潘 安，張 淼，史海熠，顧 健，趙 丹，史志龍＊＊

（1. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院 成都 610041；2. 昭通市第一人民醫(yī)院 昭通 657000）

西紅花（Crocus sativusL.）原名番紅花，又名泊夫蘭，撒馥蘭。藏語名喀吉苦功、給薩熱、加央多間[1]，原產(chǎn)于伊朗、希臘、西班牙等中東及歐洲地區(qū)，唐代經(jīng)西藏傳至內(nèi)地[2]，故又稱藏紅花。西紅花作為藥用植物，在中醫(yī)與藏醫(yī)臨床應(yīng)用中有著迥異的功效。藏醫(yī)藥經(jīng)典《晶珠本草》中記載“紅花治一切肝病”，通過配伍調(diào)劑組成的多種藏藥經(jīng)典組方[3]具有疏肝利膽、清熱解毒、健脾胃、利尿等功效。而中醫(yī)多用西紅花治療婦科疾病及跌打損傷[4]。現(xiàn)代臨床研究表明其還具有抗精神失常[5-8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10-11]等作用。

課題組前期對(duì)《四部醫(yī)典》《晶珠本草》《藏藥于方劑》等藏醫(yī)藥典籍中具有防治肝病功效的藏藥復(fù)方進(jìn)行整理研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，西紅花為使用頻次最高的藏藥，如七味紅花殊勝丸、二十五味松石丸、仁青芒覺、九味牛黃丸等藏藥成方制劑中均配伍西紅花，甚至在很多藏藥復(fù)方中西紅花均為治療肝膽疾病的核心藥味[12-13]。早在一千多年前藏醫(yī)就對(duì)肝膽疾病有了較為完整的診治方案[14]，然而由于藏醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)存在較大差異，限制了藏醫(yī)藥推廣，難以充分發(fā)揮藏醫(yī)藥的療效優(yōu)勢(shì)。本研究通過系統(tǒng)生物學(xué)方法，明確西紅花治療肝病的臨床應(yīng)用范圍及作用機(jī)制，為豐富藏醫(yī)藥理論、擴(kuò)大西紅花的應(yīng)用范圍提供科學(xué)理論支撐。

1 方法

1.1 西紅花化學(xué)成分篩選及收集靶點(diǎn)

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)[15]（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集西紅花的化學(xué)成分，并結(jié)合其成分的專屬性、口服利用率、生物利用率等進(jìn)行篩選。繪制化學(xué)成分三維結(jié)構(gòu)圖。上傳至PharmMaper 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php）預(yù)測(cè)化合物靶點(diǎn),并刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.2 構(gòu)建“成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及分析

通過Cytoscape 3.7.1 軟件對(duì)西紅花的“成分-靶點(diǎn)”進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)的建立，并利用軟件中的Networkanalyzer進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析[16]。

1.3 PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析及KEGG富集

將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)復(fù)制到String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）的 Multiple proteins 中 ，Organism 選 擇Homo sapiens 進(jìn)行分析，選擇互動(dòng)數(shù)（interaction score）大于90%得到PPI互作網(wǎng)絡(luò)和KEGG通路。

1.4 肝病相關(guān)通路及肝病靶點(diǎn)

通過 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）對(duì)“1.3”中保存的KEGG 通路進(jìn)行檢索并結(jié)合文獻(xiàn)，確定與肝病相關(guān)度較高的通路。利用OMIM、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)獲取病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝細(xì)胞癌、肝纖維化、肝硬化等常見肝病[17-18]的靶點(diǎn)，并將其與西紅花靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。

1.5 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

建立“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)庫(kù)，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，對(duì)其進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 成分及靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到70 種西紅花的化合物，參考其成分的專屬性、口服利用率、生物利用率等篩選出19 種目標(biāo)化合物（表1），通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的西紅花新苷甲（Crosatoside A）、紅花色素A（Safflor Yellow A）等均只存在于西紅花中；有研究表示西紅花可能的活性成分為藏紅花素（Crocin I、Crocin 2）、藏 紅 花 酸 （Crocetin）等[19-20]；通 過PharmMaper 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶點(diǎn)后，得到了包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC、p38 絲裂原激活蛋白激酶類（p38MAPK）中的MAPK14 和細(xì)胞外蛋白配體表皮生長(zhǎng)因子家族中的EGFR[21]等80個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及分析

將藏藥西紅花成分與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1）。西紅花“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中共有19 個(gè)化合物，80 個(gè)靶點(diǎn)。靶點(diǎn)Average Degree 為 11.15，以 Degree ≥18 為條件篩選出10個(gè)西紅花可能的核心靶點(diǎn)（表2）。

表格 1 西紅花目標(biāo)化合物

2.3 PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析及KEGG通路富集

將80 個(gè)西紅花靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）得到PPI互作網(wǎng)絡(luò)（圖2），圖中的圈為靶點(diǎn)，其Degree值越大圈越大，度值從大到小,顏色由亮變暗；而邊的綜合得分越高邊越粗，綜合得分從大到小,顏色由亮變暗。并富集出149 條KEGG 通路。這些通路大部分都與癌癥、肝病有關(guān)，其中包括前列腺癌(Prostate cancer)、結(jié)腸直腸癌(Colorectal cancer)、胃癌（Gastric cancer）、肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma）、乙型肝炎（Hepatitis B）、丙型肝炎（Hepatitis C）等。

2.4 肝病相關(guān)通路及肝病靶點(diǎn)

利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/）結(jié)合相應(yīng)文獻(xiàn)將149 條通路逐條檢索，篩選出12 條具有顯著意義（P＜0.01）且與肝病相關(guān)度較高的通路（圖3），其中Proteoglycans in cancer 通路可通過調(diào)控Glypicans、Agrin、Versican 等三種蛋白聚糖參與肝癌的發(fā)生及表達(dá)等過程[22-24]，此外該通路還參與多種類型腫瘤的增殖、黏附、血管生成和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。MAPK signaling pathway 中活化的ERK 亞族進(jìn)入細(xì)胞核后通過激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞周期來影響其增殖所引起的肝纖維化[25-26]；PI3K-Akt signaling pathway 通過影響肝臟細(xì)胞外基質(zhì)、肝星狀細(xì)胞、肝竇毛細(xì)血管化參與肝纖維化[27]。Th17 cell differentiation 通路可分化產(chǎn)生IL-17 和IL-22，有研究表明IL-22 可以促進(jìn)肝細(xì)胞存活，并刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白，促進(jìn)肝細(xì)胞在感染或炎癥后的恢復(fù)過程[28-32]。經(jīng)過以上分析，可推測(cè)西紅花在肝癌、肝纖維化等方面具有潛在的藥物開發(fā)價(jià)值。

圖1 西紅花“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表 2 西紅花關(guān)鍵靶點(diǎn)及拓?fù)鋵W(xué)分析

圖2 西紅花網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 西紅花網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中肝病相關(guān)通路分析

2.5 西紅花“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

建立“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖4），結(jié)合此網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果與“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、肝病相關(guān)通路的分析結(jié)果推斷出西紅花的關(guān)鍵靶點(diǎn)為SRC和EGFR。SRC 為酪氨酸蛋白激酶，有研究表明其在肝癌的治療中扮演著重要的角色[33]；EGFR 在肝細(xì)胞增殖、抗肝纖維化中都是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[34]。通過對(duì)“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)西紅花對(duì)肝細(xì)胞癌和病毒性肝炎的靶點(diǎn)匹配率較高，特別是乙型肝炎，通過對(duì)Hepatitis B 通路的研究發(fā)現(xiàn)西紅花關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC 參與了細(xì)胞的增殖與分化過程。

表3 西紅花網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖4 西紅花成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

西紅花在中醫(yī)理論中多用于治療婦科疾病，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析中發(fā)現(xiàn)的ESR1 可能同乳腺癌的治療有著密切的聯(lián)系[35]，并且富集出的通路中雌激素信號(hào)通路與靶點(diǎn)匹配程度較高。

西紅花在藏醫(yī)藥中的應(yīng)用相比于中醫(yī)更為廣泛也更為悠久，在《晶珠本草》中記載“西紅花可治療一切肝病”，根據(jù)藏醫(yī)藥經(jīng)典《四部醫(yī)典》的核心理論三因?qū)W說——“隆、赤巴、培根”，將臨床上的每種肝病細(xì)分為“隆”盛型，“赤巴”盛型，“培根”盛型[36]，又因現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論上劃分肝病范圍與藏醫(yī)理論劃分肝病依據(jù)不同，通過本研究，我們初步對(duì)應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論西紅花治療肝病范圍與藏醫(yī)藥理論治療肝病的范圍。西紅花可以對(duì)各類常見肝病都具有一定的防治作用，根據(jù)《四部醫(yī)典》記載“赤巴”病入侵肝臟時(shí)，肌肉顏色呈青色、肝區(qū)疼痛、頭痛、眼痛、唾液粘稠等癥狀可對(duì)應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的肝腫瘤、病毒性肝炎等。

現(xiàn)今傳統(tǒng)藏醫(yī)藥由于宗教、文化、習(xí)俗等差異導(dǎo)致非藏區(qū)的人們對(duì)其接受度不高，限制了藏醫(yī)藥的發(fā)展。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)西紅花防治肝病的機(jī)制進(jìn)行了初步闡述，明確了西紅花在臨床的用藥范圍，為西紅花的應(yīng)用與推廣提供新的思路和科學(xué)支撐。