任永申，張?zhí)炫?，梁帥，李艷秋，梅之南，廖矛川

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

據(jù)統(tǒng)計全球每年有五百萬人被毒蛇咬傷，而因治療不及時或無有效治療手段而致死或致殘者約十幾萬人[1]. 蛇毒主要分為血循毒，神經(jīng)毒以及混合毒3種類型，其主要成分有蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)、以及碳水化合物、脂類和其他小分子等. 血循毒主要引起心血管功能障礙. 神經(jīng)毒以神經(jīng)系統(tǒng)為靶器官，主要干擾神經(jīng)系統(tǒng)功能，嚴(yán)重時可致命. 譬如，尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon)俗稱五步蛇，其咬傷后毒液由局部進(jìn)入傷者血液系統(tǒng)，主要破壞血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)而造成內(nèi)臟出血[2]，其毒性主要為血循毒.

抗蛇毒血清是毒蛇咬傷的首選治療方法，但是也存在明顯不足. 首先作為抗體制備的抗蛇毒血清并不具有普適性，且抗蛇毒血清存在儲運不便、種類不全的問題，特別是對于偏遠(yuǎn)地區(qū)患者及蛇傷種類不明的野外突發(fā)狀況，常難以得到直接有效的治療；其次，抗蛇毒血清治療只能中和游離毒素，對已造成損傷的毒素?zé)o效，且對受損組織的修復(fù)無效，需要其他手段共同完成治療.

中醫(yī)理論認(rèn)為，蛇毒分屬風(fēng)火二毒.尖吻蝮蛇毒作為血循毒更偏于火毒的范疇，表現(xiàn)為火毒熾盛，傷津耗液，迫血妄行；甚者邪傳心包，或出現(xiàn)邪熱耗傷心陽的脫證，或出現(xiàn)邪毒蒙蔽心包的閉證. 臨床多用清熱解毒、涼血活血的中藥治療[3]. 所用中藥鮮藥也大多為清熱解毒類藥物，其在清熱、涼血、養(yǎng)陰、安神等方面的作用更強(qiáng)于干藥，特別是其取用方便，更適用于野外毒蛇咬傷第一時間救急使用，降低致死、致殘率，達(dá)到良好的救急與預(yù)后效果.

垂盆草SedumsarmentosumBunge是傳統(tǒng)的治療蛇傷藥物，最早收載于《本草綱目拾遺》，記載垂盆草善治癰腫、濕郁水腫、蟲蛇咬傷[4]. 土家族藥匠多將鮮垂盆草洗凈搗爛外敷患處或者直接將患肢浸泡鮮藥搗碎液中治療火毒證類毒蛇咬傷[5].本文以垂盆草為研究對象，比較鮮用/干用在尖吻蝮蛇毒致死保護(hù)作用和組織損傷治療的藥效差異，探討垂盆草鮮用成分差異對蛇傷治療的作用與可能機(jī)制.

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮)；HPLC(Waters，269型)；蛇毒凍干粉(景德鎮(zhèn)陳鋒公司)；瓊脂糖(上?？蒲?；新鮮垂盆草采自湖北省英山縣大別山區(qū)(2019年7月)，經(jīng)廖矛川教授鑒定為SedumsarmentosumBunge的全草；季德勝蛇藥片(精華制藥，批號Z3202).

1.2 樣品制備

垂盆草鮮汁(XZ)：鮮垂盆草榨汁，抽濾除雜后收集即得(每1 g鮮汁相當(dāng)于1.54 g鮮垂盆草)；垂盆草鮮汁濃縮物(XZN)：鮮垂盆草榨取汁液，抽濾除雜后于55 ℃減壓濃縮得到(1 g鮮汁濃縮物相當(dāng)于48 g鮮垂盆草)；垂盆草干品水提取物(ST)：取鮮垂盆草同批干燥全草，加8倍量水提取兩次后合并濾液，減壓濃縮收集得到(1 g相當(dāng)于22 g鮮垂盆草)；垂盆草醇提取物(CT)：鮮垂盆草同批干燥全草加10倍量70%乙醇提取兩次后合并濾液，減壓濃縮干燥后得到(1 g醇提物相當(dāng)于25 g鮮垂盆草).

1.3 垂盆草提取物體外抑制PLA2酶活性試驗

1.3.1 蛇毒PLA2酶活性標(biāo)定

參照文獻(xiàn)方法[6]測定尖吻蝮蛇毒PLA2酶活性. 0.5 g瓊脂糖倒入裝有50 mL 0.05 mol·L-1pH 7.5的NaAc的錐形瓶中，加熱溶解；將2 mL卵黃底物與1 mL 0.01 mol·L-1的CaCl2混勻；待瓊脂糖溶液溫度降至大約50 ℃時，將配好的底物溶液倒入其中, 混合均勻后倒培養(yǎng)皿中，液面高度為5 mm；靜置30 min，用5 mm打孔器依次打孔. 取1 mg·mL-1蛇毒凍干粉生理鹽水溶液置37 ℃水浴鍋孵育45 min, 之后稀釋至500、250、125、62.5 μg·mL-1. 每孔加入總量10 μL的蛇毒稀釋溶液后，置于濕盒中密封，在37 ℃恒溫孵育8 h后取出，測量并記錄透明圓環(huán)直徑. 平行實驗3次得平均值.

1.3.2 垂盆草提取物對PLA2酶抑制作用

蛇毒凍干粉分別與垂盆草鮮汁濃縮物(XZN)、水提物(ST)、醇提物(CT)質(zhì)量比為1∶400、1∶300、1∶200、1∶100、1∶50，用生理鹽水稀釋成每10 μL含8 μg蛇毒凍干粉的溶液，于37 ℃恒溫孵育45 min. 將孵育好的溶液取10 μL即含8 μg約能產(chǎn)生18 mm透明圈直徑的蛇毒共孵液加入到1.3.1方法制作的培養(yǎng)皿孔中，置于濕盒內(nèi)密封，孵育，取出測量并記錄圓環(huán)直徑. 平行實驗3次后取平均值后繪制曲線.

1.4 垂盆草提取物對尖吻蝮蛇毒致動物死亡率影響

1.4.1 對腹腔注射蛇毒小鼠死亡率的影響

24只雄性昆明種小鼠，隨機(jī)平均分為4組. 將小鼠標(biāo)記好后根據(jù)體重腹腔注射相應(yīng)劑量蛇毒(5 mg·kg-1)，隨后0.5 h內(nèi)各組分別灌胃給予：0.5 g/只生理鹽水(MX)、鮮汁濃縮物(XZN)、鮮汁(XZ)、水提濃縮物(ST)、醇提濃縮物(CT). 觀察24 h內(nèi)各組小鼠的生存狀況，記錄各動物生存時間、計算各組動物死亡率.

1.4.2 與蛇毒共孵育后腹腔注射對小鼠死亡率的影響

36只雄性昆明種小鼠，隨機(jī)平均分為6組，每組采用蛇毒-藥物共孵育法. 將鮮汁濃縮物與蛇毒凍干粉(5.88 mg·kg-1)按400∶1、200∶1(XZN-H、XZN-L)質(zhì)量比，水提物高、低劑量(ST-H、ST-L)，醇提物濃縮物高、低劑量(CT-H、CT-L)與蛇毒凍干粉在37 ℃水浴環(huán)境下孵育45 min，將含有5.88 mg·kg-1蛇毒的共孵育產(chǎn)物給予小鼠腹腔注射，觀察并記錄各組動物生存狀況，死亡時間.

1.5 藥物對蛇毒致肌肉組織壞死治療實驗

24只雄性小鼠平均分為4組，并將小鼠右后肢采用Na2S·10H2O脫毛處理. 將15 μL含50 μg蛇毒凍干粉溶液注射到小鼠右腿腓腸肌部位，模擬蛇毒咬傷. 將各組小鼠分別放入裝有適量的生理鹽水(模型組，MX)、垂盆草鮮汁(XZ)、干垂盆草水提液(ST)、季德勝藥片溶液(取8片研缽搗碎后加蒸餾水超聲溶解，JDS)中，使右腿剛好浸沒. 每浸泡2 h后將小鼠取出用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入鼠籠中進(jìn)食休息，1 h后取出再放入以上藥液中浸泡. 每天按此方法重復(fù)操作3次. 注射蛇毒30 min后，用細(xì)線環(huán)繞小鼠右腿測量腫脹右腿周長. 之后于第24、48 h于相同部位重復(fù)此測量，評價各組小鼠治療情況. 采用損傷評分表，分別于注射蛇毒后24、48 h記錄小鼠生命體征、生存狀況，記錄注射部位腫脹程度、潰爛范圍，評價小鼠損傷程度. 隨時記錄小鼠死亡時間，記錄48 h生存率，死亡動物于死亡時間取注射部位肌肉組織，存活小鼠于第48 h取出右腿肌肉組織，采用10%甲醛固定、石蠟切片、HE染色、觀察組織病理變化.

1.6 垂盆草提取物化學(xué)指紋圖譜比較

分別稱取垂盆草鮮汁濃縮物(XZN)、水提物(ST)、醇提物(CT) 約0.5 g，加入30 mL甲醇超聲處理3 h充分溶解，0.45 μm濾膜濾過，備用.

色譜柱選擇C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm). 流動相為甲醇(A相)，含0.1%乙酸的色譜純水(B相)；柱溫設(shè)定為40 ℃，洗脫梯度程序為：0～50 min，10%～50%A；50～80 min,50%～95%A. 流速1 mL·min-1, 進(jìn)樣量10 μL. 檢測波長255 nm.

1.7 統(tǒng)計分析

計量采用Mean±SD表示，采用非參數(shù)t-test；計數(shù)資料采用組間秩和檢驗(卡方檢驗)，統(tǒng)計分析由SPSS軟件完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛇毒PLA2酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

酶活性測定結(jié)果表明透明圈直徑(y, mm)在蛇毒劑量X，在62.5～500 μg·mL-1之間存在良好的劑量關(guān)系：y= -2.356lnX+20.45 (R2=0.9441).

2.2 垂盆草提取物對PLA2酶活性體外抑制作用

垂盆草鮮汁濃縮物、水提物、醇提物對PLA2酶活性體外抑制作用結(jié)果顯示(圖1)，PLA2酶在培養(yǎng)皿上產(chǎn)生的透明圈直徑與共孵育質(zhì)量比X之間關(guān)系分別為：y= -3.169lnX+26.621 (R2=0.9543)、y=-1.611lnX+24.452 (R2=0.9201)、y= -2.298lnX+20.3 (R2=0.9647). 在同等劑量下，垂盆草鮮汁濃縮物對蝮蛇蛇毒PLA2酶活性優(yōu)于垂盆草干品醇提物，更優(yōu)于垂盆草干品水提物；表明垂盆草鮮用對蛇毒主要酶活性抑制作用顯著優(yōu)于其他提取方式.

圖1 垂盆草提取物對PLA2酶活性體外抑制作用量效曲線圖Fig.1 Dose-effect curve of Sedum sarmentosum extract inhibitiontest on PLA2 enzyme activity in vitro

2.3 垂盆草提取物灌胃腹腔注射蛇毒對小鼠生存率的影響

腹腔注射蝮蛇蛇毒對照組動物生存率為16.7%，而口服鮮汁濃縮物組生存率為33.3%(P<0.05)(表1).垂盆草鮮用能夠降低動物死亡率，藥效優(yōu)于垂盆草干品水提物和醇提物，提示垂盆草鮮用可為蛇傷救治贏得治療機(jī)會，具有重要的實際意義.

表1 垂盆草提取物灌胃給藥對腹腔注射蛇毒小鼠生存率的影響Tab.1 The influence of Sedum sarmentosum extract on the survival rate of mice injected with venom intraperitoneally

注：各給藥組動物平均生存時間分別與生理鹽水組平均生存時間(存活動物生存時間統(tǒng)一記為48 h)進(jìn)行Mann-Whitney U獨立樣本非參數(shù)檢驗，**P<0.01，*P<0.05

2.4 垂盆草提取物與蛇毒共孵育后腹腔注射對小鼠生存率的影響

藥物與蛇毒共孵育腹腔注射后小鼠生存曲線結(jié)果表明(圖2)，模型組動物在2 h左右全部死亡，在此蛇毒劑量下，能導(dǎo)致小鼠急性中毒死亡；水提物低劑量組、醇提物低劑量組動物在4 h左右全部死亡，此兩種藥物提取制備方法在低劑量下對蛇傷小鼠的救治作用不明顯；水提高劑量組、醇提高劑量組將動物生存率提高到16.7% (P<0.05)，藥物開始起到一定的保護(hù)作用，但治療效果有限，相比水提高劑量組，醇提物高劑量能夠顯著延長死亡動物生存時間，可為蛇傷治療爭取一定搶救時間；垂盆草鮮汁濃縮物低、高劑量組能夠顯著延長動物存活時間，且高劑量組能顯著提高動物生存率到33.3%(P<0.01)，表明鮮汁大劑量使用對蛇傷蛇傷救治具有重要價值.

各給藥組分別與模型組進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析圖2 蛇毒-藥物共孵育后腹腔注射小鼠生存曲線Fig.2 The survival curve of mice injected intraperitoneally with incubation mixture of venom and drug

2.5 垂盆草提取物對蛇毒致肌肉組織損傷保護(hù)

與正常對照組比較，模型組小鼠肌肉組織注射蛇毒后，經(jīng)24 h浸泡治療后表現(xiàn)出精神萎靡，眼臉下垂以及活動能力下降的狀態(tài)，治療伴隨死亡率高達(dá)到4/6；傷口出現(xiàn)紫紅色淤腫潰爛，腫脹明顯，周長達(dá)到1.53±0.32 cm，浸泡治療48 h后未見明顯消腫情況；肌肉組織切片顯示有較多損傷細(xì)胞，但由于模型組動物注射蛇毒后死亡較早，肌肉組織尚未出現(xiàn)進(jìn)一步的嚴(yán)重?fù)p傷.鮮汁浸泡組小鼠浸泡治療24 h后部分小鼠活動能力減弱，死亡率為1/6，顯著低于模型組(P<0.05)；蛇毒注射區(qū)域出現(xiàn)紅色腫脹，浸泡治療48 h后腫脹周長較24 h出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；細(xì)胞一定程度纖維變性和細(xì)胞腫脹，但僅有少量組織細(xì)胞凋亡，顯示藥物對蛇毒導(dǎo)致的局部損傷有良好的治療作用(圖3).

水提液浸泡治療組小鼠24 h治療后小鼠整體活動能力下降，僅有一只小鼠表現(xiàn)正?；顒幽芰Γ?4 h內(nèi)死亡率達(dá)到3/6，高于鮮汁組；傷口出現(xiàn)紫紅色淤腫，浸泡治療48 h后未見明顯的腫脹周長下降的趨勢；大量的組織細(xì)胞裂解凋亡，纖維組織細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷變性.表明垂盆草干品水提液對逆轉(zhuǎn)蛇毒導(dǎo)致的局部損傷作用欠佳，但能延長動物生存時間，動物在生存過程中蛇毒繼續(xù)危害組織，造成嚴(yán)重的局部損傷和潰爛，局部病理狀況甚于模型組.

陽性對照組季德勝蛇藥組動物經(jīng)浸泡治療48 h后生理狀態(tài)，活動能力表現(xiàn)趨于正常；腫脹周長下降趨勢明顯；有輕微組織細(xì)胞腫脹，僅有少量細(xì)胞發(fā)生裂解凋亡；表明該藥對蛇傷具有良好的治療作用.

表2和表3顯示肌肉注射蛇毒后出現(xiàn)腫脹潰爛，經(jīng)過浸泡治療后各組表現(xiàn)出不同的治療效果. 其中，鮮汁浸泡組對動物生存狀態(tài)、生存率、肌肉組織保護(hù)作用均優(yōu)于蒸餾水浸泡組和水提液浸泡組；季德勝藥液浸泡組對蛇傷治療效果優(yōu)于其他各組，這與其復(fù)方中大量使用同類鮮草藥汁入藥有關(guān).

圖3 浸泡治療各組小鼠組織病理切片F(xiàn)ig.3 Histopathological results of mice with the immersion therapy

表2 組織損傷癥狀積分表
Tab.2 Score table for tissue damage evaluation

癥狀和體征 0分1分2分3分腫脹顏色潰爛面積正常顏色無明顯潰爛皮下出血,紅斑 潰爛面積較小紫紅色水腫潰爛面積中等 水腫伴隨組織嚴(yán)重潰爛潰爛面積較大

表3 各組藥液浸泡治療情況Tab.3 Immersion therapy results of each group

注：治療48 h與治療24 h腫脹周長比較，**P<0.01;癥狀積分各給藥組與蒸餾水浸泡組比較，##P<0.01，#P<0.05；伴隨死亡率使用Kaplan-Meier方法檢驗，※※P<0.01，※P<0.05

2.6 垂盆草樣品HPLC指紋圖譜

垂盆草鮮汁濃縮物與垂盆草水提物、醇提物在化學(xué)成分上差異明顯(圖4). 從色譜峰數(shù)目上看，垂盆草干品水提物色譜峰數(shù)目最少，溶出化學(xué)成分最少，因而可以發(fā)揮生物活性的成分也最少，這可能是其抗蛇毒藥效活性較弱的原因之一；垂盆草干品醇提物指紋圖譜中色譜峰數(shù)目較多、含量較高，提示醇提方法對垂盆草干品提取效率較高，從而可以參與藥效作用發(fā)揮的化學(xué)成分更多，因而其具有一定的抗蛇毒活性. 另外，從化學(xué)指紋圖譜上看，鮮垂盆草色譜峰數(shù)目和含量介于水提物和醇提物之間，但其發(fā)揮的抗蛇毒藥效作用最強(qiáng)，提示鮮垂盆草抗蛇毒藥效物質(zhì)應(yīng)不限于上述化學(xué)成分，而與其在鮮用取汁狀態(tài)下保留更多其他種類化學(xué)成分、初生代謝產(chǎn)物及其他生命活性物質(zhì)有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究.

圖4 垂盆草樣品HPLC指紋圖譜Fig.4 The HPLC fingerprint of Sedum sarmentosum extract sample

3 結(jié)語

鮮垂盆草能夠降低蛇傷動物死亡率，但經(jīng)口給藥，藥物需要吸收代謝過程，因而在治療上需要一定時間發(fā)揮藥效；蛇毒損傷造成動物腹腔大量出血致死，給予鮮垂盆草汁灌胃后出血有所減少. 蛇傷的救治一方面在于能夠迅速減少未結(jié)合蛇毒，另一方面在于降低蛇毒已經(jīng)造成損傷的修復(fù).研究表明，天然藥物中黃酮類、三萜類、單寧類以及固醇類化合物具有很好的抗蛇毒活性[6]，并在垂盆草中發(fā)現(xiàn)上述幾種類型成分[7]. 課題組前期利用低場核磁共振及成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新鮮中藥干燥過程中水分及化學(xué)成分存在復(fù)雜的變化情況規(guī)律，研究表明中藥鮮用更具有物質(zhì)基礎(chǔ)的多樣性及生命活性的優(yōu)效性[8]. 本研究中，垂盆草鮮汁相比干藥在化學(xué)指紋圖譜中的成分更為豐富，且鮮汁中含有豐富的鞣質(zhì)和黃酮類成分如山奈酚7-O-(6-O-丙二酰)-葡萄糖苷等具有一定Ca2+離子螯合能力的化合物[9]，且這類化合物區(qū)別于EDTA的Ca2+死螯合作用，可在螯合Ca2+離子后被胞漿酶降解或因其本身不穩(wěn)定的螯合作用進(jìn)一步釋放出來而起到促進(jìn)凝血的雙重調(diào)節(jié)作用，因而對蛇毒造成的出血致死具有較好的療效.

本文從垂盆草鮮品/干品提取物對蛇毒酶活抑制、致死保護(hù)、局部損傷治療作用等幾個層面評價了抗尖吻蝮蛇毒活性差異，驗證了垂盆草抗蛇毒作用及鮮用功效更優(yōu)的傳統(tǒng)認(rèn)知，對于蛇傷的野外急救、降低致死致殘率和提高治療預(yù)后具有重要意義,對其他中藥鮮用優(yōu)效性研究也具有參考意義.