張保軍 喬彥杰 劉賢俠 梁小瑞 王丹陽 谷新利

摘要：為探討中藥健宮散對產(chǎn)后子宮炎奶牛治療前后血清中部分白細胞介素含量的影響以及研究健宮散的抗炎作用機制，選取年齡、胎次、產(chǎn)奶量相近的荷斯坦奶牛18頭，按照B型超聲波檢查結(jié)果分為正常組、治療組和患病組，每組各6頭，治療組進行口服健宮散處理。利用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測各組奶牛用藥前、用藥中和用藥后1、4、7、11、15、20 d血清中白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素2（IL-2）和白細胞介素8（IL-8）的含量。結(jié)果表明，中藥健宮散能顯著降低產(chǎn)后子宮炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量。說明中藥健宮散能夠調(diào)節(jié)部分白細胞介素的表達，提高機體免疫抗炎能力，可作為奶牛產(chǎn)后保健藥，用于子宮炎的防治。

關(guān)鍵詞：健宮散;奶牛;子宮炎;血清;白細胞介素

中圖分類號： S858.237.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0160-04

收稿日期：2019-01-02

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFD0502200）。

作者簡介：張保軍（1992—），男，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向為動物疾病診斷與防治。E-mail：1058915714@qq.com。

通信作者：谷新利，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥制劑開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：xlgu@shzu.Edu.cn。

奶牛由于分娩、泌乳等應(yīng)激因素的影響，容易引起產(chǎn)后虛弱、免疫機能下降，引發(fā)子宮內(nèi)膜炎[1]。子宮內(nèi)膜炎是子宮內(nèi)膜層受到細菌或病毒的感染，引起子宮內(nèi)膜組織發(fā)生炎癥的過程[2]。白細胞介素（IL）是介導(dǎo)白細胞間相互作用的細胞因子，在子宮炎癥中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，其水平的高低反映了子宮的免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，IL能調(diào)節(jié)生殖活動并與子宮內(nèi)膜表面受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[3]。IL-1濃度高低是判定炎性反應(yīng)和炎癥損傷程度的重要標志[4];IL-2是一種免疫增強劑，參與細胞介導(dǎo)的免疫，與炎癥反應(yīng)有關(guān);IL-8是一種重要的促炎細胞因子，可使中性粒細胞向炎癥部位聚集，研究發(fā)現(xiàn)，IL-8與子宮炎的發(fā)生有關(guān)[5]。有學者推測，IL-8的表達水平可能對奶牛子宮內(nèi)膜炎有預(yù)測和監(jiān)測的效果[6]。

中藥健宮散由益母草、當歸、川芎、五靈脂、桃仁、甘草等藥材配伍而成，其組分均有活血祛瘀、抑菌消炎的功效，但抗炎作用目前尚不明確。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，對產(chǎn)后子宮炎奶牛進行口服純中藥健宮散處理，檢測治療前后外周血清中IL-1、IL-2、IL-8含量的變化規(guī)律，旨在探討健宮散對子宮炎奶牛的抗炎作用機制，為進一步了解健宮散的臨床治療機制，深入開發(fā)利用健宮散提供基礎(chǔ)參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗對象

在新疆維吾爾自治區(qū)石河子市西部牧業(yè)優(yōu)良種畜繁育中心奶牛場選擇年齡、胎次、產(chǎn)奶量相近，無傳染病及寄生蟲病的中國荷斯坦奶牛18頭，根據(jù)B型超聲波檢查結(jié)果，共診斷出健康奶牛6頭，子宮炎奶牛12頭，記錄每頭牛的耳號及產(chǎn)犢日期。

1.1.2?藥品與試劑

健宮散（散劑，400 g/袋），由石河子大學動物科技學院中獸醫(yī)學研究室研制而成，由益母草、當歸、川芎、五靈脂、桃仁、甘草等中藥組成，方中各藥材均購自當?shù)厮幍辍?/p>

IL-1（貨號：E11I0032）、IL-2（貨號：E11I0308）和IL-8（貨號：E11I0056）檢測試劑盒均購自上海Blue Gene生物技術(shù)有限公司。

1.1.3?主要儀器

荷蘭Piemed ICAL公司生產(chǎn)的50S型Tringa Vet便攜式獸用B型超聲波掃描儀，配備3.5/5.0 MHz變頻扇掃凸陣探頭或線陣探頭;Power Wave XS2 Bio Tek酶標儀（型號ELx800，Made in USA）;超低溫冰箱（型號FORMA 995），購自Thermo美國賽默飛世爾科技有限公司;微量快速振蕩儀（型號QB-9002 Kylin-Bell），購自Lab Instruments公司;離心機（型號H1850R），購自長沙湘儀離心機儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱（型號DHP-9082），購自上海浦東榮豐科學儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號HH-4），購自江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;微孔板脫水儀（型號BIOS-401），購自BIOSCIENCE梅奧賽斯（天津）生物科技有限公司;洗板機（型號Wellwash 4 MK2），購自Thermo美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗動物的分組與處理

健康奶牛6頭作為正常組（A組）;子宮炎奶牛12頭，其中6頭進行中藥治療作為治療組（B組），另外6頭不進行治療，作為患病組（C組）。治療組奶牛每頭每天灌服健宮散400 g，每天1次，連續(xù)灌服1個療程（7 d），正常組和患病組不進行任何處理。

1.2.2?樣品的采集

治療組奶牛灌服健宮散前采血1次，用藥中期（即用藥3 d時）采血1次，灌藥結(jié)束后1、4、7、11、1、20 d各采血1次，共采血8次。采血時間為14：00—16：00，正常組、患病組在同一時間采血，采血次數(shù)同治療組。所有供試牛均空腹經(jīng)尾靜脈采取血液5 mL，室溫靜置自然析出血清，裝于1.5 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱中待檢。

1.2.3?檢測指標的測定

IL-1、IL-2和IL-8含量均采用反向競爭酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4?數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示。

2?結(jié)果與分析

分別檢測A、B、C組奶牛血清中IL-1、IL-2、IL-8的含量，制作相應(yīng)標準曲線，得出相關(guān)系數(shù)：IL-1，r2=0.997 29;IL-2，r2=0.999 16;IL-8，r2=0.997 90。血清中IL-1、IL-2、IL-8含量測定結(jié)果見表1。

從表1可以看出，用藥前、用藥中和用藥后1 d，患病組血清IL-1含量均高于正常組;相比于治療組差異不顯著（P>0.05）;用藥后4 d，治療組IL-1含量與正常組、患病組差異均不顯著，用藥4 d以后，治療組IL-1含量顯著低于患病組，相比正常組差異不顯著。

用藥前、用藥中和用藥后1 d，治療組和患病組血清的IL-2含量均顯著高于正常組;用藥后4、7、15 d，治療組1 d以后顯著低于患病組;用藥后20 d，治療組與患病組差異不顯著;用藥1 d以后，治療組IL-2含量達到正常水平，相比正常組差異不顯著（表1）。

用藥前，患病組IL-8含量顯著高于正常組;用藥中，相比于正常組和治療組差異均不顯著;用藥后，治療組IL-8含量總體上不斷下降，與患病組相比差異顯著，治療組IL-8含量在用藥后相比正常組差異不顯著（表1）。

3?討論

3.1?健宮散治療前后奶牛血清中IL-1和IL-8含量的變化

白細胞介素是一種在淋巴細胞和白細胞之間傳遞信息的細胞因子，主要由T淋巴細胞、單核巨噬細胞、肥大細胞、血管上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生，通過與細胞膜表面的受體蛋白結(jié)合，介導(dǎo)機體的細胞免疫和體液免疫。IL-1和IL-8屬于促炎細胞因子，參與機體的體液免疫。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 可以影響子宮的生理功能，適量的IL-1可促進子宮內(nèi)膜蛻膜化[7]和炎性分泌物的排出[8]。IL-1是炎癥免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)劑，感染炎癥時，其值有不同程度的增高[9]。IL-8是一種中性粒細胞趨化因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。胡路鋒針對產(chǎn)后1～35 d 子宮炎奶牛血清中的IL-8濃度檢測發(fā)現(xiàn)，子宮炎組奶牛和正常組奶牛IL-8含量均呈波動式增加，無明顯規(guī)律[10]。本試驗中，子宮炎組奶牛IL-8 含量前半段時間持續(xù)上升，而后半段時間呈現(xiàn)波動式增加，這與胡路鋒的研究結(jié)果[10]略有不同，可能是試驗方法的不同和供試牛個體之間的差異所造成的。Fischer等的研究表明，亞臨床或臨床子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮上皮細胞IL-1β和IL-8 mRNA的表達顯著高于健康奶牛，IL-1β和IL-8可用于監(jiān)測和診斷亞臨床子宮內(nèi)膜炎[11]。張冬波等研究發(fā)現(xiàn)，患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮中IL-8含量均高于正常奶牛[12]。李德軍的研究表明，產(chǎn)后49 d內(nèi)患臨床和隱性子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中IL-1和IL-8的含量均升高[13]。Galvo等報道稱，子宮內(nèi)膜炎奶牛IL-1β含量表達在產(chǎn)后1周下降，產(chǎn)后5周和7周有上升趨勢，IL-8基因表達在產(chǎn)后7周顯著高于健康對照組[14]。本試驗表明，用藥前患病組、治療組IL-1和IL-8含量均高于正常組，停藥1 d以后患病組IL-1和IL-8含量均顯著高于正常組，治療組和正常組IL-1和IL-8含量分別在停藥4 d以后顯著低于患病組，本研究結(jié)果IL-1和IL-8含量變化規(guī)律與李德軍的研究[13]一致。

陳曉燕等研究發(fā)現(xiàn)，益母草浸膏可顯著降低產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎模型大鼠血清中IL-1β的含量[15]。佟建敏等研究了益母草顆粒對人工流產(chǎn)患者炎性因子水平的影響，發(fā)現(xiàn)加服益母草顆粒組術(shù)后1 d及7 d宮頸黏液中IL-1含量水平顯著低于對照組[16]。奚瑾磊等研究發(fā)現(xiàn)，當歸醇沉物可增強小鼠腹腔巨噬細胞IL-1的分泌[17]。沈維增等研究發(fā)現(xiàn)，當歸拈痛湯能降低急性痛風性關(guān)節(jié)炎患者血IL-1、IL-8含量[18]。付彥君等的研究表明，不同劑量天麻川芎可降低自發(fā)高血壓大鼠血漿心肌炎癥因子IL-1β mRNA的表達水平[19]。王桂華等研究發(fā)現(xiàn)，桃仁提取物能顯著降低急性胰腺炎大鼠血清中IL-8的含量[20]。趙蓓蕾等研究發(fā)現(xiàn)，甘草能降低吸煙大鼠血清IL-8的含量[21]。本試驗中，停藥后7、11、15、20 d治療組IL-1含量顯著低于患病組，治療組IL-8含量結(jié)束用藥后顯著低于患病組，說明健宮散降低了促炎因子IL-1和IL-8的表達水平，提高了機體的抗炎能力，原因可能是健宮散組方中益母草、當歸、川芎、桃仁、甘草等成分發(fā)揮了抗炎功效，使得血清IL-1和IL-8含量降低。

3.2?健宮散治療前后奶牛血清中IL-2含量的變化

IL-2屬于Th1型細胞因子，可誘導(dǎo)T細胞增殖，誘導(dǎo)NK細胞和LAK細胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，活化Th細胞、細胞毒性T細胞和單核巨噬細胞[22]，介導(dǎo)細胞免疫。IL-2被認為是一種不利于動物生殖的細胞因子，有報道顯示，奶牛在產(chǎn)后早期，體內(nèi)編碼IL-2的基因沒有明顯表達[8]。張冬波等研究發(fā)現(xiàn)患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮中IL-2含量均高于正常奶牛[12]。韓莉莉等研究發(fā)現(xiàn)，宮頸病變患者血清中IL-2的含量水平均隨著宮頸病變嚴重程度的增加而減少[23]。引起子宮內(nèi)膜炎主要原因之一的胎衣不下屬于一種免疫功能性疾病，馬清河等研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下組奶牛胎盤組織中IL-2的含量極顯著高于健康組，IL-2的含量可能與子宮炎癥有關(guān)[24]。本試驗表明，用藥前、用藥中及用藥后1d患病組、治療組的IL-2含量高于正常組，停藥1 d以后患病組IL-2含量顯著高于正常組，停藥后4、7、11、15 d正常組顯著低于患病組，此研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

佟建敏等報道稱，益母草顆粒能顯著提高人工流產(chǎn)后患者宮頸黏液中IL-2的含量[16]。朱邵晴等研究發(fā)現(xiàn)，藥物中加入當歸能夠加速IL-2的產(chǎn)生，促進淋巴細胞的增殖，加強免疫[25]。馮永生等研究發(fā)現(xiàn)，川芎可顯著提高小鼠血清IL-2的含量[26]。呂躍山等研究發(fā)現(xiàn)，桃仁總蛋白能提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量[27]。王志國研究了由當歸、白芍、川芎等藥材組成的當歸芍藥散對慢性盆腔炎模型大鼠IL-2的影響，發(fā)現(xiàn)當歸芍藥散能增加慢性盆腔炎模型大鼠血清中IL-2的含量[28]。賈書紅等研究發(fā)現(xiàn)，宮炎凈（由益母草、當歸、川芎、桃仁、五靈脂、甘草等組成）提取物中生物堿可顯著降低子宮內(nèi)膜炎家兔血清中IL-2的含量[29]。本研究顯示，用藥后4、7、11、15 d治療組IL-2含量顯著低于患病組，說明健宮散降低了IL-2的含量，此結(jié)果與賈書紅等的研究結(jié)果[29]一致，與佟建敏等的研究結(jié)果[16，25-28]不一致，原因可能是健宮散組分的甘草中主要解毒成分甘草甜素的腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，降低了機體對各種有毒物質(zhì)的反應(yīng)，從而增強肝臟的解毒功能[30]，促使IL-2含量降低。

綜上所述，中藥復(fù)方健宮散能夠顯著降低產(chǎn)后子宮炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量，通過調(diào)節(jié)IL-1、IL-2和IL-8的表達水平，提高機體的免疫抗炎能力，對奶牛產(chǎn)后子宮炎有明顯的防治效果。

參考文獻：

[1]王國卿，王洪海，張乃生，等. 產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)膜肥大細胞的研究[J]. 中國獸醫(yī)學報，2011，31（3）：416-419.

[2]林?羲. 家畜病理學[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[3]王?瑋，沈鴻敏. 白細胞介素1β、6、8與生殖調(diào)節(jié)的研究進展[J]. 國外醫(yī)學（計劃生育分冊），2001，20（2）：71-75.

[4]彭津津，母治平，雍?康，等. 復(fù)宮散對子宮內(nèi)膜炎模型家兔血液細胞因子TNF-α、IL-1α的影響[J]. 家畜生態(tài)學報，2016，37（8）：67-69.

[5]Hoch R C，Schraufsttter I U，Cochrane C G. In vivo，in vitro，and molecular aspects of interleukin-8 and the interleukin-8 receptors[J]. Journal of Laboratory & Clinical Medicine，1996，128（2）：134.

[6]Ghasemi F，Gonzalez-Cano P，Griebel P J，et al. Proinflammatory cytokine gene expression in endometrial cytobrush samples harvested from cows with and without subclinical endometritis[J]. Theriogenology，2012，78（7）：1538-1547.

[7]馬?毅，曹斌云. 白細胞介素-1及其對動物繁殖的影響[J]. 黑龍江動物繁殖，2000，8（4）：40-42.

[8]胡廣勝，王旭榮，楊?峰，等. 奶牛子宮內(nèi)膜炎免疫調(diào)控研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2013，34（11）：92-96.

[9]郭甫坤，吳曙光. 白介素1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進展[J]. 國外醫(yī)學（分子生物學分冊），2001（1）：13-15.

[10]胡路鋒. 奶牛產(chǎn)后不同階段子宮炎監(jiān)測及其診斷方法的研究[D]. 石河子：石河子大學，2014.

[11]Fischer C，Drillich M，Odau S，et al. Selected proinflammatory factor transcripts in bovine endometrial epithelial cells are regulated during the oestrous cycle and elevated in case of subclinical or clinical endometritis[J]. Reproduction Fertility and Development，2010，22（5）：818.

[12]張冬波，侯振中. 子宮內(nèi)膜炎母牛子宮勻漿IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)，2005（8）：12-13.

[13]李德軍. 奶牛隱性和臨床型子宮內(nèi)膜炎病理機制研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2010.

[14]Galvo K N，Santos N R，Galvao J S，et al. Association between endometritis and endometrial cytokine expression in postpartum Holstein cows[J]. Theriogenology，2011，76（2）：290-299.

[15]陳曉燕，冉華陽，張錦安. 益母草浸膏對產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎作用功效的實驗研究[J]. 中國中醫(yī)急癥，2017，26（1）：50-52，64.

[16]佟建敏，雷桂英. 益母草顆粒對人工流產(chǎn)后患者炎性因子水平及微循環(huán)的影響[J]. 河南中醫(yī)，2017，37（3）：513-515.

[17]奚瑾磊，彭仁琇，王智勇. 當歸醇沉物及其中性組分體外對巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1的影響[J]. 中草藥，2002，33（5）：437-439.

[18]沈維增，呂紅梅，謝崢偉，等. 當歸拈痛湯對急性痛風性關(guān)節(jié)炎患者血IL-1、IL-8和TNF-α的影響[J]. 中國中醫(yī)急癥，2011，20（3）：353-354，365.

[19]付彥君，陳?靖，陳?瑩. 天麻川芎對自發(fā)高血壓大鼠炎癥因子水平的影響[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2016，34（8）：2029-2031.

[20]王桂華，蘭?濤，吳向軍，等. 桃仁提取物對急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能及炎性反應(yīng)的影響[J]. 中藥材，2014，37（12）：2267-2270.

[21]趙蓓蕾，熊?華，齊?名，等. 甘草和糖皮質(zhì)激素對吸煙大鼠血清IL-8的影響[J]. 醫(yī)學研究生學報，2006，19（3）：232-234.

[22]金伯泉. 細胞和分子免疫學[M]. 西安：世界圖書出版西安公司，1995.

[23]韓莉莉，蘇萊婭·胡賽音，昆多孜·烏賽那洪. IL-2及IL-6、IL-10、IFN-γ和新疆維吾爾族、漢族婦女宮頸病變相關(guān)性研究[J]. 中國婦幼健康研究，2017，28（增刊2）：164-165.

[24]馬清河，劉榮欣，陳?斌，等. 胎衣不下奶牛胎兒胎盤中IL-2含量的測定[J]. 動物醫(yī)學進展，2010，31（8）：41-44.

[25]朱邵晴，郭?盛，錢大瑋，等. 基于多元功效成分的當歸藥材產(chǎn)地現(xiàn)代干燥加工方法研究[J]. 中國中藥雜志，2017，42（2）：264-273.

[26]馮永生，杜根安，吳南屏. 中藥扶正方對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，10（3）：140-141.

[27]呂躍山，王雅賢，運晨霞，等. 桃仁總蛋白對荷瘤鼠IL-2、IL-4水平的影響[J]. 中醫(yī)藥信息，2004，21（4）：60-61.

[28]王志國. 當歸芍藥散對慢性盆腔炎模型大鼠的TNF-α、IL-2影響[J]. 中醫(yī)藥學報，2005，33（5）：35-36.

[29]賈書紅，李效振，張東升，等. 宮炎凈提取物中生物堿對子宮內(nèi)膜炎家兔的抗炎作用機理[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（1）：209-211.

[30]董?婉，李超英，楊?萌，等. 有毒中藥配伍甘草增毒與減毒作用研究進展[J]. 通化師范學院學報，2018，39（2）：12-17.