儲殷佳 潘加新 陳幸哲 徐玲玲

(常州市第一人民醫(yī)院口腔科，江蘇 常州 213000)

口腔內(nèi)有大量細(xì)菌，細(xì)菌之間的相互協(xié)同、共生及生物膜形成能力是推動口腔疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因〔1〕。口腔內(nèi)細(xì)菌感染是導(dǎo)致根尖周病與牙髓病發(fā)生的主要原因，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可經(jīng)外傷等刺激導(dǎo)致牙髓暴露并借機(jī)直接入侵牙髓組織，引起牙髓組織病變，若早期不及時干預(yù)進(jìn)一步發(fā)展將演變?yōu)槁愿庵苎住?,3〕。位于牙袋內(nèi)齦下的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物是推動慢性牙周炎發(fā)生的主要因素，牙周炎發(fā)生后這些菌斑細(xì)菌將進(jìn)一步破壞牙周組織，發(fā)展到一定程度后患牙將出現(xiàn)松動脫落等情況，對患者的日常生活與工作均有不利影響〔4,5〕。無論是慢性根尖周炎還是慢性牙周炎，其發(fā)生與發(fā)展均與細(xì)菌的入侵息息相關(guān)，前者發(fā)病多因牙本質(zhì)小管受到細(xì)菌的侵入導(dǎo)致，而牙本質(zhì)小管受到入侵多與其表面牙骨質(zhì)及牙釉質(zhì)破壞導(dǎo)致牙本質(zhì)小管暴露有關(guān)〔6〕。一般根尖周發(fā)生慢性炎癥后，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物將經(jīng)牙本質(zhì)小管間接作用于牙髓，并進(jìn)一步侵入側(cè)支根管、牙本質(zhì)小管及根尖分歧，入侵范圍擴(kuò)大至牙周組織，從而誘發(fā)慢性牙周炎〔7〕。由上述論證可知，在慢性根尖周炎與慢性牙周炎整個發(fā)病過程中，定植在牙本質(zhì)小管中的細(xì)菌起到?jīng)Q定性作用，由此可見了解慢性根尖周炎與慢性牙周炎患者根管內(nèi)細(xì)菌定植情況對合理藥物的選擇極為關(guān)鍵〔8〕。本研究旨在了解慢性根尖周炎與慢性牙周炎患者根管內(nèi)細(xì)菌定植情況。

1 對象與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年2月常州市第一人民醫(yī)院就診的50例牙周疾病患者，研究的實施經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，患者及其家屬對研究知情同意，根據(jù)患者不同的感染狀態(tài)將其分為慢性根尖周炎組(21例)及慢性牙周炎組(29例)。慢性根尖周炎組男14例，女7例；年齡63～75〔平均(68.12±6.51)〕歲；體重45～87〔平均(71.45±6.57)〕kg；受教育程度：初中及以下18例，高中及以上3例。慢性牙周炎組男17例，女12例；年齡60～76〔平均(67.21±6.67)〕歲；體重46～86〔平均(71.56±6.61)〕kg；受教育程度：初中及以下23例，高中及以上6例。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1慢性根尖周炎組 (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為慢性根尖周炎，經(jīng)牙髓電活力測試結(jié)果顯示無反應(yīng)；②經(jīng)X線檢查其根尖周投攝影范圍直徑在3～10 mm；③患牙經(jīng)根管治療失敗不可保留或已經(jīng)無保留價值。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①患牙松動度為Ⅲ度；②接受X線片檢查發(fā)現(xiàn)其牙槽骨吸收超出根長的1/3；③伴高血壓、糖尿病等全身性基礎(chǔ)疾病者；④近12 w內(nèi)使用抗生素治療者。

1.2.2慢性牙周炎組 (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)診斷證實為慢性牙周炎，且疾病程度為重度；②附著喪失>4 mm，牙周袋深度>6 mm；③患者經(jīng)X線片檢查結(jié)果顯示牙槽骨垂直或水平吸收>2/3根長。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時合并慢性根尖周炎或牙髓病者；②接受X線片檢查結(jié)果顯示患牙的根尖周骨質(zhì)破壞明顯；③合并高血壓、糖尿病等疾??；④近12 w內(nèi)使用抗生素治療者。

1.3方法

1.3.1材料及試劑 根管內(nèi)細(xì)菌定植檢測所用試劑包括：甲醛、檸檬酸三鈉、25%戊二醛、堿性品紅、甲酸、結(jié)晶紫、丙酮苦味酸。所用試劑由上海信帆生物科技有限公司提供；儀器包括日本尼康公司提供的EclipseE200光學(xué)顯微鏡、Coolpix4500照相機(jī)、Labaconco冷凍干燥機(jī)、HITACHI S-3000N掃描電子顯微鏡。

1.3.2實驗方法 (1)樣本準(zhǔn)備：拔除患牙后沿患牙根使用鋒利鑿子由近、遠(yuǎn)中向?qū)⑵渑_成兩半，使用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液將其固定，并進(jìn)行組織學(xué)研究，后使用體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛溶液將另一半固定1 w，并使用掃描電鏡仔細(xì)觀察其變化；(2)制備與觀察組織切片：將50%的甲酸與20%的檸檬酸鈉以1∶1的比例混合制成甲酸混合液后，將樣本放入浸泡4～8 w，待其完全脫鈣，經(jīng)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿牙長軸進(jìn)行連續(xù)組織切片，組織厚度約5 μm，滿意后染色，染色方法為Brown&Brenn法，操作如下：①切片脫蠟；②1%結(jié)晶紫染色；③流水沖洗；④盧戈碘液染色；⑤流水沖洗；⑥吸干，丙酮沖洗至無色；⑦流水沖洗；⑧0.25%品紅溶液染色；⑨流水沖洗，將水分吸凈但無須完全干燥；⑩使用丙酮快速沖洗至少2次，后直接將其放入苦味酸與丙酮的混合液內(nèi)，直到橙黃色出現(xiàn)為止，后使用丙酮沖洗2次，風(fēng)干后，滴入二甲苯并使用玻片封蓋。所有操作步驟結(jié)束后，放置切片于光學(xué)顯微鏡下，經(jīng)低倍鏡至高倍鏡仔細(xì)觀察根管，使用測微尺測量牙本質(zhì)小管受細(xì)菌侵入情況，以牙周側(cè)為主，結(jié)果記錄并拍照。

1.3.3制備與觀察掃描電鏡標(biāo)本 經(jīng)無菌生理鹽水清洗樣本，去除表面牙石及軟組織，經(jīng)戊二醛溶液固定，1 w后經(jīng)乙醇梯度脫水，干燥后在掃描電鏡下觀察，低倍鏡下固定位根管上中下部位及內(nèi)外側(cè)，經(jīng)低倍鏡至高倍鏡觀察根管全長，對牙本質(zhì)小管、根管壁表面及管壁總側(cè)面重點觀察，并進(jìn)一步在高倍鏡下對選定區(qū)域超微結(jié)構(gòu)自習(xí)觀察，將結(jié)果記錄下后拍照。

1.4觀察指標(biāo) 記錄兩組患者的Brown&Brenn染色結(jié)果，比較兩組不同感染狀態(tài)患者的根管內(nèi)細(xì)菌定植陽性檢出情況，并對比兩組患者的掃描電鏡觀察結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1慢性根尖周炎與慢性牙周炎組Brown&Brenn染色結(jié)果 慢性根尖周炎患者患牙根管幾乎均有細(xì)菌定植，根尖1/3段感染最嚴(yán)重，牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)是細(xì)菌定植主要集中處，整個牙本質(zhì)幾乎被細(xì)菌侵入并貫穿，侵入深度范圍：100～1 100 μm，個別患牙牙本質(zhì)小管外側(cè)(牙周側(cè))也觀察到少量細(xì)菌定植。慢性牙周炎組牙本質(zhì)小管外側(cè)是慢性牙周炎患者細(xì)菌定植主要集中部位，即牙周側(cè)，定植深度50～700 μm。此外，在患者牙根表面可見紫染桿狀菌、絲狀菌聚集成團(tuán)或成叢，有生物膜樣結(jié)構(gòu)形成，僅有個別患牙的牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)可見極少細(xì)菌定植。見圖1～4。

2.2慢性根尖周炎與慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管內(nèi)細(xì)菌定植情況

2.2.1牙本質(zhì)小管各段細(xì)菌定植陽性率 經(jīng)Brown&Brenn染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性根尖周炎與慢性牙周炎患者均可見牙根表面或根管壁表面附著不同程度細(xì)菌，牙本質(zhì)小管中的不同區(qū)域均有細(xì)菌定植，且慢性根尖周炎組根冠1/3、根中1/3、根尖1/3牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)細(xì)菌定植陽性率均明顯高于慢性牙周炎組，根冠1/3牙本質(zhì)小管外側(cè)細(xì)菌定植陽性率明顯低于慢性牙周炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

RC：根管；DT：牙本質(zhì)小管；TS：牙根表面；下圖同

圖2 慢性根尖周炎患者牙本質(zhì)小管外側(cè)Brown&Brenn染色結(jié)果(×200)

圖3 慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)Brown&Brenn染色結(jié)果(×200)

圖4 慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管外側(cè)Brown&Brenn染色結(jié)果(×200)

表1 兩組牙本質(zhì)小管各段細(xì)菌檢出陽性情況比較〔n(%)〕

2.2.2不同部位牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)深度細(xì)菌定植陽性率 慢性根尖周炎組細(xì)菌定植主要集中在牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)，牙本質(zhì)小管受侵深度最大值為1 100 μm；慢性牙周炎組細(xì)菌定植主要集中在牙本質(zhì)小管外側(cè)，牙本質(zhì)小管受侵深度最大值為700 μm；慢性根尖周炎組細(xì)菌定植侵入深度整體明顯高于慢性牙周炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；慢性根尖周炎組根冠1/3、根中1/3細(xì)菌定植深度明顯低于慢性牙周炎組，根尖1/3明顯高于慢性牙周炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。分析不同侵入深度牙本質(zhì)小管細(xì)菌定植陽性情況發(fā)現(xiàn)，在各個部位不同感染狀態(tài)組患者的各侵入深度細(xì)菌定植陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、4。

表2 兩組主要牙本質(zhì)小管細(xì)菌定植部位定植深度比較

表3 慢性根尖周炎組牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)各段不同侵入深度細(xì)菌定植陽性分布〔n(%)〕

2.3掃描電鏡觀察結(jié)果

2.3.1慢性根尖周炎掃描電鏡觀察結(jié)果 經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，慢性根尖周炎患者絮狀無定形基質(zhì)中可見大量桿菌、球菌鑲嵌，在根管壁上已生物膜形式存在或大量侵入牙本質(zhì)內(nèi)，或在呈不規(guī)則形態(tài)分布在管間牙本質(zhì)上。見圖5。

表4 慢性牙周炎組牙本質(zhì)小管外側(cè)各段不同侵入深度細(xì)菌定植陽性分布〔n(%)〕

2.3.2慢性牙周炎組掃描電鏡觀察結(jié)果 經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者牙根表面暴露牙本質(zhì)小管開口處可見不同形態(tài)細(xì)菌散布或簇集成團(tuán)，牙本質(zhì)小管內(nèi)受到不同程度的侵入。見圖6，7。

圖5 慢性根尖周炎患者牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)掃描電鏡觀察結(jié)果(×200)

圖6 慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管外側(cè)掃描電鏡觀察結(jié)果(×200)

圖7 慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管外側(cè)掃描電鏡觀察結(jié)果(×200)

3 討 論

細(xì)菌微生物及其代謝產(chǎn)物是導(dǎo)致口腔常見疾病發(fā)生的關(guān)鍵原因，這些細(xì)菌微生物及其代謝產(chǎn)物可直接經(jīng)牙本質(zhì)小管侵入根管內(nèi)，引起牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體發(fā)生一系列相應(yīng)反應(yīng)，加速牙髓組織炎癥破壞；此外，因根管系統(tǒng)與牙周組織相通，故根管內(nèi)的感染若早期得不到及時的控制極有可能涉及牙周組織，引發(fā)慢性根尖周炎、慢性牙周炎等牙周炎性疾病〔9～11〕。

牙本質(zhì)小管與牙本質(zhì)基質(zhì)本身的組成與結(jié)構(gòu)是決定牙本質(zhì)小管是否受細(xì)菌影響關(guān)鍵因素。牙本質(zhì)本身具有堅硬、滲透性等特質(zhì)，羥磷灰石Ⅰ型膠原纖維是其主要構(gòu)成成分，牙齒的不同部位其分布牙本質(zhì)小管也各異，自牙釉質(zhì)朝向牙髓，牙本質(zhì)小管密度的密度由低至高的延伸范圍為15 000～45 000 mm2，在牙本質(zhì)小管密度延伸期間，其與牙髓鄰近的一端較粗，與表面越接近則越細(xì)〔12～14〕。牙本質(zhì)小管具有的上述特質(zhì)均可能是影響細(xì)菌在其內(nèi)部定植的關(guān)鍵因素。健康人群的牙齒表面常有正常量的牙釉質(zhì)、牙骨質(zhì)覆蓋，且結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，起到保護(hù)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體之效，一旦其受到牙周治療、外傷等因素影響，原有的保護(hù)屏障受到破壞，將暴露牙本質(zhì)小管，形成與外界相同的開放通路，故細(xì)菌定植風(fēng)險高〔15，16〕。觀察既往的研究結(jié)果可以看出，盡管在人體口腔內(nèi)部檢出生存細(xì)菌超過500種以上，但并未發(fā)現(xiàn)任何一種單一的可導(dǎo)致諸如根尖周病、牙髓病等口腔疾病的病原菌，說明上述牙周疾病并不是因單一菌種侵入作用導(dǎo)致，極有可能是多種細(xì)菌聯(lián)合侵入感染后共同參與導(dǎo)致的結(jié)果〔17，18〕。

本研究結(jié)果顯示，慢性根尖周炎患者幾乎全部牙本質(zhì)小管均被細(xì)菌侵入，侵入深度較深，侵入范圍在100～1 100 μm，細(xì)菌定植多集中在根尖1/3段，其根冠1/3、根尖1/3牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)的細(xì)菌定植陽性檢出率明顯高于慢性牙周炎，慢性根尖周炎患者細(xì)菌侵入深度可能較慢性牙周炎更深，但各深度范圍內(nèi)細(xì)菌的定植情況基本無差別。潘加新等〔10〕研究了慢性根尖周炎患者掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者根尖1/3根管壁及周圍聚集細(xì)菌，且菌落間有不定形基質(zhì)樣物，以生物膜樣結(jié)構(gòu)形式存在，與本研究結(jié)果近似。表明慢性根尖周炎患者牙本質(zhì)小管幾乎完全受細(xì)菌侵入，且侵入深度較深，易累及其他牙周組織，引發(fā)其他諸如慢性牙周炎、牙髓病等疾病，故在治療時應(yīng)合理用藥保證細(xì)菌侵入的控制效果，避免其他牙周組織受影響，降低根尖周炎復(fù)發(fā)率。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者因表面缺失部分牙骨質(zhì)，為細(xì)菌入侵牙本質(zhì)小管提供條件，且以根冠1/3入侵最為嚴(yán)重，深度最高為700 μm；此外，患者牙根表面可見簇集成團(tuán)或串的絲狀菌及桿菌，其他散在分布菌群則以生物膜樣結(jié)構(gòu)存在。后經(jīng)掃描電鏡進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者牙本質(zhì)小管口大量暴露于患牙牙根表面，可見碎屑及不定形基質(zhì)，大量以球菌為主的細(xì)菌簇集成團(tuán)，患者牙本質(zhì)小管深部受細(xì)菌侵入明顯，且部分牙本質(zhì)小管內(nèi)存在膠原纖維排列混亂等情況，此時牙本質(zhì)小管內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，同慢性根尖周炎比較，二者之間的牙本質(zhì)小管受細(xì)菌入侵情況有明顯差異：①慢性牙周炎患者患牙根管細(xì)菌定植以根冠1/3為主，慢性根尖周炎則主要為根尖1/3；②細(xì)菌定植涉及牙本質(zhì)小管部位不一，慢性牙周炎主要為牙本質(zhì)小管外側(cè)，而慢性根尖周炎則主要為牙本質(zhì)小管內(nèi)側(cè)。分析二者存在上述差異的原因可能是慢性根尖周炎與慢性牙周炎間的發(fā)病機(jī)制、病因不同導(dǎo)致，前者的感染源主要來自外傷等因素，在受到外傷等因素影響后，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物將誘發(fā)牙髓組織產(chǎn)生相應(yīng)的病理改變，在此過程中，受感染的根管細(xì)菌將定植于牙本質(zhì)小管內(nèi)；而慢性牙周炎患者感染主要來源于牙周袋齦下菌斑，這些菌斑可通過牙根表面病變的牙骨質(zhì)直接侵入已經(jīng)被破壞且暴露的牙本質(zhì)小管，引起感染，故主要感染根冠，且多定植于牙本質(zhì)小管外側(cè)〔19～24〕。本研究僅對根管不同感染狀態(tài)細(xì)菌定植情況進(jìn)行分析，納入患者僅符合慢性根尖周炎與牙周炎診斷，而對不同疾病類型及牙位等并未進(jìn)一步區(qū)分，加之研究樣本量較少，故存在一定局限性，還應(yīng)在未來增加樣本量，采用新型的細(xì)菌定量實驗，進(jìn)一步證實不同感染狀態(tài)下牙本質(zhì)小管病原菌定植情況存在的差異。