療和生物標志物靶向治療的途徑，為乳腺癌的精準治療提供了理論支持和潛在的靶點[3]。針對乳腺癌的靶向治療，能有效阻斷腫瘤細胞之間的信息傳遞，抑制腫瘤的生長，達到治療的目的。然而，目前對乳腺癌的靶向治療導致其產(chǎn)生耐藥性已成為臨床治療中的普遍現(xiàn)象，因此亟需發(fā)現(xiàn)新的治療模式以降低乳腺癌的耐藥性和復發(fā)風險。

傳統(tǒng)高通量測序技術主要被用于新癌癥基因的發(fā)現(xiàn)和證明瘤內(nèi)的異質性。乳腺癌的全基因組測序表明，體細胞突變類型中的“驅動”突變(driver muta-tions)會促進腫瘤的發(fā)展，而“搭車”突變(passenger mutations)可能是基因組不穩(wěn)定的產(chǎn)物，但值得注意的是“驅動”突變和“搭車”突變之間在乳腺癌發(fā)展中會發(fā)生逆轉[4,5]。Stephens等[6]發(fā)現(xiàn)在測序的100種乳腺癌中，有73種不同的癌癥基因突變組合，其中的6種組合可以歸納到JUN激酶途徑中。Shah等[7]在104例三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)病例中發(fā)現(xiàn)，確診時TNBC表現(xiàn)出廣泛而連續(xù)的基因組進化譜，并且大多數(shù)都包含數(shù)百個體細胞突變。通過對其進行基因組和轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)常見的乳腺癌突變類型多數(shù)與p53信號通路、磷脂酰肌醇激酶PIK3和表皮生長因子受體酪氨酸激酶ERBB信號通路有關。雖然乳腺癌突變基因和突變組合存在多樣性，但與其相關的信號通路卻具有高度一致性。正是由于信號通路存在一致性，其乳腺癌表型可能相似。由于細胞間的異質性，即使相同表型的細胞也存在遺傳信息的差異，很多分子信息會在整體分析中丟失。這意味著通過傳統(tǒng)的高通量測序對乳腺癌進行更精確的分子分型會更加的困難。為了彌補傳統(tǒng)測序技術的局限性，單細胞測序技術則應運而生。

單細胞測序技術是以單個細胞為起始材料，允許在單細胞水平上進行拷貝數(shù)和基因表達的分析，從而通過構建以非線性分支結構為特征的系統(tǒng)發(fā)育樹，繪制癌細胞多樣性和克隆進化的清晰圖像[8~11]。癌癥作為一種基因組疾病，從原發(fā)性腫瘤，經(jīng)過循環(huán)腫瘤細胞，到轉移性腫瘤，涉及到一系列基因組的變化[12~14]。在細胞水平上，癌細胞的異質性早已被染色體核型分析[5]和組織切片熒光原位雜交(fluo-rescence in situ hybridization, FISH)所證實[15]。乳腺癌常常表現(xiàn)出瘤內(nèi)基因組的顯著異質性，其克隆的多樣性影響了臨床的診斷和治療[16]。單細胞測序技術的應用，為了解乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)生和進化，以及免疫治療機制提供了可能[17]。本文對單細胞測序的技術進行了介紹，并對其在乳腺癌研究中的應用和進展進行了綜述，為繪制乳腺癌基因突變圖譜和揭示其免疫治療的機制提供參考。

1 單細胞測序技術

傳統(tǒng)高通量測序技術需要從大量的細胞中獲取足夠的DNA樣本，因此測序數(shù)據(jù)是這些細胞整體的特征信息。而單細胞測序技術是在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組和表觀遺傳組等進行高通量測序分析，能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達動態(tài)，反映細胞間的異質性。單細胞測序的技術流程包括單細胞捕獲、基因組/轉錄組/表觀組的文庫構建、測序與數(shù)據(jù)分析等步驟(圖1)。其中，單細胞捕獲和文庫構建的質量是評價是否能順利完成測序的關鍵。

1.1 單細胞制備

1.1.1 單細胞懸液準備

制備高質量的單細胞懸浮液是單細胞研究成功的關鍵。不管起始樣本是什么，單細胞懸液的狀態(tài)對于有效的單細胞捕獲和后續(xù)的單細胞建庫測序是至關重要的。對于懸浮的液體樣本(如血液樣本)，可進行密度離心，然后直接用于單細胞的捕獲。對于生物組織須首先利用機械和酶處理進行組織解離。組織通過機械切割或刀片切碎，之后利用酶促消化用于分離細胞。常用的酶類型包括膠原蛋白酶、細胞消化液(accutase)、胰蛋白酶，以及商業(yè)化的酶混合物，如Liberase T。不同組織所使用的酶和消化時間是不同的[18~32](表1)。在組織裂解過程中會形成細胞團塊，可使用DNase I減少細胞團塊的形成。此外，對于較敏感的細胞類型可能在樣品制備過程中被損壞，因此酶處理時間應保持在所需的最低限度。

圖1 單細胞測序技術的流程圖

利用胰蛋白酶和/或膠原蛋白酶等對組織樣本酶解消化，獲得得單細胞懸液。然后，通過FACS、微流控等對單個細胞捕獲。隨后對其基因組、轉錄組或表觀遺傳組進行建庫并測序，通過生物信息學分析解讀測序數(shù)據(jù)。

表1 組織特異性酶處理制備單細胞懸浮液

在單細胞捕獲之前，裂解分離的細胞懸液需要洗滌或利用過濾器進行清洗，以除去大團塊和碎片。細胞懸液的洗滌，洗滌液成分、離心條件和/或過濾器類型都會影響細胞懸液的純度和質量。在細胞洗滌時，理想離心條件下，會產(chǎn)生一團固體團塊，但該團塊的結構不能太過緊實，并且使殘留在上清中的細胞最少。對于較大的細胞，如大多數(shù)未成熟的細胞系，室溫條件下150 r/min可離心3 min，對于較小的細胞，如外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，室溫條件下300 r/min離心需5 min[33]。利用過濾器過濾時，其過濾器孔徑應該大于樣品中細胞的最大直徑，但要小到足以捕捉較大的團塊。根據(jù)凝塊的程度和過濾器的類型，細胞的數(shù)量和洗滌液的量可以有所不同。一般情況下，推薦使用MACS智能濾器，因為其對細胞濃度的影響很小，對于濃度較低的細胞懸浮液體積，建議使用Flowmi?尖端過濾器，使體積的損失最小化[33]。細胞清洗液和重懸液推薦使用含0.04%牛血清白蛋白的磷酸鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)，添加牛血清白蛋白使細胞損失和聚集最小化[33]。對于敏感型細胞，如原代細胞、干細胞等，為最大限度提高其生存能力，可用細胞培養(yǎng)常用緩沖液Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution, HBSS)代替PBS。如果在這些緩沖液中細胞不能維持良好的活力，也可在最常見的細胞培養(yǎng)基中清洗和重懸，如DMEM培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基[33]。洗滌和重懸細胞時，其濃度要維持在低于5000細胞/μL，較高濃度的細胞會導致細胞聚集成團，從而干擾理想的單細胞懸浮液的生成。為盡量減少剪切力對細胞的物理損傷，在細胞洗滌和重懸過程中，建議使用寬口徑的移液管，因為常規(guī)移液管的尖端，容易對細胞造成剪切和破壞。細胞懸浮液應在制備后，30 min內(nèi)應盡快進行后續(xù)實驗，以保證細胞懸浮液質量。

1.1.2 單細胞捕獲

單細胞測序的第一步且最關鍵的一步就是如何有效的捕獲單個活性細胞。單細胞捕獲的最大挑戰(zhàn)是保證細胞的活性和完整性[34]。當前組織酶解單細胞獲取方法有微吸法[35]、微孔法[36]、流式細胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS)和微流控(microfluidics)。對于組織切片常用的單細胞獲取方法有激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection, LCM)和膜片鉗(patch clamping)。

微吸法和微孔法主要是依靠手工操作來獲取單個細胞。微吸法是在顯微鏡視野下，用微量移液器或口吸管吸取單細胞，其獲取的細胞數(shù)量較少，并且需要具備很強的實驗操作技能。這兩種方法是可以直接觀察到吸取的細胞，依據(jù)細胞的形態(tài)能夠確保細胞的完整性，從根本上保證了細胞的質量。

FACS是把制備好的單細胞懸液通過流式細胞儀，根據(jù)細胞的特異性分子標記、粒徑、顆粒密度等參數(shù)，將單個所需細胞依次打入每個孔中[37]。細胞通量大和分離速度快是FACS的主要優(yōu)勢。由于FACS需要大量的單細胞懸液作為起始材料，所以它較難從數(shù)量較少的細胞群中分離得到單個細胞，如循環(huán)腫瘤細胞[38]。

微流控是當前獲取單個細胞最常用的方法，它是通過控制微流體芯片中的液體流動來捕獲單個細胞。目前應用最廣泛的微流控系統(tǒng)是FluidigmC1系統(tǒng)和10×Genomics Chromium系統(tǒng)。Fluidigm C1芯片上的細胞捕獲位點有800個，不僅能滿足實驗要求，并且后續(xù)的反轉錄和cDNA擴增可以自動化地完成[39]。商業(yè)化的10×Genomics是利用油相的微小水滴封裝單細胞，被捕獲的單細胞在這樣的油包水液滴中裂解，并被標記，之后再進行反轉錄和擴增[40,41]。

LCM和膜片鉗是從組織切片上獲取單個細胞，因此可以獲知細胞在組織中的空間位置[42,43]。LCM 利用激光束切割目的細胞，由于細胞之間的粘連性，易受到邊緣細胞的污染[44]。這兩種方法獲取的細胞盡管通量低，但在細胞形態(tài)學或染色體特性的視覺檢查上具有明顯的優(yōu)勢。

1.2 單細胞建庫與測序技術

1.2.1 單細胞全基因組建庫與測序

單細胞全基因組測序是對單個細胞中的微量全基因組DNA進行擴增，在獲得高覆蓋率的基因組后進行高通量測序，以揭示細胞間差異和細胞的進化(表2)。

單細胞的基因組學研究中，由于細胞內(nèi) DNA 的含量極少，因此首先需要通過全基因組擴增技術將 DNA 進行擴增[45]。全基因組擴增(whole genome amplification, WGA)是一種對極低起始量的基因組進行非選擇性擴增的技術，是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA總量，以滿足后續(xù)分析需求[46]。連接錨定PCR(ligation anchored PCR, LA- PCR)是先進行DNA的剪切或消化，然后進行接頭的連接，之后再進行PCR擴增[47]。引物延伸預擴增PCR (primer extension pre-ampli?cation PCR, PEP- PCR)是在熱循環(huán)條件下，使用DNA聚合酶進行多輪隨機引物擴增，產(chǎn)生多個基因組DNA序列[48]。簡并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide- primed PCR, DOP-PCR)是采用具有簡并堿基的雜交寡核苷酸引物，在DNA模板上聚集，分兩步PCR進行，第一個階段促進引物在模板上的延伸，第二個階段進行擴增子的復制[49,50]。這3種基于PCR的單細胞基因組擴增方法具有較高的擴增偏倚，易導致其覆蓋率極低且不均勻[51]。

表2 單細胞全基因組建庫與測序方法

質粒和病毒的滾環(huán)復制機制為多重置換擴增法(multiple displacement ampli?cation, MDA)提供了靈感[52]。MDA是將隨機引物退火到變性DNA上，然后在φ29 DNA聚合酶催化下進行恒溫鏈置換合成。與基于PCR的方法相比，MDA降低了擴增偏倚，并產(chǎn)生了更大的擴增子，平均長度>12 kb。此外，φ29 DNA聚合酶的校對活性將錯誤率降低到106~107 [51]。雖然MDA解決了基于PCR擴增帶來的偏倚，但是，當對二倍體人類單細胞基因組進行單核苷酸變異(single nucleotide variations, SNVs)基因分型時，MDA可能會無法檢測到兩個等位基因，導致將雜合位點誤稱為純合位點[53]。

多重退火循環(huán)放大擴增(multiple annealing and looping-based ampli?cation cycles, MALBAC)是將MDA與PCR相結合，引入了線性預擴增，以減少與非線性擴增相關的偏倚[9]。引物由隨機序列和通用標記序列所組成，在等溫鏈置換反應中，退火到DNA模板上，由嗜熱芽孢桿菌DNA聚合酶(DNA聚合酶)進行延伸擴增。在準線性放大階段進行了五個周期的退火、延伸和變性，以限制反應速率。新合成擴增子的末端與每個引物的序列相同，可以形成閉環(huán)，防止它們再次被復制。MALBAC的擴增偏倚低，覆蓋率高。但不能對復雜的DNA二級結構進行有效擴增。

在單細胞全基因組建庫及測序中，基因組擴增是其關鍵步驟，可根據(jù)研究目的選擇適宜的擴增技術或技術組合。DNA以半保留方式進行高保真復制，盡管DNA聚合酶具有校對活性，但堿基對錯配是不可避免的。在未來，發(fā)現(xiàn)并采用更高保真度的DNA聚合酶，而不是DNA聚合酶、φ29 DNA聚合酶和DNA聚合酶，以降低擴增錯誤率是單細胞全基因組建庫與測序技術優(yōu)化的方向。

1.2.2 單細胞轉錄組建庫與測序

單細胞轉錄組測序首先需要將單個細胞中的mRNA進行反轉錄成cDNA，之后對cDNA進行PCR擴增，在獲得足夠的基因組后進行高通量測序。如表3所示，現(xiàn)有的單細胞轉錄組文庫構建和測序原理有3種：添加ployA尾巴、基于5′模板置換和體外轉錄擴增。

傳統(tǒng)的mRNA測序方法是對一群細胞進行轉錄分析，其數(shù)據(jù)為細胞的平均表達模式。然而，即使是同一個細胞系，單個細胞間基因表達和蛋白質表達水平也不盡相同[54,55]。Tang等[56,57]率先將單細胞RNA技術與二代測序相結合，使單細胞轉錄組的單堿基分辨率和高通量分析成為可能。在Tang等的方法中，單細胞被直接裂解，釋放出來的mRNA被帶有錨定序列UP1的寡核苷酸-dT引物反向轉錄成cDNA。末端脫氧核苷酸轉移酶將polyA尾加到cDNA第一鏈的3′端。利用另一個錨定序列UP2的寡核苷酸- dT引物合成cDNA第二鏈，利用UP1引物和UP2引物進行PCR擴增，擴增所得到的cDNA足以構建測序所需的文庫。Quartz-seq[58]與Tang等的方法類似，唯一不同的就是cDNA第二鏈合成時使用的依然是和第一鏈合成時一樣的錨定序列UP1的寡核苷酸-dT引物，擴增過程中的副產(chǎn)物會形成發(fā)卡結構而不能繼續(xù)擴增，從而提高了保真度。Quartz-seq和其他polyA加尾的轉錄組擴增方法一樣，具有3′偏向性。Quartz-seq進行PE50 (雙端50 bp)測序，平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為1~20×106Reads。SUPeR-seq (single-cell universal polyA-independent RNA-seq)利用含有固定錨定序列的隨機引物合成cDNA第一鏈，引物含有隨機核苷酸和寡核苷酸-dT，對多聚腺苷酸和非多聚腺苷酸RNA進行測序[59]。SUPeR-seq進行PE100 (雙端100 bp)測序，平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為10,911 Reads。MATQ-seq (multiple annealing and dc- tailing based quantitative RNA-seq)是利用含有G、A和T堿基的引物先進行10個周期的退火，該引物是基于MALBAC引物的改進，反轉錄后對第一鏈cDNAs進行Ploy C加尾，再使用G富集的引物高效地合成第二鏈，UMI(unique molecule identi?er)是在第二鏈合成時引入，在PCR擴增前進行cDNA的特異性標記，其基因組覆蓋率高，且非常靈敏[60]，MATQ-seq平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為1×106Reads。

表3 單細胞轉錄組建庫與測序方法

SMART-seq (switching mechanism at the 5′end of the RNA template)使用莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus, M-MLV)反轉錄酶來完成反轉錄過程[61~63]。這種酶可以在cDNA第一條鏈的3′末端加上2~6個胞嘧啶(C)。該方法傾向于在5′端完成模板轉換，所以這是一種擴增全長轉錄本的方法。SMART-seq2是在SMART-seq的基礎上，把模板轉換寡核苷酸(template switching oligos, TSO)的最后一個堿基G做了一個鎖相核酸(Locked nucleic acid, LNA)修飾，提高了cDNA的產(chǎn)量和敏感性[64,65]。SMART-seq/SMART-seq2，進行PE50 (雙端50 bp) 測序，平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量為1~20×106Reads。Drop-seq是一種能夠快速分析成千上萬個單細胞的方法。通過將每個細胞與含有barcode和UMI的微珠共包裹在納米級液滴中，細胞在這個液滴中完成細胞裂解、RNA 捕獲和反轉錄，之后再進行文庫擴增以滿足后續(xù)的測序要求[66]。Drop-seq進行PE50 (雙端50 bp)測序，平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量為737,240 Reads。STRT-seq (single-cell tagged reverse- transcription)是利用寡核苷酸-dT 引物對單個細胞中的mRNA進行反轉錄[67]。由于反應混合物中含有由鳥嘌呤(G)和barcode組成的寡聚物，cDNA合成時，5′端被M-MLV逆轉錄酶標記。多個樣本的cDNA混合，用單引物進行PCR擴增，擴增后的cDNA純化、片段化，并準備用于測序的文庫。STRT-seq是一種基于5′條形碼(barcode)的特異的單細胞轉錄組測序方法，顯示出強烈的5′偏倚。STRT-seq平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為250,000 Reads。STRT- seq-2i[68]是一個在STRT-seq的基礎上開發(fā)的具有9600個位點，與限制稀釋或FACS相結合的納米孔微陣列平臺，細胞通過限制稀釋或直接可尋址的FACS排序進行加載。FACS定位的細胞允許index排序，依據(jù)細胞屬性(如熒光信號或大小)分配陣列坐標和barcode。含有細胞的納米孔可以通過靶向分配的方式被專門利用，這大大降低了試劑的成本和環(huán)境RNA的污染。為了保證在載入納米細胞的過程中獲得高的細胞存活率，可以在緩沖液中加入氟化碳，樣品保存在冰上。STRT-seq-2i平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為62,000 Reads。SCRB-seq[69](single cell RNA barcoding and sequencing)依賴模板轉換逆轉錄酶，利用含有barcode、UMI、接頭和寡核苷酸-dT的引物反轉錄單細胞的mRNA得到cDNA。SCRB-seq使用一種改進的基于轉座子的碎片法將來自多個細胞的cDNA匯集、擴增，用于多路重復測序，保留并豐富了3′鏈信息。SCRB-seq平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為165 000 Reads。

CEL-seq (cell expression by linear amplification and sequencing)利用含有barcode、接頭和T7啟動子的寡核苷酸-dT的引物反轉錄單細胞的mRNA 得到cDNA[70]。在cDNA的第二鏈合成后，將多個樣本的cDNA聚合均一化進行體外轉錄(trans-cription, IVT)，之后再進行RNA片段化和反轉錄以達到擴增的效果。正是由于在3′端引入barcode進行后續(xù)的反應，因此CEL-seq具有嚴重的3′偏倚[71]。CEL-seq2[72]是在CEL-seq的基礎上引入了UMI，同時縮短了Barcode、接頭和T7啟動子引物的長度，提高了反轉錄效率。在cDNA合成后，會進行一步在CEL-seq中沒有的核酸純化，純化完成后，其后續(xù)的步驟與CEL-seq相同。同樣CEL-seq2也具有較高的3′偏倚。CEL-seq/CEL-seq2平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量為300 000 Reads。In Drops[73](indexing droplets)與Drop-seq是非常相似的，也是利用液滴微流控技術，將細胞和裂解液、反轉錄試劑和水凝膠微粒共封存在液滴中，在液滴里面自動完成細胞裂解和cDNA的合成。與Drops不同的是，In Drops所用的水凝膠微粒上還含有T7 RNA聚合酶啟動子。In Drops平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量為10,237~ 208,231Reads。MARS-seq[74](massively parallel RNA single-cell sequencing)是一種自動化的大規(guī)模并行RNA單細胞測序框架，通過多重RNA測序對數(shù)千個細胞進行活體采樣，同時嚴格控制擴增偏差和標記錯誤。該方法基于FACS將單個細胞分選到384孔板，并隨后進行自動化處理。在384孔板進行細胞的裂解，隨后含有barcode、接頭和T7啟動子的寡核苷酸-dT的引物將mRNA 反轉錄得到cDNA。多個樣本的cDNA均一化后進行體外轉錄(transcription, IVT)，之后再進行RNA片段化和反轉錄擴增。MARS-seq平均每個細胞的測序數(shù)據(jù)量約為22,000 Reads。

1.2.3 單細胞表觀遺傳建庫與測序

單細胞基因組和轉錄組的測序數(shù)據(jù)證明兩者不能完全展示細胞的全貌，因為其功能由表觀遺傳狀態(tài)所調控，包括DNA甲基化(5-mc)、羥甲基化(5-hmc)，組蛋白修飾、非編碼RNA調控、染色質重構以及與染色質結合的結構調節(jié)蛋白等。

DNA甲基化在基因表達調控中起著重要作用，其在基因轉錄起始位點附近的存在與相應基因的表達水平降低有關?；趤喠蛩釟潲}轉化的高通量DNA甲基化測序方法已被用于單細胞DNA甲基化的全基因組測序。scRRBS[75](single-cell reduced representation bisul?te sequencing)是將原有的高通量亞硫酸氫鹽轉化DNA甲基化的測序方法應用到單細胞水平上。在scRRBS中，所有過程都集中在同一個反應管中，包括基因組的I酶解消化、末端修復和dA-加尾、接頭連接和亞硫酸氫鹽的轉化。亞硫酸氫鹽處理后的DNA通過PCR擴增得到足夠的DNA用于文庫制備和后續(xù)測序。scRRBS進行PE100(雙端測序，每端100 bp)測序，其數(shù)據(jù)量為0.5~1.5×106Reads。scBS-seq[76](single-cell bisul?te sequencing)與scRRBS不同，其先進行亞硫酸氫鹽轉化，之后用寡核苷酸標記的隨機引物對亞硫酸氫鹽處理過的DNA進行5個周期的引物延伸。捕獲寡核苷酸錨定DNA后，用寡核苷酸標記隨機引物再進行擴增，產(chǎn)生擴增子，并對擴增子進行擴增以產(chǎn)生足夠的DNA測序文庫。scBS-seq進行PE100測序，其數(shù)據(jù)量為3.7~3.9×106Reads。scRRBS和scBS-seq主要缺陷是亞硫酸鹽轉化過程中DNA急劇降解和亞硫酸鹽轉化后DNA的純化，可能導致高偏倚、低覆蓋率。此外，scRRBS和scBS-seq不能區(qū)分5-mc和5-hmc。

組蛋白N-末端氨基酸殘基可發(fā)生乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等多種共價修飾作用，會影響組蛋白與DNA雙鏈的親和性，從而改變?nèi)旧|的疏松或凝集狀態(tài)，來發(fā)揮基因調控作用。scChIP-seq[77](single-cell chromatin immunoprecipitation followed by sequencing)是在單細胞分辨率下對組蛋白翻譯后修飾，染色質的開放(H3K4me3)或封閉(H3K27me3)狀態(tài)進行分析?；趇nDrop微流控平臺，形成一個含有單個細胞的核小體和攜帶T7啟動子、barcode和接頭的水凝膠珠的油包水結構。在液滴中完成核小體的接頭連接后，進行蛋白免疫相互作用，用抗體把和染色質相互作用的蛋白沉淀下來，捕捉細胞內(nèi)動態(tài)的、瞬時的蛋白質與DNA之間的相互作用，從而獲取與其相結合的DNA序列，進行PCR擴增制備測序文庫。scChIP-seq進行PE150(雙端測序，每端150 bp)測序，其數(shù)據(jù)量為1630~10 228 Reads。scATAC-seq[78,79](single-cell assay for transposase- accessible chromatin)是對單細胞中的核小體DNA進行測序，其關鍵步驟是在細胞裂解之后對DNA 進行的轉座(如使用Tn5轉座酶)，對轉座后的DNA，用含有barcode、接頭等的引物進行PCR擴增，制備測序文庫。scATAC-seq 可以基于微流控或FACS的基礎上，完成后續(xù)的文庫構建。scATAC-seq所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量約為502~69.847 reads。

無論是單細胞基因組、轉錄組還是表觀組測序，對于組織來說，在制備單細胞懸液的同時，保存每個細胞的位置信息尤為重要，因為組織內(nèi)的位置是細胞識別的關鍵決定因素?？臻g轉錄組[80](spatial transcriptomics)則允許在單細胞水平上同時研究細胞異質性和空間差異。該方法在組織切片上進行轉錄的分析，不需要進行細胞解離，將組織切片置于含有barcode的逆轉錄試劑的載玻片上，試劑對組織進行滲透，最終組織被酶解，cDNA則與載玻片上寡核苷酸結合。然而，該方法對揭示細胞的異質性存在偏差。將空間轉錄組發(fā)展成精準的單細胞方法需要保證單細胞層厚度的均一性，在技術上尚有很大的提升空間。

2 單細胞測序在乳腺癌中的應用

2.1 探究乳腺癌細胞異質性

Navin等[17]在2011年通過單細胞基因組測序對乳腺癌的腫瘤群體結構和演化進行研究，精確地量化單個細胞核內(nèi)的基因組拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)3個不同的克隆亞群可能代表不同克隆的序列擴增。他們對其中一個原發(fā)性腫瘤進一步分析發(fā)現(xiàn)，一個單克隆擴增形成了原發(fā)性腫瘤并撒下了轉移的種子。此外，還發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的豐富的亞群，即基因多樣化的“假二倍體”細胞，它們不會遷移到腫瘤部位，與腫瘤進展的漸進模型相反，并證明了乳腺癌腫瘤是以不間斷的克隆擴張的形式不斷生長的。正是因為乳腺癌的不同克隆亞群的不間斷生長，使得乳腺癌分化出不同的亞型。乳腺癌的表達譜分析顯示其具有5個亞型，這些都和雌激素(ER)、孕酮(PR)和表皮生長因子(Her2)受體相關，而三陰性乳腺癌(ER–/PR–/Her2–)在這些癌癥亞型中突變數(shù)量是最多的。單細胞測序分析發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中存在高水平的體細胞突變、TP53的頻繁突變(83%)和復雜的非整倍體重排(80%)，使腫瘤細胞的克隆多樣性增多，導致了廣泛的瘤內(nèi)細胞異質性[81,82]。Chung等[83]對來自11名乳腺癌患者的515個細胞進行單細胞轉錄組測序，將乳腺癌細胞與非癌細胞分離。乳腺癌細胞在腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出共同的特征，并在乳腺癌亞型和關鍵的癌癥相關通路上表現(xiàn)出瘤內(nèi)細胞異質性。非癌細胞多數(shù)是免疫細胞，有3種類型的細胞：T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞。T淋巴細胞、調節(jié)型T細胞和巨噬細胞均表現(xiàn)一定的免疫抑制特性，而衰竭型T細胞和M2表型的巨噬細胞表現(xiàn)出促癌作用。這些證據(jù)表明乳腺癌廣泛的瘤內(nèi)細胞異質性，是由腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞和免疫細胞共同形成的。單細胞圖譜加深了人們對乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)的理解，有助于實現(xiàn)基于腫瘤微環(huán)境的患者分類，實現(xiàn)針對其免疫微環(huán)境的個體化治療。

2.2 探究乳腺癌發(fā)生和轉移機制

乳腺癌基因組測序發(fā)現(xiàn)體細胞突變中，驅動突變賦予了癌細胞克隆選擇的優(yōu)勢，并與致癌基因存在因果關系，而乳腺癌的驅動突變和突變過程尚未得到全面的探索。Stephen等[6]對100例乳腺癌患者腫瘤的基因組體細胞拷貝數(shù)變化和編碼外源性蛋白基因的突變進行分析，發(fā)現(xiàn)體細胞突變的數(shù)量在個體腫瘤之間存在顯著差異，其突變數(shù)、癌癥診斷年齡和癌癥組織學分級之間存在很強的相關性，并觀察到多種突變特征，如在10%的乳腺癌中存在一種突變，其特征為在TpC二核苷酸處存在大量胞嘧啶突變。該研究團隊分析的100例乳腺癌中，其每例體細胞突變過程中堿基的替換和/或插入的總數(shù)有很大變化，突變模式也存在相當大的多樣性，至少發(fā)現(xiàn)40個與乳腺癌發(fā)生相關的癌基因的驅動突變，以及73種不同的突變癌癥基因組合?？偟膩碚f，突變的癌癥基因和不同突變組合對遺傳事件起著推動作用，多種驅動因素的存在與腫瘤的克隆進化相關，進而引起乳腺癌的遺傳多樣性。

乳腺癌中突變的癌癥基因和突變過程的全景正變得越來越清晰。通常，少數(shù)基因會發(fā)生突變，但這些經(jīng)常發(fā)生突變的少數(shù)基因共同在無數(shù)個不同的組合中發(fā)揮作用就會誘發(fā)癌變。乳腺癌的突變多樣性，促使乳腺癌產(chǎn)生不同的亞型，如乳腺導管原位癌(ductal carcinoma, DCIS)，組織病理學中分為腫瘤細胞原位和侵襲性(invasive ductal carcinoma, IDC)兩類。DCIS是早期乳腺癌最常見的一種形式，由于導管中腫瘤細胞數(shù)量有限[84]，基質細胞數(shù)量較多[85]，關于DCIS侵襲和進化知之甚少[86~88]。Casasent等[89]開發(fā)了一種結合激光彈射和單細胞DNA測序的方法—TSCS (topographical single cell sequencing)來測量單個腫瘤細胞種基因組拷貝數(shù)的變化，同時保存它們在組織切片上的空間信息。利用TSCS追蹤了10例DCIS-IDC患者冷凍腫瘤樣本在侵襲期間的克隆進化，結果證實原位和侵襲性腫瘤亞群之間存在直接的基因組譜系，大多數(shù)突變和拷貝數(shù)畸變在侵襲之前就在導管內(nèi)進化完成。乳腺癌中多數(shù)的體細胞突變，包括TP53和PIK3CA驅動突變，都是在侵襲前，即腫瘤進展的早期階段，在導管內(nèi)獲得。該研究結果支持多克隆侵襲模型，在該模型中，一個或多個克隆腫瘤細胞相互協(xié)同從基底膜中逃逸并遷移到鄰近組織中，從而建立侵襲性癌。上述發(fā)現(xiàn)與癌細胞入侵模型形成對比，這些模型提出不同的克隆可在原位產(chǎn)生侵襲性腫瘤細胞，并反對外部刺激(即“場效應(field effect)”)可導致多灶性疾病的觀點。然而，對于克隆腫瘤的逃脫，是完整基底膜破裂后的隨機逃脫，還是腫瘤克隆通過克隆之間相互作用，或共棲(commensalism)發(fā)生，即單個“先遣”克隆(a single leader clone)破壞、突破基底膜，為后續(xù)“追隨者”克隆(follower clones)的逃脫掃清道路，尚需要更進一步的功能研究。

2.3 探究乳腺癌免疫治療機制

2.3.1 發(fā)現(xiàn)乳腺癌免疫細胞異質性和新靶點

乳腺癌精準治療的一個主要障礙是人們對乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)缺乏深入的了解。腫瘤生態(tài)系統(tǒng)由癌細胞、浸潤免疫細胞、基質細胞和其他細胞類型以及非細胞組織成分組成[90]。由于遺傳和非遺傳因素，癌細胞和腫瘤相關細胞具有表型和功能的異質性。為了描述乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)腫瘤細胞和免疫細胞的關系，Gerdes等[91]對乳腺導管癌組織免疫熒光切片進行單細胞分割，進行單細胞水平的定量以聚類方法確定了上皮細胞標志物和免疫標志物的共表達模式，發(fā)現(xiàn)上皮細胞聚集模式與免疫浸潤的存在和類型有關，這表明每個患者的上皮腫瘤和免疫系統(tǒng)之間存在復雜的相互作用。這為分析上皮和免疫/基質成分對理解導管原位癌病變的復雜環(huán)境是必要的提供了第一個證據(jù)。毋庸置疑，乳腺腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的鑒定在乳腺癌的治療中尤為重要。隨后，Wagner等[92]利用單細胞技術結合質譜分析對144例人乳腺腫瘤和50例非腫瘤組織樣本測序分析，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞組成上表現(xiàn)出明顯的個體化差異，包括表型異常和表型顯性。在ER+亞型中出現(xiàn)了較多的高表達PD-L1+的腫瘤相關巨噬細胞和衰竭T細胞，腫瘤細胞與免疫細胞的關系分析揭示了與免疫抑制和不良預后相關的生態(tài)系統(tǒng)特征。對腫瘤微環(huán)境中T細胞深入研究發(fā)現(xiàn)，其和正常組織中的T細胞相似，但腫瘤微環(huán)境特異性卻在持續(xù)性的擴張。Azizi等[93]對8例乳腺癌患者27,000個T細胞和T細胞受體(T cell receptor, TCR)進行單細胞分析，揭示了TCR的利用對表型多樣性的影響，證明了乳腺癌是T細胞持續(xù)活化的模型，與癌癥中的巨噬細胞極化模型是不一致的。在腫瘤浸潤性淋巴細胞中T細胞是占主導地位的，但是T細胞數(shù)量和差異與乳腺癌預后的關系尚不明確[94]。Savas等[95]也對6311個T細胞進行單細胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)浸潤的T 細胞群體存在明顯的細胞異質性，其中CD8+T細胞的數(shù)量是最多的，并且具有組織駐留記憶T細胞(TRM)的分化特性，這些CD8+TRM細胞表達了高水平的免疫檢查點分子和效應蛋白，與早期三陰性乳腺癌患者預后改善顯著相關。

依據(jù)腫瘤微環(huán)境圖譜，細胞大致可分化為腫瘤相關巨噬細胞、促血管生成細胞、原發(fā)腫瘤生長和遠端轉移細胞[96,97]。腫瘤相關巨噬細胞會通過抑制效應T細胞的分化和功能，刺激調節(jié)性T細胞和骨髓源性抑制細胞在腫瘤內(nèi)積累，建立了一個強大的免疫抑制腫瘤生態(tài)系統(tǒng)[98~100]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌小鼠模型中，鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶2 (calcium/calmodulin-dependent kinase kinase, CaMKK2)在瘤內(nèi)髓樣細胞內(nèi)高表達，并證明其在髓樣細胞內(nèi)的抑制作用通過增加效應CD8+T細胞和免疫刺激髓樣亞群的瘤內(nèi)積累來抑制腫瘤生長。與對照組相比，從CaMKK2–小鼠中分離的腫瘤相關巨噬細胞表達了更高水平的參與效應T細胞招募的趨化因子。CaMKK2抑制劑可以抑制腫瘤以CD8+T細胞依賴的方式生長，并促進免疫細胞微環(huán)境的重新編程[101]。這些數(shù)據(jù)的發(fā)現(xiàn)使CaMKK2作為骨髓選擇性檢查點提供了依據(jù)，其抑制作用可能在乳腺癌的免疫治療中發(fā)揮重要作用。

2.3.2 揭示乳腺癌耐藥機制

化療和靶向治療耐藥的出現(xiàn)是目前乳腺癌治療面臨的重大挑戰(zhàn)。單細胞基因組和轉錄組測序強調了腫瘤內(nèi)遺傳異質性在腫瘤進化中的重要性，并表明未經(jīng)治療的腫瘤內(nèi)遺傳異質性是腫瘤耐藥的關鍵因素[102~105]。然而，在許多情況下，驅動抗性的遺傳機制尚未被發(fā)現(xiàn)，這提示非遺傳機制在其中發(fā)揮了作用。單細胞轉錄和表觀遺傳機制研究在乳腺癌腫瘤細胞在面對環(huán)境、代謝或治療壓力的適應過程中發(fā)揮作用。Kim等[106]研究了TNBC患者腫瘤細胞對新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)反應后的基因組和表型進化，發(fā)現(xiàn)了兩種截然不同的克隆動力學：消退型和持續(xù)型。在克隆消退型患者中，NAC清除了腫瘤細胞，只留下正常的二倍體細胞類型，包括許多成纖維細胞和免疫細胞。與此相反，克隆持續(xù)型患者體內(nèi)存在大量因NAC而改變基因型和表型的殘余腫瘤細胞。之后利用單細胞DNA和RNA測序對8例TNBC患者進行深入分析，結果顯示，TNBC患者在多西紫杉醇(docetaxel)和表阿霉素(epirubicin)治療前后，其染色體數(shù)目和基因組發(fā)生了變化，并且被選擇性的適應。治療后患者的轉錄本進行了重編程，并且在治療前已經(jīng)表達了化學抗性基因的子集，這說明其耐藥基因型是預先存在的，治療后轉錄亞克隆的出現(xiàn)可能解釋了癌細胞對治療壓力的適應?？偟膩碚f，該數(shù)據(jù)支持一個耐藥模型，在這個模型中，兩種模式的進化(適應性和獲得性)正在建立耐藥性腫瘤。

在基因轉錄表達的過程中，組蛋白修飾調控染色質結構是主要表觀遺傳機制和調控因子。相比單細胞轉錄組，表觀遺傳變異，如染色質特征，對腫瘤異質性和耐藥進化的貢獻仍然未知。最新研究，Grosselin等[77]則利用單細胞染色質免疫沉淀測序，在單細胞分辨率下描繪了成千上萬個細胞的染色質景觀，其依據(jù)細胞染色質分布情況對細胞類型進行分割，并識別了每個亞群的關鍵染色質特征。利用病人衍生的乳腺癌獲得性耐化療和靶向治療的異種移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的藥物敏感腫瘤中有一部分細胞與耐藥性腫瘤細胞共享一個共同的染色質特征。這些細胞，以及來自耐藥性腫瘤的細胞，已經(jīng)失去了染色質標記—H3K27me3，它與穩(wěn)定的轉錄抑制相關，包括已知的促進化療或靶向治療的耐藥基因。H3K27me3染色質標記的缺失可以使染色質轉變?yōu)椤霸试S”狀態(tài)，并可能與轉錄變化之前的啟動事件相對應。值得注意的是，在胰島素樣生長因子信號通路中存在H3K27去甲基化和胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP)基因的轉錄激活，這在乳腺癌耐藥性中起著關鍵作用。這項研究表明，具有耐藥性腫瘤細胞染色質特征的罕見細胞在治療前就已經(jīng)存在。

隨著乳腺癌腫瘤微環(huán)境圖譜在不斷的完善，乳腺癌腫瘤微環(huán)境中無數(shù)的腫瘤細胞和非惡性細胞，嵌入在富含糖蛋白的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)中，主要的細胞類型包括內(nèi)皮細胞、免疫細胞和癌相關成纖維細胞(cancer-related fibroblasts, CAFs)。ECM除了作為支持組織結構的物理支架，還是不同細胞類型之間的信號轉換器，并且其病變的硬度和纖維膠原的豐度提供促進腫瘤發(fā)生和進展的機制信號，在乳腺癌中，基質細胞因子，尤其是那些與ECM重建相關的因子，對化療反應有很強的預測作用[107~109]。腫瘤細胞會吸收微環(huán)境的基質成分以促進其進展，而腫瘤細胞命運則由激活轉錄級聯(lián)響應發(fā)育信號通路的細胞外信號決定，如Hedgehog (Hh)信號通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)[110,111]。Hh蛋白家族成員均由氨基端結構域(Hh-N)及羧基端結構域(Hh-C)組成，其中Hh-N有Hh蛋白的信號活性。乳腺癌主要表現(xiàn)為Hh-N依賴的通路激活，Hh-N與受體Ptc(Patched)結合，激活SMO (Smoothened)，活化的SMO介導轉錄因子Gli1轉位進入細胞核，驅動Hh靶基因的轉錄[112,113]。在乳腺癌不同亞型中Hh-N的表達被重新激活，尤其是預后差的三陰性乳腺癌(TNBC)，30%的TNBC具有旁分泌Hh通路特征[114]。Cazet等[115]在TNBC動物模型中發(fā)現(xiàn)CAFs是對Hh-N刺激做出反應的初級基質細胞。激活的CAFs反過來為腫瘤細胞獲得具有化學抗性的干細胞樣表型提供了有利環(huán)境，為獲得耐化療的癌干細胞(cancer stem cell, CSC)表型提供支持。在小鼠模型和I期臨床試驗患者中，使用SMO小分子抑制劑(inhibitor of SMO, SMOi)，如維莫德吉(Vismodegib)和索尼德吉(Sonidegib)，提高了腫瘤細胞對多西紫杉醇(docetaxel)的化療敏感性，降低了癌轉移并提高了生存率(圖2)。目前在TNBC動物模型中Hh信號以旁分泌的方式表達是很明顯的，針對微環(huán)境耐受良好的藥物種類有限，以及缺乏對微環(huán)境導向治療反應的生物標志物，要將抗基質治療納入乳腺癌治療的臨床進展還須進行詳細的研究。

圖2 乳腺癌依賴Hh信號通路的耐藥機制

靜息狀態(tài)下，受體Ptc與SMO不會相互作用(黑色停止箭頭)，當Hh-N與Ptc結合后，會激活SMO，活化的SMO介導轉錄因子Gli1入核，驅動靶基因轉錄，激活癌相關成纖維細胞，使腫瘤細胞獲得藥物抗性的干細胞樣表型(黑色箭頭)。SMOi抑制SMO活性，Gli1無法入核(紅色停止箭頭)，解除腫瘤細胞藥物抗性，提高對多西紫杉醇的化療敏感性(紅色箭頭)。

3 結語與展望

單細胞技術的迅速發(fā)展及其在單個細胞遺傳變異中的應用，極大地推動了生物醫(yī)學的發(fā)展。盡管如此，目前該技術及其衍生技術仍存在其一定的缺陷，有著很大的改進潛力。在整個單細胞測序的技術流程中，獲得單個具有活性的細胞樣本是保證后續(xù)文庫構建和測序數(shù)據(jù)質量的前提。目前單細胞捕獲的方法各有利弊，可以依據(jù)研究目的來選擇合適的實驗技術路線和方法，但無論何種方法，保證單細胞的活性和完整性是單細胞技術成功的最關鍵因素。在單細胞文庫構建的過程中，如何避免核酸丟失和擴增偏差，提高靈敏度和可重復性是其首要解決的問題[116]。可通過使用低吸附的離心管、添加DNase或 RNase抑制劑等以降低樣本的損失[42]。但對于DNA二級結構和RNA的反轉錄效率，則需要尋找新的聚合酶以提高二級結構的擴增效率，或新的逆轉錄酶以提高逆轉錄效率[41]。由于單細胞測序技術的多樣性，數(shù)據(jù)本身的稀疏和混亂，再加上材料樣本的低質量，擴增過程及測序的偏差，使單細胞測序數(shù)據(jù)的分析變的更加困難，如何提高分析通量和節(jié)約成本，如何獲得細胞的位置信息，尤其是測序數(shù)據(jù)中隱藏的非目標細胞，也是亟待解決的問題[116,117]。隨著單細胞測序技術的廣泛應用，細胞間的相關性和異質性逐漸變得清晰，反映在單細胞測序數(shù)據(jù)上的差異及如何與細胞功能相匹配是一個巨大的挑戰(zhàn)，這不僅依賴于每個細胞中特定轉錄本的穩(wěn)定性和半衰期，還與翻譯后修飾的速率和特異性相關[118]。隨著測序數(shù)據(jù)的海量增加，數(shù)據(jù)管理將成為一項復雜而繁瑣的任務，并面臨數(shù)據(jù)存儲、挖掘分析、系統(tǒng)整合等諸多挑戰(zhàn)。在未來，單細胞測序的多組學分析，能夠對正常的細胞功能和疾病演變進行詳盡的描述，因為其可以系統(tǒng)整合同一個單細胞的基因組、轉錄組、表觀組或蛋白質組等分析，全面了解每個細胞，將克隆結構和細胞亞型與基因變異和表型直接聯(lián)系起來。由于組織內(nèi)的位置是細胞識別的關鍵決定因素，保存細胞的空間位置信息尤為重要，空間轉錄組的發(fā)展會逐漸揭開細胞時空特異性的面紗。單細胞(測序)技術可繪制全面的細胞類型參考地圖，如果加上時間坐標，有利于在細胞層面繪制健康和疾病的全景圖像，以及對疾病本質的深入理解，將為人們實現(xiàn)真正的精準醫(yī)療和個體化治療奠定基礎。

當前乳腺癌單細胞測序主要的問題集中在樣本的收集和制備，因為多數(shù)的腫瘤樣本都是經(jīng)過冷凍，這樣就不能保證細胞膜的完整性。同時，腫瘤組織在裂解成為單細胞懸液的過程中可能會發(fā)生細胞表面分子的改變。這些都會影響最終的數(shù)據(jù)分析，尤其是對每個細胞的功能注釋。

基于單細胞測序技術以全面剖析乳腺癌的特征，已取得相當大的進步。單細胞亞克隆異質性的研究為乳腺癌亞克隆頻率及其演變提供了新的細節(jié)，基本描述了乳腺腫瘤生態(tài)系統(tǒng)復雜的細胞表型，以及腫瘤生態(tài)系統(tǒng)各組成部分之間的關系，為人們提供了較為全面的乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)的圖譜。針對乳腺癌的單細胞測序顯示拷貝數(shù)的進化發(fā)生在腫瘤進化的早期，而點突變隨著時間的推移逐漸進化，產(chǎn)生更廣泛的克隆多樣性，為乳腺癌腫瘤進化的交叉分枝模型提供了支持。在乳腺癌個體患者中，非浸潤性導管原位癌與鄰近浸潤性導管癌病變之間存在直接的譜系關系，大多數(shù)的突變和拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)侵襲之前已在導管內(nèi)完成，并具有多個突變和CNVs克隆體從導管逃逸，共同遷移到鄰近組織，形成侵襲性癌。乳腺癌的耐藥性是由選擇罕見的預先存在的克隆引起的，還是通過誘導新的突變產(chǎn)生獲得性耐藥性引起的一直備受爭議。新輔助化療前后乳腺癌患者的縱向樣本的單細胞DNA測序表明，耐藥基因型是預先存在的，是化療選擇的。盡管可以識別出表達與化療耐藥性相關的單個基因的細胞亞群，但具有耐藥程序的細胞在治療前無法檢測到。這些數(shù)據(jù)表明，乳腺癌從發(fā)生到治療，不斷進化(演化)過程中存在明顯的異質性，為人們更好地理解乳腺癌的發(fā)生、轉移和耐藥提供了證據(jù)。

對乳腺癌中同一個細胞整合基因組、表觀基因組、轉錄組和/或蛋白質組的分析，可以全面了解每個細胞的功能和在疾病進化過程中的所扮演的角色。在未來，針對乳腺癌單細胞的多組學分析，并結合細胞分子成像等技術，從乳腺癌的遺傳異質性、非遺傳異質性，到耐藥異質性，再到整個腫瘤微環(huán)境異質性，為繪制更加精確的乳腺癌細胞圖譜提供支持，加深對乳腺癌演化規(guī)律的理解。同時，探索和發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中的分子標記，并為治療干預提供候選的靶標分子，以及進一步開發(fā)精確的藥物非常有益，為乳腺癌的免疫治療提供新的策略?？紤]到每個人的遺傳(基因)、環(huán)境和生活方式等個體差異，單細胞技術(測序)有望實現(xiàn)乳腺癌的個體化診治，對個體的早診早治和預測預防具有重要的科學意義和應用價值。

[1] Yu TL, Cai DL, Zhu GF, Ye XJ, Min TS, Chen HY, Lu DR, Chen HM. Effects of CSN4 knockdown on proli-feration and apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells., 2019, 41(4): 318–326.余同露, 蔡棟梁, 朱根鳳, 葉曉娟, 閔太善, 陳紅巖, 盧大儒, 陳浩明. CSN4基因干擾對乳腺癌MDA-MB- 231細胞增殖和凋亡的影響. 遺傳, 2019, 41(4): 318– 326.

[2] Boyle P, Levin B. World Cancer Report 2008. Lyon: IARC Press, 2008.

[3] Yao CB, Zhou X, Chen CS, Lei QY. The regulatory mechanisms and functional roles of the Hippo signaling pathway in breast cancer., 2017, 39(7): 617–629.姚傳波, 周鑫, 陳策實, 雷群英. Hippo信號通路在乳腺癌中的調控機制及作用. 遺傳, 2017, 39(7): 617– 629.

[4] Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer., 2000, 100(1): 57–70.

[5] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation., 2011, 144(5): 646–674.

[6] Stephens PJ, Tarpey PS, Davies H, Van Loo P, Greenman C, Wedge DC, Nik-Zainal S, Martin S, Varela I, Bignell GR, Yates LR, Papaemmanuil E, Beare D, Butler A, Cheverton A, Gamble J, Hinton J, Jia M, Jayakumar A, Jones D, Latimer C, Lau KW, McLaren S, McBride DJ, Menzies A, Mudie L, Raine K, Rad R, Chapman MS, Teague J, Easton D, Langer?d A, Lee MT, Shen CY, Tee BT, Huimin BW, Broeks A, Vargas AC, Turashvili G, Martens J, Fatima A, Miron P, Chin SF, Thomas G, Boyault S, Mariani O, Lakhani SR, van de Vijver M, van 't Veer L, Foekens J, Desmedt C, Sotiriou C, Tutt A, Caldas C, Reis-Filho JS, Aparicio SA, Salomon AV, B?rresen-Dale AL, Richardson AL, Campbell PJ, Futreal PA, Stratton MR. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer., 2012, 486(7403): 400–404.

[7] Shah SP, Roth A, Goya R, Oloumi A, Ha G, Zhao Y, Turashvili G, Ding J, Tse K, Haffari G, Bashashati A, Prentice LM, Khattra J, Burleigh A, Yap D, Bernard V, McPherson A, Shumansky K, Crisan A, Giuliany R, Heravi-Moussavi A, Rosner J, Lai D, Birol I, Varhol R, Tam A, Dhalla N, Zeng T, Ma K, Chan SK, Griffith M, Moradian A, Cheng SW, Morin GB, Watson P, Gelmon K, Chia S, Chin SF, Curtis C, Rueda OM, Pharoah PD, Damaraju S, Mackey J, Hoon K, Harkins T, Tadigotla V, Sigaroudinia M, Gascard P, Tlsty T, Costello JF, Meyer IM, Eaves CJ, Wasserman WW, Jones S, Huntsman D, Hirst M, Caldas C, Marra MA, Aparicio S. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple- negative breast cancers., 2012, 486(7403): 395– 399.

[8] Baslan T, Kendall J, Rodgers L, Cox H, Riggs M, Stepansky A, Troge J, Ravi K, Esposito D, Lakshmi B, Wigler M, Navin N, Hicks J. Genome-wide copy number analysis of single cells., 2012, 7(6): 1024–1041.

[9] Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell., 2012, 338(6114): 1622– 1626.

[10] Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Math M, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, Martinez P, Matthews N, Stewart A, Tarpey P, Varela I, Phillimore B, Begum S, McDonald NQ, Butler A, Jones D, Raine K, Latimer C, Santos CR, Nohadani M, Eklund AC, Spencer-Dene B, Clark G1, Pickering L, Stamp G, Gore M, Szallasi Z, Downward J, Futreal PA, Swanton C. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing., 2012, 366(10): 883–892.

[11] Yates LR, Campbell PJ. Evolution of the cancer genome., 2012, 13(11): 795–806.

[12] Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA Jr, Kinzler KW. Cancer genome landscapes., 2013, 339(6127): 1546–1558.

[13] Sethi N, Kang Y. Unravelling the complexity of metastasis—molecular understanding and targeted therapies.,2011, 11(10): 735–748.

[14] Lee W, Jiang Z, Liu J, Haverty PM, Guan Y, Stinson J, Yue P, Zhang Y, Pant KP, Bhatt D, Ha C, Johnson S, Kennemer MI, Mohan S, Nazarenko I, Watanabe C, Sparks AB, Shames DS, Gentleman R, de Sauvage FJ, Stern H, Pandita A, Ballinger DG, Drmanac R, Modrusan Z, Seshagiri S, Zhang Z. The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient., 2010, 465(7297): 473–477.

[15] Clark J, Attard G, Jhavar S, Flohr P, Reid A, De-Bono J, Eeles R, Scardino P, Cuzick J, Fisher G, Parker MD, Foster CS, Berney D, Kovacs G, Cooper CS. Complex patterns of ETS gene alteration arise during cancer development in the human prostate., 2008, 27(14): 1993–2003.

[16] Wang Y, Waters J, Leung ML, Unruh A, Roh W, Shi X, Chen K, Scheet P, Vattathil S, Liang H, Multani A, Zhang H, Zhao R, Michor F, Meric-Bernstam F, Navin NE. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing., 2014, 512(7513): 155–160.

[17] Navin N, Kendall J, Troge J, Andrews P, Rodgers L, McIndoo J, Cook K, Stepansky A, Levy D, Esposito D, Muthuswamy L, Krasnitz A, McCombie WR, Hicks J, Wigler M. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing., 2011, 472(7341): 90–94.

[18] Liu W, Hou YF, Chen HH, Wei HD, Lin WR, Li JC, Zhang M, He FC, Jiang Y. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies., 2011, 11(17): 3556– 3564.

[19] Dorrell C, Erker L, Lanxon-Cookson KM, Abraham SL, Victoroff T, Ro S, Canaday PS, Streeter PR, Grompe M. Surface markers for the murine oval cell response., 2008, 48(4): 1282–1291.

[20] Su XB, Shi Y, Zou X, Lu ZN, Xie GC, Yang JYH, Wu CC, Cui XF, He KY, Luo Q, Qu YL, Wang N, Wang L, Han ZG. Single-cell RNA-seq analysis reveals dynamic trajectories during mouse liver development., 2017, 18(1): 946.

[21] Der E, Ranabothu S, Suryawanshi H, Akat KM, Clancy R, Morozov P, Kustagi M, Czuppa M, Izmirly P, Belmont HM, Wang T, Jordan N, Bornkamp N, Nwaukoni J, Martinez J, Goilav B, Buyon JP, Tuschl T, Putterman C. Single cell RNA sequencing to dissect the molecular heterogeneity in lupus nephritis., 2017, 2(9): 93009.

[22] Autengruber A, Gereke M, Hansen G, Hennig C, Bruder D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function., 2012, 2(2): 112– 120.

[23] Baron M, Veres A, Wolock SL, Faust AL, Gaujoux R, Vetere A, Ryu JH, Wagner BK, Shen-Orr SS, Klein AM, Melton DA, Yanai I. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra- cell population structure., 2016, 3(4): 346– 360.e4.

[24] Muraro MJ, Dharmadhikari G, Grün D, Groen N, Dielen T, Jansen E, van Gurp L, Engelse MA, Carlotti F, de Koning EJ, van Oudenaarden A. A single-cell trans-criptome atlas of the human pancreas., 2016, 3(4): 385–394.

[25] Wollny D, Zhao S, Everlien I, Lun XK, Brunken J, Brüne D, Ziebell F, Tabansky I, Weichert W, Marciniak- Czochra A, Martin-Villalba A. Single-cell analysis uncovers clonal acinar cell heterogeneity in the adult pancreas., 2016, 39(3): 289–301.

[26] Li D, Peng SY, Zhang ZW, Feng RC, Li L, Liang J, Tai S, Teng CB. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-EDTA digestion., 2013, 14(7): 596–603.

[27] Treutlein B, Brownfield DG, Wu AR, Neff NF, Mantalas GL, Espinoza FH, Desai TJ, Krasnow MA, Quake SR. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq., 2014, 509(7500): 371–375.

[28] Chapman HA, Li X, Alexander JP, Brumwell A, Lorizio W, Tan K, Sonnenberg A, Wei Y, Vu TH. Integrin α6β4 identifies an adult distal lung epithelial population with regenerative potential in mice., 2011, 121(7): 2855–2862.

[29] Xu Y, Mizuno T, Sridharan A, Du Y, Guo M, Tang J, Wikenheiser-Brokamp KA, Perl AT, Funari VA, Gokey JJ, Stripp BR, Whitsett JA. Single-cell RNA sequencing identifies diverse roles of epithelial cells in idiopathic pulmonary fibrosis., 2016, 1(20): e90558.

[30] Joost S, Zeisel A, Jacob T, Sun X, La Manno G, L?nnerberg P, Linnarsson S, Kasper M. Single-cell transcriptomics reveals that differentiation and spatial signatures shape epidermal and hair follicle heterogeneity., 2016, 3(3): 221–237.

[31] Shekhar K, Lapan SW, Whitney IE, Tran NM, Macosko EZ, Kowalczyk M, Adiconis X, Levin JZ, Nemesh J, Goldman M, McCarroll SA, Cepko CL, Regev A, Sanes JR. Comprehensive classification of retinal bipolar neurons by single-cell transcriptomics., 2016, 166(5): 1308–1323.

[32] Daniszewski M, Senabouth A, Nguyen QH, Crombie DE, Lukowski SW, Kulkarni T, Sluch VM, Jabbari JS, Chamling X, Zack DJ, Pébay A, Powell JE, Hewitt AW. Single cell RNA sequencing of stem cell-derived retinal ganglion cells., 2018, 5: 180013.

[33] Lafzi A, Moutinho C, Picelli S, Heyn H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies., 2018, 13(12): 2742–2757.

[34] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for single-cell isolation.Int J Mol , 2015, 16(8): 16897–16919.

[35] Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell., 2012, 338(6114): 1622– 1626.

[36] Gole J, Gore A, Richards A, Chiu YJ, Fung HL, Bushman D, Chiang HI, Chun J, Lo YH, Zhang K. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells., 2013, 31(12): 1126.

[37] Grün D, Van Oudenaarden A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments., 2015, 163(4): 799–810.

[38] Ellsworth DL, Blackburn HL, Shriver CD, Rabizadeh S, Soon-Shiong P, Ellsworth RE. Single-cell sequencing and tumorigenesis: improved understanding of tumor evolution and metastasis., 2017, 6(1): 15.

[39] Islam S, Zeisel A, Joost S, La Manno G, Zajac P, Kasper M, L?nnerberg P, Linnarsson S. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers., 2014, 11(2): 163–166.

[40] Zheng GX, Terry JM, Belgrader P, Ryvkin P, Bent ZW, Wilson R, Ziraldo SB, Wheeler TD, McDermott GP, Zhu J, Gregory MT, Shuga J, Montesclaros L, Underwood JG, Masquelier DA, Nishimura SY, Schnall-Levin M, Wyatt PW, Hindson CM, Bharadwaj R, Wong A, Ness KD, Beppu LW, Deeg HJ, McFarland C, Loeb KR, Valente WJ, Ericson NG, Stevens EA, Radich JP, Mikkelsen TS, Hindson BJ, Bielas JH. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells., 2017, 8: 14049.

[41] Valihrach L, Androvic P, Kubista M. Platforms for single-cell collection and analysis. Int J Mol , 2018, 19(3): 807.

[42] Liang JL, Cai WS, Sun ZH. Single-cell sequencing technologies: current and future., 2014, 41(10): 513–528.

[43] Hodne K, Weltzien FA. Single-cell isolation and gene analysis: pitfalls and possibilities.Int J Mol , 2015, 16(11): 26832–26849.

[44] Cheng L, Zhang S, MacLennan GT, Williamson SR, Davidson DD, Wang M, Jones TD, Lopez-Beltran A, Montironi R. Laser-assisted microdissection in trans-lational research: theory, technical considerations, and future applications., 2013, 21(1): 31–47.

[45] Yao YX, La YF, Di R, Liu QY, Hu WP, Wang XY, Chu MX. Comparison of different single cell whole genome amplification methods and MALBAC applications in assisted reproduction., 2018, 40(8): 620–631.姚雅馨, 喇永富, 狄冉, 劉秋月, 胡文萍, 王翔宇, 儲明星. 不同單細胞全基因組擴增方法的比較及MALBAC在輔助生殖中的應用. 遺傳, 2018, 40(8): 620–631.

[46] Cai HQ, Liu HT, Shi B, Li A, Tang WR, Luo Y. Recent Advance of Whole Genome Amplification and its Application prospect in Forensic Individual Identification., 2010, 32(11): 1119–1125.蔡海強, 柳海濤, 史斌, 李安, 唐文如, 羅瑛. 全基因組擴增技術及其在法醫(yī)個體識別中的應用. 遺傳, 2010, 32(11): 1119–1125.

[47] Troutt AB, McHeyzer-Williams MG, Pulendran B, Nossal GJ. Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity., 1992, 89(20): 9823–9825.

[48] Zhang L, Cui X, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis., 1992, 89(13): 5847–5851.

[49] Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskj?ld M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide- primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer., 1992, 13(3): 718–725.

[50] Cheung VG, Nelson SF. Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA., 1996, 93(25): 14676–14679.

[51] Dean FB, Hosono S, Fang LH, Wu XH, Faruqi AF, Bray-Ward P, Sun ZY, Zong QL, Du YF, Du J, Driscoll M, Song WM, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification., 2002, 99(8): 5261–5266.

[52] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, Lasken RS. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification., 2001, 11(6): 1095–1099.

[53] Lasken RS. Single-cell sequencing in its prime., 2013, 31(3): 211–212.

[54] Cohen AA, Geva-Zatorsky N, Eden E, Frenkel- Morgenstern M, Issaeva I, Sigal A, Milo R, Cohen- Saidon C, Liron Y, Kam Z, Cohen L, Danon T, Perzov N, Alon U. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug., 2008, 322(5907): 1511– 1516.

[55] Raj A, van Oudenaarden A. Single-molecule approaches to stochastic gene expression.,2009, 38: 255–270.

[56] Tang FC, Barbacioru C, Nordman E, Li B, Xu NL, Bashkirov VI, Lao KQ, Surani MA. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell., 2010, 5(3): 516–535.

[57] Tang FC, Barbacioru C, Wang YZ, Nordman E, Lee C, Xu NL, Wang XH, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao KQ, Surani MA. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell., 2009, 6(5): 377–382.

[58] Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, Imai T, Ueda HR. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity., 2013, 14(4): R31.

[59] Fan XY, Zhang XN, Wu XL, Guo HS, Hu YQ, Tang FC, Huang YY. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos., 2015, 16(1): 14.

[60] Sheng KW, Cao WJ, Niu YC, Deng Q, Zong CH. Effective detection of variation in single-cell transcriptomes using MATQ-seq., 2017, 14(3): 267–270.

[61] Islam S, Kj?llquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, L?nnerberg P, Linnarsson S. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq., 2011, 21(7): 1160.

[62] Islam S, Kj?llquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, L?nnerberg P, Linnarsson S. Highly multiplexed and strand-specific single-cell RNA 5' end sequencing., 2012, 7(5): 813–828.

[63] Picelli S, Faridani OR, Bj?rklund AK, Winberg G, Sagasser S, Sandberg R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2., 2014, 9(1): 171–181.

[64] Petersen M, Wengel J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics., 2003, 21(2): 74–81.

[65] Vester B, Wengel J. LNA (Locked nucleic acid): high-affinity targeting of complementary RNA and DNA., 2004, 43(42): 13233–13241.

[66] Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets., 2015, 161(5): 1202–1214.

[67] Islam S, Kj?llquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, L?nnerberg P, Linnarsson S. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq., 2011, 21(7): 1160–1167.

[68] Hochgerner H, L?nnerberg P, Hodge R, Mikes J, Heskol A, Hubschle H, Lin P, Picelli S, La Manno G, Ratz M, Dunne J, Husain S, Lein E, Srinivasan M, Zeisel A, Linnarsson S. STRT-seq-2i: dual-index 5′ single cell and nucleus RNA-seq on an addressable microwell array., 2017, 7(1): 16327.

[69] Soumillon M, Cacchiarelli D, Semrau S, van Oudenaarden A, Mikkelsen TS. Characterization of directed differen-tiation by high-throughput single-cell RNA-Seq., 2014, https://doi.org/10.1101/003236.

[70] Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-Seq: single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification., 2012, 2(3): 666–673.

[71] Shapiro E, Biezuner T, Linnarsson S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole- organism science., 2013, 14(9): 618–630.

[72] Hashimshony T, Senderovich N, Avital G, Klochendler A, de Leeuw Y, Anavy L, Gennert D, Li SQ, Livak KJ, Rozenblatt-Rosen O, Dor Y, Regev A, Yanai I. CEL- Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq., 2016, 17: 77.

[73] Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, Peshkin L, Weitz DA, Kirschner MW. Droplet barcoding for single-cell Transcriptomics applied to embryonic stem cells., 2015, 161(5): 1187–1201.

[74] Jaitin DA, Kenigsberg E, Keren-Shaul H, Elefant N, Paul F, Zaretsky I, Mildner A, Cohen N, Jung S, Tanay A, Amit I. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types., 2014, 343(6172): 776–779.

[75] Guo HS, Zhu P, Wu XL, Li XL, Wen L, Tang FC. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing., 2013, 23(12): 2126–2135.

[76] Smallwood SA, Lee HJ, Angermueller C, Krueger F, Saadeh H, Peat J, Andrews SR, Stegle O, Reik W, Kelsey G. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity., 2014, 11(8): 817–820.

[77] Grosselin K, Durand A, Marsolier J, Poitou A, Marangoni E, Nemati F, Dahmani A, Lameiras S, Reyal F, Frenoy O, Pousse Y, Reichen M, Woolfe A, Brenan C, Griffiths AD, Vallot C, Gérard A. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer., 2019, 51(6): 1060– 1066.

[78] Buenrostro JD, Wu B, Litzenburger UM, Ruff D, Gonzales ML, Snyder MP, Chang HY, Greenleaf WJ. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation., 2015, 523(7561): 486–490.

[79] Cusanovich DA, Daza R, Adey A, Pliner HA, Christiansen L, Gunderson KL, Steemers FJ, Trapnell C, Shendure J. Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing., 2015, 348(6237): 910–914.

[80] St?hl PL, Salmén F, Vickovic S, Lundmark A, Navarro JF, Magnusson J, Giacomello S, Asp M, Westholm JO, Huss M, Mollbrink A, Linnarsson S, Codeluppi S, Borg A, Pontén F, Costea PI, Sahlén P, Mulder J, Bergmann O, Lundeberg J, Frisén J. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial trans-criptomics., 2016, 353(6294): 78–82.

[81] Wang Y, Waters J, Leung ML, Unruh A, Roh W, Shi XQ, Chen K, Scheet P, Vattathil S, Liang H, Multani A, Zhang H, Zhao R, Michor F, Meric-Bernstam F, Navin NE. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing., 2014, 512(7513): 155–160.

[82] Gao RL, Kim C, Sei E, Foukakis T, Crosetto N, Chan LK, Srinivasan M, Zhang H, Meric-Bernstam F, Navin N. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer., 2017, 8(1): 228.

[83] Chung W, Eum HH, Lee HO, Lee KM, Lee HB, Kim KT, Ryu HS, Kim S, Lee JE, Park YH, Kan Z, Han W, Park WY. Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary breast cancer., 2017, 8: 15081.

[84] Allred DC, Wu Y, Mao S, Nagtegaal ID, Lee S, Perou CM, Mohsin SK, O’Connell P, Tsimelzon A, Medina D. Ductal carcinoma in situ and the emergence of diversity during breast cancer evolution., 2008, 14(2): 370–378.

[85] Virnig BA, Tuttle TM, Shamliyan T, Kane RL. Ductal carcinoma in situ of the breast: a systematic review of incidence, treatment, and outcomes.J Nati Inst, 2010, 102(3): 170–178.

[86] Gao RL, Davis A, McDonald TO, Sei E, Shi XQ, Wang Y, Tsai PC, Casasent A, Waters J, Zhang H, Meric- Bernstam F, Michor F, Navin NE. Punctuated copy number evolution and clonal stasis in triple-negative breast cancer., 2016, 48(10): 1119–1130.

[87] Shah SP, Roth A, Goya R, Oloumi A, Ha G, Zhao Y, Turashvili G, Ding J, Tse K, Haffari G, Bashashati A, Prentice LM, Khattra J, Burleigh A, Yap D, Bernard V, McPherson A, Shumansky K, Crisan A, Giuliany R, Heravi-Moussavi A, Rosner J, Lai D, Birol I, Varhol R, Tam A, Dhalla N, Zeng T, Ma K, Chan SK, Griffith M, Moradian A, Cheng SW, Morin GB, Watson P, Gelmon K, Chia S, Chin SF, Curtis C, Rueda OM, Pharoah PD, Damaraju S, Mackey J, Hoon K, Harkins T, Tadigotla V, Sigaroudinia M, Gascard P, Tlsty T, Costello JF, Meyer IM, Eaves CJ, Wasserman WW, Jones S, Huntsman D, Hirst M, Caldas C, Marra MA, Aparicio S. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple- negative breast cancers., 2012, 486(7403): 395– 399.

[88] Yates LR, Gerstung M, Knappskog S, Desmedt C, Gundem G, Van Loo P, Aas T, Alexandrov LB, Larsimont D, Davies H, Li Y, Ju YS, Ramakrishna M, Haugland HK, Lilleng PK, Nik-Zainal S, McLaren S, Butler A, Martin S, Glodzik D, Menzies A, Raine K, Hinton J, Jones D, Mudie LJ, Jiang B, Vincent D, Greene-Colozzi A, Adnet PY, Fatima A, Maetens M, Ignatiadis M, Stratton MR, Sotiriou C, Richardson AL, L?nning PE, Wedge DC, Campbell PJ. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing., 2015, 21(7): 751–759.

[89] Casasent AK, Schalck A, Gao R, Sei E, Long A, Pangburn W, Casasent T, Meric-Bernstam F, Edgerton ME, Navin NE. Multiclonal invasion in breast tumors identified by topographic single cell sequencing., 2018, 172(1–2): 205–217.e12.

[90] McAllister SS, Weinberg RA. Tumor-host interactions: a far-reaching relationship., 2010, 28(26): 4022–4028.

[91] Gerdes MJ, G?kmen-Polar Y, Sui Y, Pang AS, LaPlante N, Harris AL, Tan PH, Ginty F, Badve SS. Single-cell heterogeneity in ductal carcinoma in situ of breast., 2018, 31(3): 406–417.

[92] Wagner J, Rapsomaniki MA, Chevrier S, Anzeneder T, Langwieder C, Dykgers A, Rees M, Ramaswamy A, Muenst S, Soysal SD, Jacobs A, Windhager J, Silina K, van den Broek M, Dedes KJ, Rodríguez Martínez M, Weber WP, Bodenmiller B. A single-cell atlas of the tumor and immune ecosystem of human breast cancer., 2019, 177(5): 1–16.

[93] Azizi E, Carr AJ, Plitas G, Cornish AE, Konopacki C, Prabhakaran S, Nainys J, Wu K, Kiseliovas V, Setty M, Choi K, Fromme RM, Dao P, McKenney PT, Wasti RC, Kadaveru K, Mazutis L, Rudensky AY, Pe'er D. Single-Cell Map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment., 2018, 174(5): 1293–1308.e36.

[94] Ruffell B, Au A, Rugo HS, Esserman LJ, Hwang ES, Coussens LM. Leukocyte composition of human breast cancer., 2012, 109(8): 2796– 2801.

[95] Savas P, Virassamy B, Ye C, Salim A, Mintoff CP, Caramia F, Salgado R, Byrne DJ, Teo ZL, Dushyanthen S, Byrne A, Wein L, Luen SJ, Poliness C, Nightingale SS, Skandarajah AS, Gyorki DE, Thornton CM, Beavis PA, Fox SB, Kathleen, Darcy PK, Speed TP, Mackay LK, Neeson PJ, Loi S. Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis., 2018, 24(7): 986–993.

[96] Noy R, Pollard JW. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy., 2014, 41(1): 49–61.

[97] Qian BZ, Pollard JW. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis., 2010, 141(1): 39–51.

[98] Ruffell B, Chang-Strachan D, Chan V, Rosenbusch A, Ho CM, Pryer N, Daniel D, Hwang ES, Rugo HS, Coussens LM. Macrophage IL-10 blocks CD8+ T cell-dependent responses to chemotherapy by suppressing IL-12 expression in intratumoral dendritic cells., 2014, 26(5): 623–637.

[99] Ugel S, De Sanctis F, Mandruzzato S, Bronte V. Tumor- induced myeloid deviation: when myeloid-derived suppressor cells meet tumor-associated macrophages., 2015, 125(9): 3365–3376.

[100] Solinas G, Germano G, Mantovani A, Allavena P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation., 2009, 86(5): 1065–1073.

[101] Racioppi L, Nelson ER, Huang W, Mukherjee D, Lawrence SA, Lento W, Masci AM, Jiao Y, Park S, York B, Liu YP, Baek AE, Drewry DH, Zuercher WJ, Bertani FR, Businaro L, Geradts J, Hall A, Means AR, Chao N, Chang CY, McDonnell DP. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microe-nvironment in breast cancer., 2019, 10(1): 2450.

[102] Roth A, McPherson A, Laks E, Biele J, Yap D, Wan A, Smith MA, Nielsen CB, McAlpine JN, Aparicio S, Bouchard-C?té A, Shah SP. Clonal genotype and population structure inference from single-cell tumor sequencing., 2016, 13(7): 573–576.

[103] Nik-Zainal S, Van Loo P, Wedge DC, Alexandrov LB, Greenman CD, Lau KW, Raine K, Jones D, Marshall J, Ramakrishna M, Shlien A, Cooke SL, Hinton J, Menzies A, Stebbings LA, Leroy C, Jia M, Rance R, Mudie LJ, Gamble SJ, Stephens PJ, McLaren S, Tarpey PS, Papaemmanuil E, Davies HR, Varela I, McBride DJ, Bignell GR, Leung K, Butler AP, Teague JW, Martin S, J?nsson G, Mariani O, Boyault S, Miron P, Fatima A, Langer?d A, Aparicio SA, Tutt A, Sieuwerts AM, Borg ?, Thomas G, Salomon AV, Richardson AL, B?rresen- Dale AL, Futreal PA, Stratton MR, Campbell PJ. The life history of 21 breast cancers., 2012, 149(5): 994–1007.

[104] McGranahan N, Swanton C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future., 2017, 168(4): 613–628.

[105] Dagogo-Jack I, Shaw AT. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies., 2018, 15(2): 81–94.

[106] Kim C, Gao R, Sei E, Brandt R, Hartman J, Hatschek T, Crosetto N, Foukakis T, Navin NE. Chemoresistance evolution in triple-negative breast cancer delineated by single-cell sequencing., 2018, 173(4): 879–893.e13.

[107] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation., 2011, 144(5): 646–674.

[108] Levental KR, Yu H, Kass L, Lakins JN, Egeblad M, Erler JT, Fong SF, Csiszar K, Giaccia A, Weninger W, Yamauchi M, Gasser DL, Weaver VM. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling., 2009, 139(5): 891–906.

[109] Laklai H, Miroshnikova YA, Pickup MW, Collisson EA, Kim GE, Barrett AS, Hill RC, Lakins JN, Schlaepfer DD, Mouw JK, LeBleu VS, Roy N, Novitskiy SV, Johansen JS, Poli V, Kalluri R, Iacobuzio-Donahue CA, Wood LD, Hebrok M, Hansen K, Moses HL, Weaver VM. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression., 2016, 22(5): 497–505.

[110] Perrimon N, Pitsouli C, Shilo BZ. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning., 2012, 4(8): a005975.

[111] Wiseman BS, Werb Z. Stromal effects on mammary gland development and breast cancer., 2002, 296(5570): 1046–1049.

[112] Hui M, Cazet A, Nair R, Watkins DN, O'Toole SA, Swarbrick A. The Hedgehog signalling pathway in breast development, carcinogenesis and cancer therapy., 2013, 15(2): 203.

[113] Amakye D, Jagani Z, Dorsch M. Unraveling the therapeutic potential of the Hedgehog pathway in cancer., 2013, 19(11): 1410–1422.

[114] O'Toole SA, Machalek DA, Shearer RF, Millar EK, Nair R, Schofield P, McLeod D, Cooper CL, McNeil CM, McFarland A, Nguyen A, Ormandy CJ, Qiu MR, Rabinovich B, Martelotto LG, Vu D, Hannigan GE, Musgrove EA, Christ D, Sutherland RL, Watkins DN, Swarbrick A. Hedgehog overexpression is associated with stromal interactions and predicts for poor outcome in breast cancer., 2011, 71(11): 4002–4014.

[115] Cazet AS, Hui MN, Elsworth BL, Wu SZ, Roden D, Chan CL, Skhinas JN, Collot R, Yang J, Harvey K, Johan MZ, Cooper C, Nair R, Herrmann D, McFarland A, Deng N, Ruiz-Borrego M, Rojo F, Trigo JM, Bezares S, Caballero R, Lim E, Timpson P, O'Toole S, Watkins DN, Cox TR, Samuel MS, Martín M, Swarbrick A. Targeting stromal remodeling and cancer stem cell plasticity overcomes chemoresistance in triple negative breast cancer., 2018, 9(1): 2897.

[116] Wen L, Tang FC. Recent progress in single-cell RNA-Seq analysis., 2014, 36(11): 1069–1076.文路, 湯富酬. 單細胞轉錄組高通量測序分析新進展. 遺傳, 2014, 36(11): 1069–1076.

[117] Kulkarni A, Anderson AG, Merullo DP, Konopka G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications., 2019, 58: 129–136.

[118] Hedlund E, Deng QL. Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications., 2018, 59: 36–46.

Single-cell sequencing and its application in breast cancer

Qiang Zhang, Mingliang Gu

Breast cancer originates from ducts and epithelial cells, and gradually develops from hyperplasia to atypical hyperplasia,(adeno) carcinoma, to early and advanced invasive carcinoma. Traditional high-throughput sequencing mainly aims to identify candidate ‘driver genes’ attributable to development and progression of breast cancer, which has deficiencies in characterizing genomic structure alteration and subclone evolution, and thus ignores intratumoral, intertumoral or interpatient heterogeneity. The single-cell sequencing technology analyzes transcriptome (e.g., gene copy number and gene expression), explores cellular composition, differentiation and fate, fine-maps the tumor microenviron-ment, and provides supporting evidence for accurate stratification as well as personalized, precise therapy. At the same time, a complex relationship between breast cancer cells and T cells, macrophages and other immune cells can be revealed, thus facilitating discovery of new therapeutic targets and immune checkpoints. Here, we review state-of-the-art single-cell sequencing technologies and its application in breast cancer, in order to decipher multi-faceted alterations in the crosstalk/interactions between tumors and its microenvironments at the single-cell level, and provide a basis for better understanding of complicated pathogenesis and new avenues for immunotherapy.

single-cell sequencing; breast cancer; tumor microenvironment; immunotherapy

2019-10-25;

2020-02-03

國家重點研發(fā)計劃“干細胞及轉化研究”重點專項(編號：2018YFA0109500)和山東省自然科學基金青年基金項目(編號：ZR2019QH009)資助[Supported by the National Key R&D Program of China (No.2018YFA0109500), and the Youth Fund of Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2019QH009)]

張強，碩士，實習研究員，研究方向：分子遺傳學。E-mail: qiangzhang17@yeah.net

顧明亮，碩士，特聘教授，研究方向：遺傳學與基因組學。E-mail: minglianggu@hotmai.com; guml@big.ac.cn

10.16288/j.yczz.19-268

2020/1/17 17:18:05

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200117.0949.002.html

(責任編委: 孫玉潔)