胡燕，胡升，吉木色，張尚文，王欣雅，康麗

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

目前，水凝膠作為一種新型藥物輸送載體，因其優(yōu)良性質(zhì)而具有廣闊的應(yīng)用前景.智能水凝膠能對(duì)pH[1]、溫度[2]、電場(chǎng)[3]、超聲[4]和光[5]等條件刺激做出應(yīng)答，其作為藥物載體優(yōu)勢(shì)更加明顯.生物藥物在胃腸道中具有不穩(wěn)定、半衰期短、低滲透性等缺點(diǎn)[6]，而采用水凝膠作為生物類藥物載體是一種有效克服方法[7-9].戊二醛作為明膠交聯(lián)劑具有細(xì)胞毒性[10]，但氧化多糖類可用于蛋白質(zhì)類天然高分子材料的交聯(lián)[11].因此，本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉和明膠為原料，用氧化海藻酸鈉與氯化鈣為交聯(lián)劑，制備了優(yōu)良性能的復(fù)合水凝膠，并探討了該體系性能、對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的緩控釋效果及釋藥機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉(AR，上海阿拉丁)；殼聚糖(食用級(jí)，Mw=1×105，浙江金殼生化)；明膠(藥用級(jí)，上海阿拉丁)；濃鹽酸(AR，信陽(yáng)市化學(xué)試劑)；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)(AR，Sigma)；其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR級(jí).

CP214電子天平(梅特勒-托利多)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康)；恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華)；傅里葉紅外光譜儀(IR，Nicolet 6700，賽默飛世爾)；X-射線衍射儀(XRD，Bruker advance D8型，德國(guó)布魯克AXS).

1.2 水凝膠的制備

1.2.1 氧化海藻酸鈉(OSA)的制備

取適量乙醇和蒸餾水，在攪拌下加入海藻酸鈉(SA)，攪拌10 min后加入高碘酸鈉，室溫下避光攪拌，控制氧化時(shí)間，加乙二醇終止反應(yīng)[12,13].再用純化水透析后抽濾、濃縮、冷凍干燥即得(反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1).

圖1 氧化海藻酸鈉反應(yīng)方程式Fig.1 Chemical equation of OSA

1.2.2 復(fù)合水凝膠的制備

取一定量上述制備好的OSA溶解.稱量適量明膠(Ge)分散于溶有OSA的蒸餾水中，后于40℃水浴攪拌至完全溶解并交聯(lián).SA溶液與OSA交聯(lián)的Ge溶液混合均勻，抽氣，用滴制法與鈣離子交聯(lián)，再用2%CS包膜，純化水沖洗后自然風(fēng)干得復(fù)合水凝膠(CH)，制備流程見(jiàn)圖2.

圖2 復(fù)合水凝膠制備示意圖Fig.2 Schematic diagram of preparation of composite hydrogel

1.3 OSA交聯(lián)Ge/SA 復(fù)合水凝膠的表征

1.3.1 水凝膠的形貌

拍攝水凝膠新制備、風(fēng)干后及溶脹后的外部形態(tài)，并用掃描電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu).

1.3.2 紅外光譜分析(IR)

將SA、OSA及SA/Ge復(fù)合水凝膠凍干樣品按一定比例與溴化鉀粉末混合壓片后測(cè)試.

1.3.3 熱重分析(TGA)

運(yùn)用TGA對(duì)SA、Ge、OSA及復(fù)合水凝膠凍干樣品進(jìn)行檢測(cè).溫度范圍：40～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min.

1.3.4 X射線分析(XRD)

運(yùn)用X射線分析儀對(duì)海藻酸鈉、明膠、氧化海藻酸鈉以及復(fù)合水凝膠樣品進(jìn)行檢測(cè).測(cè)試條件：管壓40 kV，掃描速度1 °·min-1，衍射角范圍4°～40°.

1.3.5 溶脹性能測(cè)試

稱適量風(fēng)干水凝膠樣品，前2 h在模擬胃液(pH=1.2)中溶脹，再在模擬腸液(pH=7.4)中，直至溶脹平衡.每30 min稱重并記錄，用下式計(jì)算溶脹率：

SR=[(mt-m0)/m0]，

式中：SR為水凝膠的溶脹率；mt為凝膠在模擬液溶脹t時(shí)的質(zhì)量，g；m0為凝膠的初始質(zhì)量，g.

1.4 釋藥實(shí)驗(yàn)

采用直接包埋法制備載牛血清白蛋白(BSA)水凝膠，風(fēng)干備用.稱若干份風(fēng)干樣品置入錐形瓶中并記錄樣品質(zhì)量.加入模擬胃腸液，水浴恒溫振蕩測(cè)試.每隔30 min取樣，再補(bǔ)充同體積的模擬液，同法進(jìn)行其它條件測(cè)試.

將取樣液用考馬斯亮藍(lán)染液染色，在595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)并記錄.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，按下式計(jì)算BSA的累積釋藥率：

Qn=[(V0ρn+V∑ρn-1/W]×100% ，

式中：ρn為第n次取樣中BSA質(zhì)量濃度；V為取樣量；V0為初始體積；W為載藥量.

1.5 釋藥機(jī)制

利用復(fù)合水凝膠在模擬胃腸液釋放BSA的釋藥數(shù)據(jù)，進(jìn)行零級(jí)方程、一級(jí)方程、Higuchi方程和Ritger-peppas方程擬合.

(1)零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型：Mt/M∞=k0t，

(2)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型：ln(1-Mt/M∞) =-k1t，

(3)Higuchi方程：Mt/M∞=kHt1/2，

(4)Ritger-peppas方程：Mt/M∞=ktn，

式中：Mt為t時(shí)間內(nèi)的累積釋放量；M∞為理論上最大的釋放量；Mt/M∞為累積釋藥率；k、k0、k1、kH為速率常數(shù)；n為特征參數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合水凝膠的表征結(jié)果

2.1.1 水凝膠的形貌表征

圖3水凝膠的外部形貌.圖3a是剛制備的水凝膠，呈類白色的球狀，直徑約為4 mm；圖3b是風(fēng)干后的水凝膠，明顯收縮，直徑約為2 mm，為黃色；圖3c是溶脹8 h時(shí)的水凝膠，膨脹明顯，呈透明狀.

圖3 復(fù)合水凝膠外部形貌Fig.3 External morphology of composite hydrogel

圖4a、4b為同一樣品用掃描電鏡拍攝的水凝膠三維結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為多孔層狀，利于載藥及吸水溶脹釋放藥物.

圖4 復(fù)合水凝膠的掃描電鏡圖(×100)Fig.4 SEM images of composite hydrogel(×100)

2.1.2 紅外光譜分析

圖5為復(fù)合水凝膠的紅外譜圖.由圖5可見(jiàn)：OSA在1735 cm-1呈現(xiàn)新的吸收峰，為―CHO的伸縮振動(dòng)，表明SA發(fā)生了氧化反應(yīng)；該峰在SA/Ge復(fù)合水凝膠圖譜中消失，表明OSA與明膠發(fā)生了交聯(lián).

圖5 復(fù)合水凝膠的紅外圖譜圖Fig.5 Infrared spectra of composite hydrogel

根據(jù)制備過(guò)程以及紅外光譜的分析，推測(cè)SA/Ge復(fù)合水凝膠的交聯(lián)機(jī)理如圖6所示.

圖6 復(fù)合水凝膠的交聯(lián)機(jī)理Fig.6 Crosslinking mechanism of composite hydrogel

2.1.3 熱重分析

復(fù)合水凝膠的熱重分析圖見(jiàn)圖7.結(jié)合圖7a，SA和Ge在200～250 ℃較快失重；復(fù)合水凝膠在250～300 ℃緩慢失重，說(shuō)明交聯(lián)后的水凝膠熱穩(wěn)定有所提高.圖7b表明復(fù)合水凝膠在兩個(gè)階段出現(xiàn)熱分解，分別50～250 ℃與300～400 ℃.低溫失重是由于復(fù)合水凝膠吸附水的損失；高溫失重是體系中化學(xué)鍵的斷裂，海藻酸鈉中相鄰的羥基結(jié)合脫水，明膠降解.

a) TAG曲線; b) TAG曲線的一階導(dǎo)數(shù)圖7 復(fù)合水凝膠的熱重分析圖Fig.7 TAG curve of composite hydrogel

2.1.4 X射線衍射分析

復(fù)合水凝膠的X射線衍射分析圖譜見(jiàn)圖8.由圖8可見(jiàn)：SA在14°和23°處有兩個(gè)尖銳的衍射峰，Ge在20°處有衍射峰；CS在19.5°處有尖銳的衍射峰，但是復(fù)合水凝膠未出現(xiàn)較強(qiáng)的衍射峰，說(shuō)明該體系發(fā)生物理化學(xué)交聯(lián)后，原料由晶體結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)定型結(jié)構(gòu).

圖8 復(fù)合水凝膠的X射線衍射分析圖譜Fig.8 XRD spectrogram of composite hydrogel

2.1.5 溶脹性能

在模擬體液中，進(jìn)行SA/Ge復(fù)合水凝膠的溶脹性能測(cè)試. 圖9a是不同氧化時(shí)間的OSA作為交聯(lián)劑的溶脹曲線圖.圖中隨著氧化時(shí)間增加，OSA的氧化程度越高，與明膠交聯(lián)強(qiáng)度越好，體系越穩(wěn)定則溶脹率越大，選擇氧化時(shí)間為6 h的OSA進(jìn)行下步的研究.圖9b中是不同OSA濃度復(fù)合水凝膠的溶脹曲線. 圖中復(fù)合水凝膠溶脹時(shí)間在10 h以上并能維持約30 h，因?yàn)轶w系中有化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)，使體系穩(wěn)定；復(fù)合水凝膠溶脹率在pH 1.2中維持在5左右，而在pH 7.4中體系溶脹逐漸增大，最高的溶脹率可達(dá)約36.因?yàn)樵赟GF中，H+使得體系表面帶有正電荷使--COOH以分子形式存在，分子間排斥力小，而在pH 7.4中，OH-使―COOH解離，分子間排斥力增加，吸水溶脹.當(dāng)OSA加入量小于0.3%時(shí)隨OSA濃度增加溶脹率升高；OSA濃度繼續(xù)增加則交聯(lián)密度大，溶脹率降低.

a)不同氧化時(shí)間；b) 不同交聯(lián)劑濃度圖9 復(fù)合水凝膠的溶脹曲線Fig.9 Swelling curves of composite hydrogel

2.2 體外釋藥測(cè)試

選擇牛血清白蛋白(BSA)作為體外釋藥的模型藥物, 載藥復(fù)合水凝膠在不同模擬液下釋放BSA模型藥物結(jié)果見(jiàn)圖10. 圖10a表示在SBF中緩釋效果較好，10 h藥物釋放率低于60%，隨著OSA濃度的增加，緩釋效果更好.圖10b表示在SIF中釋放呈緩慢釋放的趨勢(shì)，體系開(kāi)始溶脹，釋藥率約為20%，然后緩慢釋放.不同濃度的OSA，后期釋藥不同，因?yàn)楦邼舛鹊腛SA使交聯(lián)緊密，網(wǎng)絡(luò)體系瓦解慢，緩釋作用好.圖10c表示在SGF中釋放藥物率整體較低，0.5 h內(nèi)由于表面藥物的釋放，釋藥率約10%，因?yàn)樵谀M胃液中的溶脹率較低使釋藥非常緩慢.

a)模擬體液；b)模擬腸液；c)模擬胃液圖10 不同pH條件下釋放BSA模型藥物Fig.10 Cumulative release curve of BSA in different pH condition

2.3 復(fù)合水凝膠釋藥機(jī)制研究

根據(jù)復(fù)合水凝膠在模擬胃液、模擬腸液的釋藥數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合. 根據(jù)表1和表2擬合的結(jié)果，參考相關(guān)系數(shù)R，Higuchi方程中R的相關(guān)度較高，n值均在0.45～0.89之間，所以其釋藥機(jī)制屬于骨架型擴(kuò)散機(jī)制釋放[14,15].

表1 復(fù)合水凝膠釋藥機(jī)制擬合結(jié)果Tab.1 Drug release mechanism fitting results of composite hydrogel

表2 復(fù)合水凝膠釋藥機(jī)制擬合結(jié)果(Ritger-peppas擬合)Tab.2 Drug release mechanism fitting results of composite hydrogel(Ritger-peppas fitting)

3 結(jié)論

本文以海藻酸鈉和明膠為原料，采用溫和的方法以O(shè)SA替代戊二醛作為明膠的交聯(lián)劑，得到一種基于天然材料的pH敏感性水凝膠.該復(fù)合水凝膠的溶脹率隨著OSA氧化時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)線性增大的趨勢(shì)，隨著OSA濃度的增大先增大后減小，溶脹特性好且溶脹率約為36.體系穩(wěn)定性好，溶脹時(shí)間較長(zhǎng)，可達(dá)到約30 h.在釋藥實(shí)驗(yàn)中，該體系對(duì)蛋白質(zhì)類藥物BSA表現(xiàn)出緩釋效果，屬于骨架型擴(kuò)散機(jī)制釋放.此類SA/Ge(OSA交聯(lián))復(fù)合水凝膠有望作為一種新型的大分子藥物緩控釋載體.