萬年新，王濤，易志勇，裴國鳳*

(1 山東省調水工程運行維護中心 棘洪灘水庫管理站，青島 266111；2 中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074)

硅藻水華的暴發(fā)給水生態(tài)系統(tǒng)帶來危害，學者們對引起水華的硅藻生物學研究越來越多[1].鏈狀彎殼藻(Achnanthidiumcatenatum)屬于彎殼藻屬，是該屬硅藻中極為特殊的一種藻類.彎殼藻屬中絕大多數(shù)硅藻以附著方式生長，而只有鏈狀彎殼藻是唯一一種既能浮游生長又能附著生長,既可以單細胞形式存在、也可以多細胞鏈狀群體形式存在的硅藻，有研究表明鏈狀彎殼藻單體細胞轉變?yōu)槿后w細胞時有利于其浮游生長，而由于該藻本身的浮游特性，它也是目前彎殼藻類中唯一一種可以形成水華的硅藻[2].近十幾年來，在世界各地淡水湖泊以及飲用水庫中均發(fā)現(xiàn)了鏈狀彎殼藻水華[3]，影響了工業(yè)用水和城市居民的日常生活用水.本課題組在棘洪灘水庫也發(fā)現(xiàn)了彎鏈狀殼藻的存在，并在少數(shù)年度(2005年)的春季形成微弱優(yōu)勢.

在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，硅藻水華暴發(fā)的原因是由生物因素與非生物因素共同作用，溫度、光照、營養(yǎng)源是非生物因素中的主要影響因子[4]，細菌的存在是硅藻生長環(huán)境中不容忽視的生物影響因子，兩者之間的關系主要表現(xiàn)在相互促進和相互抑制，且與胞外多聚物的分泌也有密切關系[5].而大腸桿菌作為自然界中常見的異養(yǎng)細菌廣泛存在于江河、湖泊等水體中，它不僅是一種環(huán)境指示菌，也是一種影響水生生物生長繁殖的細菌[6]，亦或是影響鏈狀彎殼藻生長特性的重要生物因子.

硅藻在生長過程中會分泌一類粘性物質，稱之為胞外多聚物，一般包括多糖、酶類等物質，其中胞外多糖是最重要的組成部分[7]，這些物質的功能主要表現(xiàn)在附著性、運動、穩(wěn)定環(huán)境等方面[8].胞外多聚物的產(chǎn)生使固著型生長硅藻的附著結構更加有柔韌性，牢固地附著在基質上，避免被浮游動物捕食或被較快的水流沖走，它在硅藻由單細胞形成多細胞群體的過程中也起著重要作用[9].近幾年國內(nèi)不同地方的水庫和湖泊，相繼出現(xiàn)有關鏈狀彎殼藻水華的報道，故有必要研究環(huán)境因素對鏈狀彎殼藻生長的影響.本研究以浙江寧波東錢湖采集純化的鏈狀彎殼藻藻株為實驗對象，測定鏈狀彎殼藻與細菌共培養(yǎng)時的生物量、單體和多細胞鏈狀群體的比例和胞外多糖含量的變化，進而探究細菌的存在對鏈狀彎殼藻生長特性的影響，以期在鏈狀彎殼藻水華預警與防治方面提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藻種為羽紋綱彎殼藻屬硅藻鏈狀彎殼藻，由浙江寧波東錢湖分離純化的藻株.采用DV培養(yǎng)基培養(yǎng)[10]，溫度(23±1)℃，光照強度3500 lux，光暗時間比12h/12h.每天定時人工搖動2～3次.實驗菌種為大腸桿菌E．coli，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC).

1.2 大腸桿菌液的制備

取活化的對數(shù)生長期大腸桿菌至50 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫搖床進行培養(yǎng)(200 r·min-1)，取處于對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液作為實驗用菌液.

1.3 鏈狀彎殼藻和細菌共培養(yǎng)

在相同體積和濃度的鏈狀彎殼藻培養(yǎng)液中，分別加入不同量的大腸桿菌菌液，依據(jù)菌液加入體積占培養(yǎng)液總體積的比例不同，實驗設置5個梯度，分別是0%、0.2%、0.5%、1%、 2%，每個處理組3個重復，設置培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度(23±1)℃，光照強度3500 lux，光暗時間比12h/12h.每天定時人工搖動2～3次，實驗周期為12 d.

1.4 藻細胞密度方法測定

將藻液搖勻后取0.1 mL于浮游植物計數(shù)框中，在顯微鏡下隨機選取25個視野，分別對鏈狀彎殼藻的總細胞、單體、群體細胞記數(shù).比例計算方法：單體或群體細胞密度/總細胞密度.

1.5 胞外多糖含量的測定

取5 mL培養(yǎng)液于離心管中.在12000 r·min-14 ℃條件下離心10 min.用5 mL去離子水懸浮沉淀，60 ℃水浴30 min后，離心10 min.取上清即為膠體胞外多糖(colloid exopolysaccharides, CEPS)，用苯酚硫酸法測胞外多糖的含量[11].

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)；用EXCEL 2007進行作圖.

2 結果

2.1 大腸桿菌對鏈狀彎殼藻生物量的影響

用不同濃度的大腸桿菌菌液處理后，鏈狀彎殼藻生長受到明顯抑制，且隨菌液濃度的提高，鏈狀彎殼藻的生長受到的抑制越明顯.當對照組的細胞密度峰值達到3.46×106個·mL-1時，1%濃度菌液處理組的細胞密度峰值為2.07×106個·mL-1(圖1)，是對照組同期的59.83%，而2%濃度條件下的鏈狀彎殼藻的細胞密度從第4 d開始呈現(xiàn)負增長，并在第6 d時，細胞密度為0 個·mL-1，說明2%的菌液對鏈狀彎殼藻的生長具有強烈的抑制作用.與對照組相比，0.2%、0.5%、1.0%、2.0%處理組的鏈狀彎殼藻細胞密度均有顯著性減少(P<0.05)，表明大腸桿菌能夠抑制鏈狀彎殼藻的生長.而各處理組大腸桿菌濃度均在第4 d達到峰值，隨后開始下降并持續(xù)至實驗末期，表明鏈狀彎殼藻的生長同樣會影響大腸桿菌的生長繁殖.

a)鏈狀彎殼藻總細胞密度的變化；b)大腸桿菌生物量的變化圖1 不同濃度的大腸桿菌對鏈狀彎殼藻生長的影響Fig.1 Effects of different amounts ofE. coli on the growth of A.catenatum

2.2 大腸桿菌對鏈狀彎殼藻形成多細胞群體的影響

鏈狀彎殼藻單體與多細胞群體的細胞密度測定結果顯示處理組的單體生長均受到明顯的抑制作用(P<0.05)，而濃度為0.2%、0.5%、1.0%處理組的多細胞群體的生長具有明顯的促進作用(P<0.05).其中，在0.5%處理組中，鏈狀彎殼藻的單體細胞密度變化趨勢與對照相似(圖2a)；1.0%處理組中，鏈狀彎殼藻的單體細胞密度在第6 d達到生長峰值，而多細胞群體在第8 d達到峰值，與對照相比，多細胞群體的細胞密度具有顯著性的提高(P<0.05)，多細胞群體的細胞密度最高可達7.55×105個·mL-1，是同時期對照組的312.9%(圖2b).這些結果表明適當濃度的大腸桿菌與鏈狀彎殼藻共培養(yǎng)，能使鏈狀彎殼藻單體、多細胞群體提前達到生長峰值，促進鏈狀彎殼藻多細胞群體的生長.

圖2 鏈狀彎殼藻單細胞(a)和多細胞群體(b)細胞密度的變化Fig.2 Changes of cell density in single(a)and multicellular population (b)of A.catenatum

其他條件不變，只改變大腸桿菌菌懸液的添加量時，發(fā)現(xiàn)對照組中的多細胞群體細胞密度隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸減少，處理組中的群體細胞密度呈先增加，后減少的變化趨勢(圖3).處理組與對照組中群體細胞密度百分比的顯著性分析顯示：0.2%和0.5%處理組的多細胞群體細胞密度從第4 d開始增長，并在第6 d達到峰值，此時的多細胞群體分別占各自總細胞密度的44.06%、67.61%，與對照相比均具有明顯的增加(P<0.05)；1%處理組的多細胞群體的細胞密度在第8 d達到5.11×105個·mL-1，是單體細胞密度的5.35 倍.由此表明大腸桿菌對鏈狀彎殼藻單體、多細胞群體的生長有顯著影響，對多細胞群體的形成有促進作用.

用印度墨水對鏈狀彎殼藻進行負染色后，單體和多細胞群體外均包裹有層次固定、層次較厚、無色透明的胞外多聚物(圖4).在實驗前期，大多數(shù)鏈狀彎殼藻以單細胞狀態(tài)存在，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中的鏈狀彎殼藻形成2～6個細胞的鏈狀多細胞群體.

a)空白對照；b、c、d)分別添加了0.2%、0.5%、1.0%濃度大腸桿菌菌液圖3 鏈狀彎殼藻單細胞和多細胞群體的細胞密度相對百分比Fig.3 Relative percentage of cell density in single-cell and multicellular populations of A. catenatum

a) 鏈狀彎殼藻的單個細胞或2個多細胞群體；b～d) 4、5個鏈狀彎殼藻單細胞聚集在一起形成的鏈狀多細胞群體圖4 鏈狀彎殼藻經(jīng)印度墨水負染色的胞外多聚物及鏈狀多細胞群體Fig.4 Extracellular polymers of A. catenatum negatively stainedby Indian ink and chain multicellular colony

2.3 大腸桿菌對鏈狀彎殼藻形成胞外多糖的影響

實驗測定了各組不同培養(yǎng)時期的胞外多糖含量，發(fā)現(xiàn)鏈狀彎殼藻多細胞群體細胞密度峰值時期的胞外多糖含量可達15.51 μg·mL-1，是對照組同期胞外多糖含量的2.33 倍，實驗期間的胞外多糖含量平均可達14.77 μg·mL-1，是對照組的2.09倍；1%濃度處理組的胞外多糖含量平均最高(圖5)；單因素方差分析顯示，與對照組相比，各濃度處理組的胞外多糖含量均有顯著性的增加(P<0.05),說明大腸桿菌的存在對鏈狀彎殼藻胞外多糖的形成具有顯著的促進作用.

圖5 不同添加量的大腸桿菌對鏈狀彎殼藻胞外多糖含量的影響Fig.5 Effects of different additions of E. coli on extracellularpolysaccharide content of A. catenatum

3 討論

3.1 共培養(yǎng)對鏈狀彎殼藻生長及其成群的影響

在天然水體中，細菌與藻類之間存在共生、拮抗、競爭等復雜的關系[12].本文結果表明大腸桿菌與鏈狀彎殼藻共培養(yǎng)時，大腸桿菌對鏈狀彎殼藻的生長有抑制作用.同一環(huán)境中一種生物被另一種生物所影響是多種機制共同作用的結果，鏈狀彎殼藻的生長被抑制可能是多種機制相互耦合的結果，營養(yǎng)物質的競爭是其中一種重要的機制[13].因此在大腸桿菌與鏈狀彎殼藻共培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分固定時，隨著菌液添加量的增加，藻類細胞生長所受的抑制作用越強；而單獨添加大腸桿菌菌液到DV培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能夠在DV培養(yǎng)基中生長，因此推測鏈狀彎殼藻細胞生長受到抑制可能是由于大腸桿菌與鏈狀彎殼藻競爭營養(yǎng)源所導致.

3.2 鏈狀彎殼藻胞外多糖的分泌對多細胞群體形成的影響

在添加大腸桿菌的條件下，處理組中形成的群體細胞明顯增多，較多的鏈狀彎殼藻細胞聚集在一起形成群體.說明培養(yǎng)基中的單細胞表面黏性增強，單細胞表面與粘性有關的胞外多糖分泌可能增多.本文通過實驗測定對照組與處理組中的胞外多糖，證實處理組中的胞外多糖含量均高于對照組，實驗結果與席藻Phormidiumautumnale胞外多糖分泌增多的機制有相似之處[14].研究表明，藻類釋放的胞外多糖與細菌的生物量存在密切關系[15]，本文有相似的實驗結果，即隨著大腸桿菌菌液濃度的增多，處理組培養(yǎng)基中積累的胞外多糖的含量也逐漸增加，處理組培養(yǎng)基中的胞外多糖含量明顯高于對照組.由此可見，鏈狀彎殼藻群體細胞的形成可能與胞外多糖的分泌量有緊密聯(lián)系.總之，本文結果表明大腸桿菌對鏈狀彎殼藻的生長有明顯的抑制作用，且對其多細胞群體的形成及胞外多糖的分泌有密切關系，不同濃度細菌菌液對該硅藻生長的影響具有差異性.