杜坤，毛初陽，任安勇，吳雪梅，李慶玲，陳婷婷，陳仕毅，賴松家

研究報告

家兔前體脂肪細胞分化不同時期基因表達譜分析

杜坤，毛初陽，任安勇，吳雪梅，李慶玲，陳婷婷，陳仕毅，賴松家

四川農(nóng)業(yè)大學，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130

脂肪的過度積累嚴重危害人類健康。前體脂肪細胞分化是脂肪發(fā)育的關(guān)鍵過程，研究前體脂肪細胞分化相關(guān)基因的表達有助于認識脂肪沉積的機理。盡管家兔是一種理想的研究脂肪發(fā)育的動物模型，但是針對其前體脂肪細胞分化不同時期基因表達譜的研究鮮見報道。本研究通過誘導(dǎo)家兔前體脂肪細胞分化，在分化第0 d、3 d和9 d收集脂肪細胞，利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)，在分化第3 d樣本與第0 d樣本的比較中篩選出1352個差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，在分化第9 d樣本與第3 d樣本的比較中篩選出888個DEGs。GO (gene ontology)功能富集和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析發(fā)現(xiàn)，0~3 d分化期上調(diào)的DEGs顯著富集在信號通路和信號通路上，3~9 d分化期上調(diào)的DEGs顯著富集到與細胞周期調(diào)控有關(guān)的GO條目和KEGG信號通路，0~3 d和3~9 d階段特異上調(diào)的DEGs可能分別作用于細胞質(zhì)和細胞核。通過DEGs的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，篩選出的核心節(jié)點(hub node)基因可能通過調(diào)控細胞周期而影響家兔前體脂肪細胞分化。

脂肪細胞；分化；家兔；前體脂肪細胞；RNA-seq

人體脂肪的過度積累與2型糖尿病和心腦血管疾病的形成密切相關(guān)[1,2]，嚴重威脅人類健康。脂肪組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有高度的活性和內(nèi)分泌功能，其發(fā)育過程在細胞水平上主要體現(xiàn)為前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞[3]，該過程伴隨著脂肪細胞體積的增大和脂質(zhì)的逐漸累積[4]，是脂肪發(fā)育的關(guān)鍵過程。前體脂肪細胞分化過程十分復(fù)雜，受多種激素、信號通路和細胞間通信等因素的綜合調(diào)控[5~7]。盡管目前對前體脂肪細胞分化過程的具體調(diào)控機理尚不完全清楚，但是人們普遍認為(peroxisome proliferator activated receptor gamma)[8,9]、(CCAAT/En-hancer binding protein alpha)[10]和(fatty acid bin-ding protein)[11]等轉(zhuǎn)錄因子在前體脂肪細胞分化啟動過程中發(fā)揮重要作用。脂肪的生成需要大量的基因參與，研究前體脂肪細胞分化相關(guān)基因的表達對于認識脂肪沉積具有重要意義。近年來，研究證實了一些基因如、和等可以在特定分化階段調(diào)控脂肪細胞分化[12~14]，表明這些參與調(diào)控前體脂肪細胞分化基因的表達可能具有時間特異性。

家兔()是一種重要的經(jīng)濟動物，為人類提供肉品和皮毛消費。由于家兔在生長階段相對于豬、牛、羊等家養(yǎng)動物具有相對較低的脂肪沉積，因此家兔也是一種理想的研究脂肪發(fā)育的動物模型[15~17]。然而，針對家兔前體脂肪細胞分化不同時期的基因表達譜的研究卻鮮見報道。

為了研究家兔前體脂肪細胞分化不同時期的基因表達譜，本研究通過經(jīng)典的雞尾酒法(IBMX- DEX-insulin, MDI)誘導(dǎo)家兔前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞[18]，收集分化第0 d、3 d和9 d的脂肪細胞總RNA，通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)對基因的表達量進行了檢測，分別在0~3 d和3~9 d分化階段篩選出差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，然后利用生物信息學分析預(yù)測在對應(yīng)階段中表達上調(diào)的基因在家兔前體脂肪細胞分化過程中可能的功能和參與的信號通路。通過進一步分析DEGs在0 d，3 d和9 d表達量的變化，分別篩選出在0~3 d分化階段特異上調(diào)表達(0~3 d表達顯著上調(diào)，而3~9 d表達顯著下調(diào))和3~9 d分化階段特異上調(diào)表達(0~3 d表達顯著下調(diào)，而3~9 d表達顯著上調(diào))的DEGs，并預(yù)測這些特異上調(diào)表達基因可能的功能和參與的信號通路。最后使用在線蛋白分析工具分別構(gòu)建了家兔前體脂肪細胞在0~3 d和3~9 d分化階段DEGs的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測這兩個分化階段的核心節(jié)點(hub node)基因。本研究為更好地了解家兔前體脂肪細胞的分化提供轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 家兔前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

本研究所用的新生幼年新西蘭白兔來自四川農(nóng)業(yè)大學雅安校區(qū)兔場。在無菌條件下，從幼年兔(<3 d)的腎周部位取脂肪組織，剔除其結(jié)締組織和血管后，將脂肪組織剪碎成碎末狀，使用0.1%的膠原蛋白酶(美國ThermoFisher公司)消化。待脂肪組織被消化成乳糜狀，使用孔徑為70 μm的細胞篩過濾，留下液體，離心倒掉上清液后使用PBS清洗脂肪細胞3次，接種于生長培養(yǎng)基(90% DME/F12，10% FBS) (DME/F12購自美國ThermoFisher公司；FBS購自美國ZETA LIFE公司)中并置于含5%CO2、37℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3 d后對細胞傳代。待原代脂 肪細胞生長密度達到80%~90%時，棄掉生長培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(90% DME/F12，10% FBS，500 μmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，1.7 μmol/L的胰島素，1 μmol/L的地塞米松) (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和地塞米松均購自北京索萊寶生物公司)誘導(dǎo)分化72 h后，更換維持分化培養(yǎng)基(90% DME/F12，10% FBS，1.7 μmol/L的胰島素)繼續(xù)分化培養(yǎng)72 h，最后使用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞完全分化。

1.2 油紅O染色、樣本收集和甘油三脂測定

使用油紅O (美國Sigma公司)染色鑒定脂肪細胞的脂質(zhì)累積狀況，之后使用異丙醇溶解染色后的細胞，在510 nm波長下測定溶解液的吸光度(值)，值用于對油紅O染色的量化。根據(jù)家兔脂肪細胞油紅O染色的3種不同表型(幾乎沒有脂滴，出現(xiàn)花環(huán)狀的脂滴，以及出現(xiàn)成簇的大脂滴)，在誘導(dǎo)分化第0 d (D0組)、3 d (D3組)和9 d (D9組)收獲脂肪細胞，每組設(shè)置3個生物學重復(fù)，共9個樣本，提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序。使用甘油三脂(TG)測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)并按照其使用說明書，測定家兔前體脂肪細胞分化第0 d、3 d和9 d的細胞TG含量，每組設(shè)置3個生物學重復(fù)。

1.3 總RNA提取、文庫構(gòu)建及測序

使用Trizol試劑盒(美國ThermoFisher公司)并按照其操作說明書提取樣本總RNA。RNA質(zhì)量檢測合格后，在干冰(?80℃)保存下，由江西海普洛斯生物科技公司構(gòu)建去除核糖體RNA的鏈特異性文 庫。文庫質(zhì)量檢測合格后，在Illumina Hiseq X平臺上對文庫進行上機測序，最終獲得雙端150 bp的原始讀段。

1.4 基因的定量以及差異表達分析

使用Fastp軟件[19]對原始讀段進行質(zhì)量過濾，然后使用Hisat2[20]將過濾后剩下的高質(zhì)量讀段比對到家兔參考基因組上。使用Stringtie軟件[21]計算每個基因在每個樣本中的表達量(fragment per kilobase of transcript per million mapped reads, FPKM)和比對到基因序列上的讀段數(shù)目?；诿總€基因序列比對上的讀段數(shù)，使用DEseq2軟件[22]檢測D3. D0和D9. D3的DEGs，同時滿足以下兩個條件的基因被判定為DEGs：(1)在組與組之間的比較中，log2(fold-change)的絕對值大于2；(2)在組與組之間的比較中，P<0.01?；贔PKM值，使用R軟件對樣本和差異表達基因進行聚類。

1.5 qRT-PCR驗證

本研究利用qRT-PCR對RNA-seq獲得的DEGs進行表達量的驗證。隨機選取6個DEGs，根據(jù)Ensemble (http://asia.ensembl.org/index.html)提供的mRNA序列，使用在線的引物設(shè)計軟件primer- BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行熒光定量引物的設(shè)計(附表1)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板在Bio-Rad CFX儀器上進行兩步法qRT-PCR擴增。反應(yīng)條件：95℃ 10 s；95℃ 5 s，59℃ 20 s，40個循環(huán)。擴增結(jié)束后在55~ 95℃區(qū)間以0.5℃為上升率繪制溶解曲線。以為內(nèi)參，使用2–ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.6 功能富集和通路分析

使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫[23]進行GO (gene ontology)功能富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。對于富集到的GO條目和KEGG通路，<0.05被視為具有統(tǒng)計學意義。

1.7 蛋白–蛋白互作分析

將得到的DEGs輸入在線的STRING數(shù)據(jù)庫[24]，設(shè)置蛋白互作置信分數(shù)0.7作為閾值(置信分數(shù)>0.7)，分別構(gòu)建D3D0和D9D3的DEGs蛋白–蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。CytoHubba插件[25]用于篩選在PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點基因，使用Cytoscape軟件[26]進行圖形的可視化展示。

1.8 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析由R程序?qū)崿F(xiàn)，兩尾檢驗，*<0.05表示差異顯著，**<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔前體脂肪細胞的誘導(dǎo)分化

在家兔前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化第0 d、3 d和9 d進行油紅O染色，脂質(zhì)累積在這3個時期出現(xiàn)明顯的表型差異：在分化的第0 d只觀察到有少量的脂滴，在分化的第3 d出現(xiàn)花環(huán)狀的脂滴，在分化的第9 d出現(xiàn)成簇的大脂滴(圖1A)。油紅O染色的量化結(jié)果(圖1B)和甘油三脂測定結(jié)果(圖1C)也顯示，脂質(zhì)累積在家兔前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化后的第3 d和第9 d顯著升高。

2.2 基因的定量分析及DEGs的篩選

通過誘導(dǎo)家兔前體脂肪細胞分化，在分化的第0 d、3 d和9 d收集脂肪細胞總RNA，每組設(shè)置3個生物學重復(fù)(樣本編號：D0-1、D0-2、D0-3、D3-1、D3-2、D3-3、D9-1、D9-2和D9-3)，進行RNA-seq。對RNA-seq原始讀段質(zhì)量過濾后，總共得到155.03 Gb (1 109 630 370條讀段)高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，平均每個樣本17.22 Gb。對于每個樣本的基因總體表達量，log2(FPKM+1)值集中在0~3 (圖2A)。在家兔前體脂肪細胞分化0~3 d階段檢測到665個基因表達顯著上調(diào)，687個基因表達顯著下調(diào)(圖2B)。在分化3~9 d階段檢測到515個基因表達顯著上調(diào)，373個基因表達顯著下調(diào)(圖2C)。

2.3 DEGs表達量的qRT-PCR驗證

為了驗證RNA-seq的分析結(jié)果，本研究通過qRT-PCR驗證了隨機選取的6個DEGs的表達量。結(jié)果顯示，所有的6個DEGs(、、和)的qRT-PCR定量結(jié)果與RNA-seq定量結(jié)果(FPKM)有相似的表達模式(圖3)。因此，本研究通過RNA-seq得到的基因表達量有較高的可靠性。

2.4 上調(diào)基因的功能富集和信號通路分析

在0~3 d表達上調(diào)的DEGs顯著富集到603個GO條目，根據(jù)GO條目值分別在生物過程(bio-logical processes, BP)、細胞組分(cellular components, CC)和分子功能(molecular functions, MF)中均篩選出富集顯著性最高的10個GO條目(圖4A)。在BP分類中顯著性最高的3個GO條目為細胞的化學刺激反應(yīng)、細胞對有機物質(zhì)的反應(yīng)和酶聯(lián)受體蛋白信號通路；在CC分類中顯著性最高的3個GO條目為細胞外間隙、細胞外區(qū)域和細胞外區(qū)部分；在MF分類中顯著性最高的3個GO條目為激素結(jié)合、硫化合物結(jié)合和跨膜受體蛋白激酶激活。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)在0~3 d表達上調(diào)的DEGs顯著富集到24個KEGG信號通路。在富集顯著性最高的10個KEGG信號通路中(圖4B)，顯著性最高的3個KEGG信號通路為細胞色素P450對外源物的代謝的影響、信號通路和-信號通路。

圖1 家兔前體脂肪細胞的分化

A：誘導(dǎo)分化第0 d、3 d和9 d細胞油紅O染色結(jié)果；B：油紅O染色量化結(jié)果；C：甘油三脂測定結(jié)果。D0：分化第0 d樣本；D3：分化第3 d樣本；D9：分化第9 d樣本。*表示與D0比較差異顯著(<0.05)，**表示與D0比較差異極顯著(<0.01)。

圖2 基因的定量和差異表達分析

A：D0、D3、D9各樣本基因的總體表達量；B：D3D0基因差異表達分析；C：D9D3基因差異表達分析。D0：分化第0 d樣本；D3：分化第3 d樣本；D9：分化第9 d樣本。

圖3 qRT-PCR對隨機選取的6個DEGs的表達量驗證

:。

在3~9 d表達上調(diào)的DEGs顯著富集到310個GO條目，根據(jù)GO條目值分別在BP、CC和MF中均篩選出富集顯著性最高的10個GO條目(圖4C)。在BP分類中顯著性最高的3個GO條目為細胞周期過程、有絲分裂細胞周期過程和有絲分裂細胞周期；在CC分類中顯著性最高的3個GO條目為染色體、染色體區(qū)域和染色體部分；在MF分類中顯著性最高的3個GO條目為腺苷核糖核苷酸結(jié)合、腺嘌呤核苷酸結(jié)合和ATP結(jié)合。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)3~9 d表達顯著上調(diào)的DEGs顯著富集到19個信號通路，在富集顯著性最高的10個KEGG信號通路中(圖4D)，顯著性最高的3個KEGG信號通路為細胞周期、DNA復(fù)制和卵母細胞減數(shù)分裂。

圖4 表達上調(diào)DEGs的GO功能富集和KEGG通路分析

A：0~3 d上調(diào)的DEGs分別在BP、CC和MF中富集顯著性最高的GO條目(每個分類各10個)；B：0~3 d上調(diào)的DEGs富集顯著性最高的10個KEGG通路；C：3~9 d上調(diào)的DEGs分別在BP、CC和MF中富集顯著性最高的GO條目(每個分類各10個)；D：3~9 d上調(diào)的DEGs富集顯著性最高的10個KEGG通路。

2.5 DEGs的表達量分析

對家兔前體脂肪細胞分化過程中所有DEGs進行表達量聚類分析，發(fā)現(xiàn)分化第0 d的3個樣本D0-1、D0-2和D0-3形成獨立的簇，分化第3 d的3個樣本D3-1、D3-2和D3-3形成獨立的簇，分化第9 d的3個樣本D9-1、D9-2和D9-3形成獨立的簇(圖5A)，說明同組樣品間的基因表達相關(guān)性很高。在1352個0~3 d分化階段的DEGs中，有601個在3~9 d階段也呈現(xiàn)差異表達(圖5B)，統(tǒng)計每個基因在各階段的表達量，可以將這601個DEGs分為3類：第一類是表達量在0~3 d和3~9 d中都顯著上調(diào)，或者0~3 d和3~9 d都顯著下調(diào)的DEGs (8個)；第二類是在分化0~3 d表達量顯著上調(diào)而在分化3~9 d表達量顯著下調(diào)的DEGs (212個)；第三類是在分化0~3 d表達量顯著下調(diào)而在3~9 d表達量顯著上調(diào)的DEGs (381個)。

圖5 聚類分析和不同階段DEGs數(shù)量比較

A：基于FPKM值對樣本和差異表達基因進行聚類分析(顏色由暗到亮表示表達量由低到高)；B：D3. D0和D9. D3差異基因數(shù)目的比較。

2.6 特異上調(diào)表達基因的功能富集和信號通路分析

對0~3 d表達顯著上調(diào)，而在3~9 d表達顯著下調(diào)的212個DEGs進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到177個GO條目，根據(jù)GO條目值分別在BP、CC和MF中均篩選出富集顯著性最高的10個GO條目(圖6A)。在BP分類中顯著性最高的3個GO條目為脂肪生物合成過程、小分子生物合成過程和單羧酸代謝過程；在CC分類中顯著性最高的3個GO條目為細胞外基質(zhì)、細胞外區(qū)域部分和細胞外區(qū)域；在MF分類中顯著性最高的3個GO條目為金屬肽酶活性、過渡金屬離子結(jié)合和GTP結(jié)合。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到12個信號通路，在富集顯著性最高的10個KEGG信號通路中(圖6B)，顯著性最高的3個KEGG信號通路為絡(luò)氨酸代謝、組氨酸代謝和代謝通路。

對0~3 d表達顯著下調(diào)，而在3~9 d表達顯著上調(diào)的381個DEGs進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到304個GO條目，根據(jù)GO條目值分別在BP、CC和MF中均篩選出富集顯著性最高的10個GO條目(圖6C)。在BP分類中顯著性最高的3個GO條目為細胞周期過程、有絲分裂細胞周期過程和有絲分裂細胞周期；在CC分類中顯著性最高的3個GO條目為染色體、染色體區(qū)域和染色體部分；在MF分類中顯著性最高的3個GO條目為ATP結(jié)合、腺苷核糖核苷酸結(jié)合和嘌呤核糖核苷三磷酸結(jié)合。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到15個信號通路，在富集顯著性最高的10個信號通路中(圖6D)，顯著性最高的3個通路為細胞周期、DNA復(fù)制和卵母細胞減數(shù)分裂。

2.7 蛋白–蛋白互作分析

將1352個0~3 d分化階段篩選出的DEGs提交到STRING數(shù)據(jù)庫，得到家兔前體脂肪細胞在分化0~3 d的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI03，PPI03包含1352個節(jié)點(node)和4427條邊(edge)。使用CytoHubba篩選出在PPI03中排名(degree)前10的核心節(jié)點，這些核心節(jié)點基因包括、、、、、、、、和(圖7A)。

圖6 特異上調(diào)表達基因的GO功能富集和KEGG通路分析

A：0~3 d特異上調(diào)的DEGs分別在BP、CC和MF中富集顯著性最高的GO條目(每個類別各10個)；B：0~3 d特異上調(diào)的DEGs富集顯著性最高的10個KEGG通路；C：3~9 d特異上調(diào)的DEGs分別在BP、CC和MF中富集顯著性最高的10個GO條目(每個類別各10個)；D：3~9 d特異上調(diào)的DEGs富集顯著性最高的10個KEGG通路。

同樣，本研究得到3~9 d分化階段DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI39，PPI39包含888個節(jié)點和3475條邊。在PPI39中排名前10的核心節(jié)點基因包括、、、、、、、、和(圖7B)。

3 討論

肥胖是一種慢性疾病，嚴重影響人類的身體健康和生活。研究前體脂肪細胞分化有助于理解肥胖成因。目前，RNA-seq已被廣泛用于分析全基因組范圍的基因時空表達[27]。本研究使用經(jīng)典的MDI法誘導(dǎo)家兔前體脂肪細胞成脂分化[18]，油紅O染色結(jié)果和TG測定結(jié)果顯示隨著分化天數(shù)增加，脂質(zhì)累積顯著上升。在分化第9 d，能觀察到許多成簇的大脂滴，表明得到了成熟脂肪細胞。通過生物信息學分析，在分化第0、3和9 d，獲得了家兔前體脂肪細胞的基因表達譜，基于嚴格的過濾，分別在分化0~3 d和3~9 d篩選出1352個和888個DEGs。

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點基因的篩選

A：PPI03篩選的核心節(jié)點基因；B：PPI39篩選出的核心節(jié)點基因。在兩個PPI網(wǎng)絡(luò)中都能篩選到的基因用藍色字體表示。

本研究中，通過對家兔前體脂肪細胞分化0~3 d顯著上調(diào)基因的GO富集，發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)基因參與到細胞對外源刺激的響應(yīng)、分化過程的正調(diào)節(jié)和與脂質(zhì)合成相關(guān)的多個生物過程。在前體脂肪細胞增殖融合后，通過MDI法誘導(dǎo)前體脂肪細胞成脂分化，MDI主要成分為胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，細胞在接收到這些有機物信號后，被誘導(dǎo)進入到分化階段。在0~3 d富集到分化過程正調(diào)節(jié)生物過程的DEGs有和在內(nèi)的34個基因，其中被報道可以通過多種途徑調(diào)節(jié)細胞分化[28~30]。被稱為生長分化因子5，被報道不僅可以促進棕色脂肪細胞，而且也是促進3T3-L1脂肪細胞分化的關(guān)鍵基因[31]。和在家兔前體脂肪細胞分化0~3 d表達顯著上調(diào)，表明和也可能是調(diào)控家兔前體脂肪細胞分化的關(guān)鍵基因。脂肪發(fā)育伴隨著脂質(zhì)合成、脂肪酸合成和脂肪酸代謝等過程，本研究中，與這些生物過程相關(guān)的基因在0~3 d表達顯著上調(diào)，說明家兔前體脂肪細胞在0~3 d被成功誘導(dǎo)進入到分化期。在分子功能上，0~3 d表達上調(diào)的DEGs顯著富集到細胞信號傳導(dǎo)有關(guān)的GO條目，如跨膜受體蛋白激酶激活、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性和G蛋白偶聯(lián)肽受體活性。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是膜蛋白的重要功能，膜蛋白的激活可能和家兔前體脂肪細胞分化過程中富集到的一些活躍的信號通路有關(guān)。在KEGG信號通路方面，0~3 d表達上調(diào)的DEGs顯著富集到信號通路和-信號通路，這兩條信號通路在人和小鼠上被多次報道與脂肪發(fā)育相關(guān)[32~34]，說明家兔前體脂肪細胞在0~3 d分化期與其他動物的脂肪發(fā)育有一定相似性。細胞周期的調(diào)控與脂肪沉積關(guān)系密切[29]，3~9 d分化期上調(diào)的DEGs顯著富集到的GO條目包括細胞周期過程、有絲分裂細胞周期過程和有絲分裂周期，以及KEGG細胞周期信號通路，富集到這些條目和信號通路的DEGs包括、和等。其中和被報道在高脂飼養(yǎng)的肉雞的腹脂中表達上調(diào)，參與雞的脂質(zhì)累積[35]。推測家兔前體脂肪細胞在3~9 d分化期可能通過促進調(diào)控細胞周期蛋白的基因表達來維持脂肪細胞分化。

通過表達量的分析，本研究篩選出在0~3 d中特異上調(diào)表達的基因為212個，在3~9 d特異上調(diào)表達的基因為381個。對0~3 d特異上調(diào)表達基因進行GO功能富集，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到脂質(zhì)合成、脂質(zhì)代謝過程和脂肪酸代謝過程等GO條目，注釋到這些條目的基因如在人前體脂肪細胞中可以促進脂肪的生成[32,36]，而是否可以促進家兔前體脂肪細胞的分化需要相關(guān)的實驗進行驗證。在GO富集結(jié)果的細胞組分分類中，0~3 d分化期特異上調(diào)的基因富集到如細胞外基質(zhì)、細胞外區(qū)域和細胞外的外泌體等GO條目，而在3~9 d分化期特異上調(diào)的基因富集到染色體、染色體區(qū)域、著絲粒區(qū)域和染色質(zhì)等核區(qū)相關(guān)的GO條目。因此，推測一些0~3 d分化期特異上調(diào)的基因在細胞中作用的位置可能是細胞質(zhì)，而3~9 d分化期特異上調(diào)的基因在細胞中作用的位置可能是細胞核。在3~9 d分化期特異上調(diào)的基因富集到信號通路，有研究報道基因的敲除可以促進脂肪生成和脂肪標志基因的表達[37]，但信號通路與家兔前體脂肪細胞的后期分化的關(guān)聯(lián)機制需要進一步的實驗驗證。

通過PPI03網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，篩選出家兔前體脂肪細胞分化0~3 d的10個核心節(jié)點基因，包括、、、、、、、、和。其中，被稱為細胞周期蛋白依賴性激酶1。被稱為DNA拓撲異構(gòu)酶，在轉(zhuǎn)錄過程中控制和改變DNA拓撲狀態(tài)。是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。被稱為Polo樣激酶1，是一種廣泛存在于真核生物中，具有高度保守性的絲氨酸/蘇氨酸激酶。是細胞分裂的必須調(diào)節(jié)因子。被稱為細胞分裂周期蛋白8，在有絲分裂中扮演重要角色。被稱為極光激酶B，是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶。和分別被稱為細胞周期蛋白1和細胞周期蛋白2。這些基因都是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵基因，而細胞周期的調(diào)控與細胞的命運密切相關(guān)[38]，且可以影響干細胞的多能性和分化潛能[39,40]，如Lee等[41]報道基因表達被抑制可以使得MDI誘導(dǎo)的3T3-L1細胞脂肪形成受阻。被報道可以通過的抑制表達而介導(dǎo)癌癥細胞的分化[42]，本研究中，在0~3 d的表達顯著下調(diào)，表達顯著上調(diào)，推測可能被抑制，從而調(diào)控家兔前體脂肪細胞分化。在PPI39網(wǎng)絡(luò)中的10個核心節(jié)點基因包括、、、、、、、、和。其中，被稱為異常紡錘狀小頭畸形相關(guān)蛋白，其被證實對神經(jīng)干細胞的增殖和分化至關(guān)重要[43]，但對前體脂肪細胞的增殖和分化是否具有調(diào)控作用仍需要通過相關(guān)的研究才能得以被證實。從PPI網(wǎng)絡(luò)分析來看，家兔前體脂肪細胞分化的0~3 d階段和3~9 d階段在PPI網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點基因上差異不大，都可以通過調(diào)控細胞周期來促進家兔前體脂肪細胞的分化進程。然而，目前關(guān)于這些核心節(jié)點基因的研究大多數(shù)建立在非脂肪細胞上，它們調(diào)控家兔前體脂肪細胞分化的機理需要更深入地進行探索和驗證。

附錄：

附表1詳見文章電子版www.chinagene.cn。

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Analysis of gene expression profiles at different stages during preadipocyte differentiation in rabbits

Kun Du, Chuyang Mao, Anyong Ren, Xuemei Wu, Qingling Li, Tingting Chen, Shiyi Chen, Songjia Lai

Excessive accumulation of fat is harmful to human health. The preadipocyte differentiation is a critical process of fat development.Studying the expression profiles of genes related to preadipocyte differentiation contributes to understanding of the mechanism of fat accumulation.Despite being considered an ideal animal model for studying adipogenesis, little is known about the gene expression profiles at different stages during preadipocyte differentiation in rabbits. In the present study, rabbit preadipocytes were culturedand induced for differentiation, and gene expression profiles of adipocytes collected at days 0, 3, and 9 of differentiation were analyzed by RNA-seq. We identified 1352 differentially expressed genes (DEGs) when comparing day 3 with day 0 and identified 888 DEGs when comparing day 9 with day 3. Gene Ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis showed that thesignaling pathway andsignaling pathway were significantly enriched by the DEGs that up-regulated within the period of day 0 – day 3, and the GO terms and KEGG pathways that were associated with cell cycle were enriched by the DEGs that up-regulated within the period of day 3 – day 9. The DEGs that specifically up-regulated within the period of day 0 – day 3 might play roles in the cytoplasm, and the DEGs that specifically up-regulated within the period of day 3 – day 9 might act in the nucleus. The protein-protein interaction (PPI) network constructed by DEGs showed that hub node genes might modulate rabbit preadipocyte differentiation via regulating cell cycle.

adipocytes; differentiation; rabbits; preadipocytes; RNA-seq

附表1 qRT-PCR引物序列

2019-09-04;

2019-12-11

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(編號：CARS-44-A-2)資助[Supported by the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (No. CARS-44-A-2)]

杜坤，碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: 303160294@qq.com

賴松家，博士，教授，研究方向：分子遺傳與動物育種。E-mail: laisj5794@163.com

10.16288/j.yczz.19-265

2020/1/14 10:19:28

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200113.1723.002.html

(責任編委: 李明洲)