閆京寧，胡 聰，孟祥龍

（1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 晉中 030016；2. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 晉中 030016；3. 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330038）

中藥經(jīng)典古方五子衍宗丸起源于唐代，始載于《懸解錄》中，由枸杞子、菟絲子（酒蒸，成餅）、覆盆子（酒浸）、五味子（蒸，研碎）、車(chē)前子（揚(yáng)凈，鹽炒）五味中藥制成，被譽(yù)為古今“種子第一方”[1]。在《攝生眾妙方》[2]、《證治準(zhǔn)繩》[3]及《醫(yī)學(xué)入門(mén)》[4]等醫(yī)書(shū)中均有記載。五子衍宗丸具有補(bǔ)益腎氣、填精補(bǔ)髓及種嗣衍宗之功[5]。其中枸杞子性平味甘，可作填精補(bǔ)血之用；菟絲子性平味甘辛，甘可作補(bǔ)虛之用，辛則溫散陽(yáng)氣，以平補(bǔ)腎中陰陽(yáng)之氣，故此二藥共同作為本方君藥。覆盆子有補(bǔ)益虛損和收斂固攝之功效；五味子五味俱全，但以酸性為主，因酸甘可化陰，具有收斂固攝和益氣生津之功效，此二藥溫和但不熱亦不燥，同協(xié)君藥泌精養(yǎng)腎、固精縮尿，共同作為本方臣藥。車(chē)前子屬味甘性微寒之品，其甘寒而利，有益于通利水道，同時(shí)可瀉腎中虛火，其微寒之性可用來(lái)制約方中的溫?zé)嶂罚瑥亩拐窖a(bǔ)而不滯，澀中有通，為佐藥[6]。目前，五子衍宗丸的研究進(jìn)展大多運(yùn)用于臨床，如邱海明[7]研究了五子衍宗丸對(duì)不孕不育男性患者的治療作用, 研究發(fā)現(xiàn)服用五子衍宗丸后的不孕不育患者其精子的密度、精子的活動(dòng)能力、精液量等明顯高于較服用枸櫞酸氯米芬膠囊患者，提示在五子衍宗丸對(duì)男性的不孕不育, 有著較好的臨床治療效果。龐玉琴[8]用五子衍宗丸治療子宮發(fā)育不良的不孕癥100 例, 發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸能調(diào)節(jié)月經(jīng)，增大子宮，對(duì)子宮發(fā)育不良導(dǎo)致的不孕不育具有較好的治療效果，其治愈率68%,總有效率89%。周波[9]運(yùn)用五子衍宗丸加減方治療一名早泄已婚男性，服用五子衍宗丸加減方21 天后房事時(shí)仍易短時(shí)間內(nèi)射精,但腰酸、乏力癥狀較前稍有減輕，服藥33 天后，房事時(shí)可控制稍長(zhǎng)時(shí)間后射精,腰酸、乏力較前明顯好轉(zhuǎn)，提示五子衍宗丸對(duì)早泄具用較好的治療效果。陳舜華[10]使用五子衍宗丸治療一名陽(yáng)痿已婚男性，主要癥狀為腰膝酸軟, 畏寒, 精神差, 時(shí)有失眠、頭疼頭暈癥狀。服用子衍宗丸10 劑以后，腰膝酸軟癥狀明顯改善, 睡眠好轉(zhuǎn), 晨有勃起。在較茯苓服用20 劑后有癥狀消失, 勃起正常, 臨床治愈，雖然五子衍宗丸在臨床應(yīng)用中取得了較好的療效，但對(duì)其治療上述疾病的共性作用機(jī)制和藥效活性成分的相關(guān)研究甚少。本研究基于此而展開(kāi)對(duì)五子衍宗丸藥效機(jī)制的探討，為其今后的研究運(yùn)用開(kāi)拓新的思路和方向。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)來(lái)進(jìn)行多成分、多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。其通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)檢索數(shù)據(jù)，把生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)和藥物作用系統(tǒng)、整體地有機(jī)結(jié)合。因中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，用一般的實(shí)驗(yàn)研究或者分析方法難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其共性作用機(jī)制的揭示，而借助中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)無(wú)疑為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)增加了許多可能性[11，12]。本研究基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，試揭示五子衍宗丸關(guān)于治療不育、早泄、陽(yáng)痿三種疾病的共性作用機(jī)制。本文探索了用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建出的五子衍宗丸治療上述三種疾病的“疾病-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及其高頻節(jié)點(diǎn)分析，接著對(duì)基因本體（GO）功能和基于京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路進(jìn)行了富集分析，并對(duì)其共性作用機(jī)制（如高頻共性靶點(diǎn)、基因、KEGG 通路等）作出了分析總結(jié)，為五子衍宗丸的復(fù)方成分、藥效機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供新的思想與方法。

1 方法

1.1 五子衍宗丸成分搜集

TCMSP 雖然存在一定的局限性如：數(shù)據(jù)來(lái)源信息無(wú)法匹配，缺乏動(dòng)物藥及中藥復(fù)方的信息等，但它囊括了中藥藥典收錄的全部草藥的活性成分、關(guān)鍵ADME 性質(zhì)、類(lèi)藥性、作用的靶點(diǎn)及參與的通路，這些數(shù)據(jù)都是由研究組成員經(jīng)過(guò)數(shù)年的手動(dòng)驗(yàn)證添加的，其準(zhǔn)確性和查全性可靠[13]。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[14]，分別以“菟絲子、枸杞子、覆盆子、五味子、車(chē)前子”為關(guān)鍵詞檢索出五子衍宗丸中的成分。

1.2 篩選活性化合物和靶標(biāo)蛋白

現(xiàn)行研究對(duì)于活性化合物的篩選一般是參考OB（Oral Bioavailability, OB）和類(lèi)藥性（Drug-likeness,DL），標(biāo)準(zhǔn)為 OB 值不小于 30%，DL 值不小于 0.18，本研究以此為基礎(chǔ)對(duì)化合物進(jìn)行篩選。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，http://www.omim.org/）[15]，人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards?: The Human Gene Database，https://www.genecards.org/）[16]，分 別 以“不育/Sterility”，“早泄/Premature Ejaculation”，“陽(yáng)痿/Erectile Dysfunction”為關(guān)鍵詞檢索與不育，早泄，陽(yáng)痿相關(guān)的基因即為疾病的靶點(diǎn)。

1.4 韋恩圖的構(gòu)建

將藥物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)分別上傳到韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）[17]，在 線得到活性化合物與不育、陽(yáng)痿、早泄的交集基因。

1.5 確定靶標(biāo)蛋白基因名及構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫(kù)（The Universal Protein Resource, UniProt，https://www.uniprot.org/）[18]、人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（HUGO Gene Nomenclature Committee,HGNC，https://www.genenames.org/）[19]、醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索服務(wù)系統(tǒng)（US National Library of Medicine National Institutes of Health, Pub Med，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）[20]檢索靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，而對(duì)“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建則用Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件完成。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）的構(gòu)建

利用蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING 11.0，https://string-db.org）[21]，將五子衍宗丸與三種疾病的共性交集基因分別上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，在線得到五子衍宗丸與三種疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7 核心靶點(diǎn)的通路分析

把五子衍宗丸治療不育、早泄、陽(yáng)痿的蛋白靶點(diǎn)分別上傳至生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery,DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）[22]，然后進(jìn)行基因本體（Gene Ontology, GO）生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/)軟件繪圖，讓其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

以1.2 項(xiàng)下相關(guān)條件進(jìn)行檢索，得到五子衍宗丸中93個(gè)活性化合物，4294個(gè)作用靶點(diǎn)。其活性化合物基本信息見(jiàn)表1。

續(xù)表

續(xù)表

2.2 五子衍宗丸與三種疾病的交集基因

按1.3 項(xiàng)下，依照每種疾病的相關(guān)檢索條件從OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)去在線篩選相關(guān)基因并進(jìn)行合并，得出三種疾病的相關(guān)基因靶點(diǎn)。其數(shù)目依次為：不育的26390 個(gè)相關(guān)基因、陽(yáng)痿的690 個(gè)相關(guān)基因、早泄的563個(gè)相關(guān)基因。

按1.4 項(xiàng)下，把藥物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)分別上傳到韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htm），在線得到活性化合物與不育、早泄、陽(yáng)痿的交集基因，數(shù)目依次為：不育139個(gè)、早泄77個(gè)、陽(yáng)痿55個(gè)，見(jiàn)圖1，三種疾病交集基因見(jiàn)附表1；共性交集基因數(shù)目為20個(gè)，見(jiàn)表2。

2.3 “藥物-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

按1.5 項(xiàng)下相關(guān)操作，借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件分別構(gòu)建五子衍宗丸與三種疾病的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。根據(jù)五子衍宗丸與三種疾病的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，總結(jié)出55個(gè)高頻共性化合物，見(jiàn)附表2；分析五子衍宗丸治療每種疾病的藥效化合物所屬的類(lèi)別，見(jiàn)圖3。

分析五子衍宗丸與三種疾病的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，得出以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（betasitosterol）等為主的55個(gè)高頻共性化合物，對(duì)其藥效機(jī)制的一些闡述如下：

槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除自由基、預(yù)防心血管疾病等功效[23]。此外，對(duì)生殖系統(tǒng)也有一定的保護(hù)功能，可保護(hù)睪丸組織的結(jié)構(gòu)和功能維持正常[24]。環(huán)境中超標(biāo)的重金屬會(huì)引起氧化應(yīng)激和炎性作用導(dǎo)致機(jī)體生殖機(jī)能障礙[25]，而槲皮素通過(guò)提高抗氧化酶的活性和激活Nrf2-Keap1[26]（Nu-clear 紅細(xì)胞相關(guān)因子結(jié)合Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白）通路，使抗氧化物質(zhì)可以提高抗氧化能力，從而對(duì)保護(hù)機(jī)體的繁殖能力起到很強(qiáng)的作用。山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗癌，防治糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和抑制蛋白激酶等功能[27]，其抗炎活性的作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)促炎酶的活性和控制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[28]，來(lái)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，從而使內(nèi)皮血管血液微循環(huán)保持良好，起到對(duì)生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用[29]。豆甾醇和β-谷甾醇具有降血脂、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和類(lèi)激素功能等多種作用[30]，經(jīng)氧化在機(jī)體內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化為類(lèi)雌激素物質(zhì)，使血漿中的性激素水平提高，有益于機(jī)體生殖系統(tǒng)的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體繁殖性能，還可降低血漿中生殖類(lèi)固醇激素的水平，這樣性腺產(chǎn)生的雌激素水平就會(huì)相對(duì)提高，從而加速機(jī)體的激素代謝水平和改善生殖生長(zhǎng)性能[31]。

圖1 五子衍宗丸與三種疾病的韋恩（Venn）圖

表2 五子衍宗丸與三種疾病的共性交集基因

分析五子衍宗丸治療不育、陽(yáng)痿、早泄三種疾病的藥效化合物類(lèi)別圖，發(fā)現(xiàn)甾體類(lèi)化合物在上述三種疾病的藥效化合物類(lèi)別比例中分別占42.22%、47.62%、46.51%，可推知，甾體類(lèi)化合物為五子衍宗丸治療三種疾病的高頻化合物種類(lèi)，其代表性物質(zhì)有：α-1-谷甾醇（Sitosterol alpha1）、24-亞甲基-8-羊毛甾烯 醇（24-methylenelanost-8-enol）、巖 藻 甾 醇（Fucosterol）及菜油甾醇（campesterol）等。此外，苯丙素類(lèi)化合物在治療上述三種疾病中頻率較高，其代表物質(zhì)有：芝麻素（sesamin）、五味子醇乙（Gomisin）和五味子素C（Wuweizisu C）。

2.4 五子衍宗丸與三種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建和篩選

按2.6 項(xiàng)下相關(guān)操作，運(yùn)用蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING 11.0，https://string-db.org），構(gòu)建出五子衍宗丸與三種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），見(jiàn)圖4，各節(jié)點(diǎn)度值分析見(jiàn)表3，五子衍宗丸與三種疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析，見(jiàn)附表3。

圖2 五子衍宗丸與三種疾病的“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

圖3 五子衍宗丸治療三種疾病的藥效化合物歸類(lèi)

經(jīng)對(duì)比分析，共得到10 個(gè)高頻共性靶點(diǎn)。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）在生殖系統(tǒng)各器官血管產(chǎn)生和形成過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，在精子的發(fā)生、發(fā)育及成熟過(guò)程有著重要作用[32]；孕激素受體（PGR）、雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2）與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)，可能是導(dǎo)致受精卵著床失敗的原因[33]；胱氨酸蛋白酶3（CASP3）與導(dǎo)致男性不育的少精子癥、弱精子癥相關(guān)[34]；白細(xì)胞介素6（IL-6）[35]、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS3）[36]、雄激素受體（AR）[37]和抗氧化酶（SOD1）[38]都與男性生殖功能及其機(jī)制有關(guān)；抗凋亡基因（BCL2）對(duì)生殖系統(tǒng)生精組織有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育起重要作用[]。

五子衍宗丸與三種疾病的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中心點(diǎn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA），此外，在其周?chē)h(huán)繞的蛋白還有胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、趨化因子配體8（CXCL8）、雌激素受體α（ESR1）、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS3）等。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）通過(guò)增加血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和遷移，促進(jìn)血管生成[40]，還可利用其特異性受體通過(guò)自分泌和旁分泌方法傳遞細(xì)胞間信息，調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)各器官的血管產(chǎn)生、形成以及細(xì)胞功能，如其參與了睪丸Sertoli（滋養(yǎng)）細(xì)胞和Leydig（間質(zhì)）細(xì)胞的調(diào)節(jié)[41]。此外，VEGF 在精子的發(fā)生、發(fā)育及成熟過(guò)程有著關(guān)鍵性作用，與男性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切[42]；精液中的活性氧含量較高，是導(dǎo)致男性不孕不育的主要原因之一，而有研究發(fā)現(xiàn)活性氧引起的精子損傷的程度與細(xì)胞色素C、CASP9和CASPS3水平升高呈正相關(guān)[43]；IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，在女性生殖道和妊娠組織中廣泛表達(dá)，IL-6 水平的升高常會(huì)導(dǎo)致女性不孕、反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)等，對(duì)胚胎和胎盤(pán)的發(fā)育發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[44]。研究發(fā)現(xiàn)CXCL 8、TNF-α 等均能通過(guò)升高活性氧水平使精子組蛋白轉(zhuǎn)換異常，進(jìn)而導(dǎo)致精子缺陷，與男性不孕不育關(guān)系密切[45]。有報(bào)道稱(chēng)ESR1、ESR2 不僅與子宮內(nèi)膜異位癥顯著相關(guān)還與精子密度、精子活力和精子形態(tài)關(guān)系密切[46]。IFNG 作為一種生物活性調(diào)節(jié)因子，能誘導(dǎo)關(guān)鍵細(xì)胞因子集落刺激因子2（CSF2）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的合成，進(jìn)而影響女性對(duì)精液的免疫反應(yīng)導(dǎo)致不孕不育[47]。PGR屬于核受體家族的一員，其甲基化率的增加會(huì)減少基因表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜容受性[48]。G6PD 是一種用于氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)酶，研究表明G6PD 缺陷的母鼠會(huì)導(dǎo)致其胚胎DNA 氧化，出現(xiàn)胎兒死亡和畸形，與不孕、宮內(nèi)和產(chǎn)后死亡以及致畸的關(guān)系密切[49]。

2.5 基因本體（GO）功能富集分析

圖5 五子衍宗丸與三種疾病的基因本體（GO）功能富集分析

按1.7 項(xiàng)下，將五子衍宗丸治療不育、陽(yáng)痿、和早泄的共性蛋白靶點(diǎn)上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，在線得到五子衍宗丸與上述三種疾病的GO 條目1198 個(gè)。借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）使其結(jié)果可視化，見(jiàn)圖5。共篩選出30 條GO 高頻共性基因，其中排名前十的生物學(xué)過(guò)程主要包括：雌性性腺發(fā)育（female gonad development）、雌性主要性特征的發(fā)展（development of primary female sexual characteristics）、雌性性別分化（female sex differentiation）、性腺發(fā)育（gonad development）、主要性特征的發(fā)展（development of primary sexual characteristics）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of DNA-binding transcription factor activity） 、 性 別 分 化 （sex differentiation）、細(xì) 胞 數(shù) 量 的 穩(wěn) 態(tài)（homeostasis of number of cells）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)（regulation of DNA-binding transcription factor activity）和生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（reproductive structure development）；細(xì)胞組分方面主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)域（membrane region）、小凹（caveola）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、質(zhì) 膜 筏（plasma membrane raft）、線 粒 體 外 膜（mitochondrial outer membrane）、核 被 膜（nuclear envelope）、細(xì)胞器外膜（organelle outer membrane）和外部膜（outer membrane）；分子功能方面主要包括：核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄活性因子，直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合（transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、類(lèi)固醇激素活性受體（steroid hormone receptor activity）、細(xì)胞因子結(jié)合受體（cytokine receptor binding）、腎上腺素能活性受體（adrenergic receptor activity）、類(lèi)固醇結(jié)合（steroid binding）、細(xì)胞活性因子（cytokine activity）、生長(zhǎng)因子結(jié)合受體（growth factor receptor binding）、g 蛋白偶聯(lián)胺活性受體（G proteincoupled amine receptor activity）和三磷酸腺苷酶結(jié)合（ATPase binding）。

2.6 基于京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析

圖6 五子衍宗丸與三種疾病的基于京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析

按1.7 項(xiàng)下，將五子衍宗丸治療不育、早泄、陽(yáng)痿的共性蛋白靶點(diǎn)上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，在線得到三種疾病的KEGG 通路數(shù)75個(gè)。其可視化結(jié)果見(jiàn)圖6。共得到6 條高頻共性KEGG 通路，分別為：白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、抗葉酸性（Antifolate resistance）及NOD 樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）。其中出現(xiàn)頻次較高的白細(xì)胞介素-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）和乏氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）均能刺激促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α），使其表達(dá)水平升高，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[50]；胞漿內(nèi)免疫受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）可在調(diào)節(jié)自身免疫方面發(fā)揮重要作用，如果其激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄反應(yīng)被激活，最終可能使炎癥基因表達(dá)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[51]，而大多數(shù)生殖疾病和炎癥有一定的關(guān)系；雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）會(huì)影響雌激素、睪酮、孕酮等性類(lèi)固醇的合成和配子生成，進(jìn)而影響生殖[52]；流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及生殖系統(tǒng)血液微循環(huán)有一定影響，因此可能會(huì)引發(fā)生殖系統(tǒng)疾病，越來(lái)越多的證據(jù)表明AS（動(dòng)脈粥樣硬化）與炎癥有關(guān)[53]；抗葉酸性（Antifolate resistance）會(huì)影響機(jī)體內(nèi)葉酸對(duì)環(huán)境雌激素所誘導(dǎo)的生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)和改善作用，此外，還可能影響睪丸抗氧化功能、生精細(xì)胞凋亡、精子質(zhì)量和生精小管組織結(jié)構(gòu)[54]。

3 討論

目前對(duì)五子衍宗丸的藥效成分已有較為深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[55]其活性成分為五味子醇A、車(chē)前子膠、菟絲子甙、枸杞多糖、有機(jī)酸、維生素C 等，而本研究基于五子衍宗丸治療不育、陽(yáng)痿、早泄三種疾病的藥效化合物類(lèi)別圖，得出藥效化合物種類(lèi)為：甾體化合物、苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)、醇類(lèi)以及生物堿，其中甾體化合物含量為42%-48%，苯丙素類(lèi)化合物含量為11%-15%，黃酮類(lèi)化合物含量為12%-14%，醇類(lèi)化合物含量為9%-12%，生物堿含量為9%-10%。對(duì)于苯丙素類(lèi)化合物，其代表性物質(zhì)為五味子醇乙（Gomisin），它的主要來(lái)源為木蘭科植物華中五味子，具有益氣補(bǔ)虛、滋陰益精、抗氧化、抗衰老等功效[56]。此外，其對(duì)曲細(xì)精管的發(fā)育有益，還能促進(jìn)精子的發(fā)生，對(duì)機(jī)體的性機(jī)能有一定的促進(jìn)作用[57]。

五子衍宗丸是一個(gè)中藥復(fù)方，組方為枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子五味中藥，方中發(fā)揮補(bǔ)腎之功的是枸杞子和菟絲子，產(chǎn)生滋精之效的是覆盆子，而可生血的則是五味子，車(chē)前子能利尿固精。此方可補(bǔ)益腎氣、填精補(bǔ)髓及壯陽(yáng)生精，用于治療遺精早泄、陽(yáng)痿不愈等生殖系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代臨床上用于治療不育、早泄、陽(yáng)痿、腎虛腰疼、尿后余瀝、腎病綜合征以及糖尿病腎病等。

中藥復(fù)方藥劑在現(xiàn)代臨床中有許多應(yīng)用，也產(chǎn)生了較好的治療效果，在調(diào)理治病方面有著其獨(dú)特的作用。然而，許多中藥復(fù)方的成分特征和藥效機(jī)制暫不明確，在一定程度上成為了中藥復(fù)方藥劑在臨床上進(jìn)行推廣的阻礙。因此，只有探明中藥復(fù)方的藥效成分、蛋白靶點(diǎn)和作用機(jī)制，再為其創(chuàng)立合適而嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)來(lái)保障臨床用藥的安全有效，加速中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。

中醫(yī)治病講究辨證論治，是從整體角度去分析病因、病機(jī)，再按“君、臣、佐、使”的方式進(jìn)行方劑配伍，利用其中多味中藥的協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體不平衡狀態(tài)。以上這些中醫(yī)藥學(xué)的思想方法體現(xiàn)了多成分、多靶點(diǎn)和綜合調(diào)控的理念，其與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的探究思路很相像，所以，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中醫(yī)藥學(xué)可以結(jié)合起來(lái)共同研究，這樣也能取得更好的研究成果，現(xiàn)在也有許多用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的成果來(lái)研究中藥有效成分、預(yù)測(cè)中藥靶點(diǎn)、闡明中藥作用機(jī)制、開(kāi)發(fā)中藥新適應(yīng)癥、合理設(shè)計(jì)新方等[58]。

傳統(tǒng)丸劑五子衍宗丸的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展很快，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能更好更快的分析其作用機(jī)制，有些結(jié)論對(duì)揭示人類(lèi)衰老的基本機(jī)制有一定促進(jìn)作用，但是對(duì)于五子衍宗丸的配伍機(jī)制的研究相對(duì)甚少[59]，有待于進(jìn)一步系統(tǒng)設(shè)計(jì)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)合中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)得出新成果。

本研究借助中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)建立“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)得到五子衍宗丸治療不育、陽(yáng)痿、早泄三種疾病的高頻共性化合物，再分析每種疾病藥效化合物所屬類(lèi)別得出五子衍宗丸治療上述三種疾病的主要化學(xué)成分；通過(guò)蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的高頻共性靶點(diǎn)；通過(guò)基因本體（GO）功能富集分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的GO 高頻共性基因；通過(guò)基于京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的KEGG 高頻共性通路。對(duì)于本研究得到的高頻共性化合物、藥效成分、作用靶點(diǎn)、基因和通路，選取其中有代表性的進(jìn)行作用機(jī)制的闡述。

4 結(jié)論

通過(guò)建立“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的55 個(gè)高頻共性化合物，其中槲皮素和山奈酚頻率較高，分析每種疾病藥效化合物所屬類(lèi)別，得出甾體類(lèi)化合物是五子衍宗丸治療上述三種疾病的主要化學(xué)成分；通過(guò)蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的10 個(gè)高頻共性靶點(diǎn)，其中以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白細(xì)胞介素 6（IL6）和雌激素受體 α（ESR1）等為主；通過(guò)基因本體（GO）功能富集分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的30 個(gè)GO高頻共性基因，其中以雌性性腺發(fā)育（female gonad development）和生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（reproductive structure development）為主，通過(guò)基于京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，得到五子衍宗丸治療上述三種疾病的6 條KEGG 高頻共性通路，其中以雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）和流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）為主。

本研究利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)五子衍宗丸治療不育、早泄、陽(yáng)痿的共性作用機(jī)制進(jìn)行了研究與闡述，以期為其藥效成分研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

附錄

附表1 化合物-疾病交集基因

續(xù)表

附表2 五子衍宗丸與三種疾病的高頻共性化合物

續(xù)表

附表3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析