羅子清 ，唐麗娟 ，劉云濤 ，3，張忠德 ＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 廣東省中醫(yī)院 廣州510405；3. 廣東省中醫(yī)急診研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510405）

流感暴發(fā)造成的人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失仍然是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題[1，2]。病毒的侵襲激活肺上皮、內(nèi)皮細(xì)胞迅速產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如白介素1(Interleukin 1 Alpha/Beta, IL-1α/β)、白 介 素 6(Interleukin 6,IL-6)、γ 干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factors,TNF-α)、環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase 2,COX2)等[3]，對(duì)機(jī)體進(jìn)行猛烈攻擊的現(xiàn)象，稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。流感患者往往不是死于病毒的直接攻擊，機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂所引發(fā)的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”才是流感患者的奪命殺手。“細(xì)胞因子風(fēng)暴”能直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，或招募巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)肺泡上皮-內(nèi)皮屏障損傷，導(dǎo)致肺泡內(nèi)的纖維蛋白、紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞的蛋白質(zhì)水腫液累積，進(jìn)一步減少肺泡的氣體交換，引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)[4]。流感的嚴(yán)重性在于炎癥浸潤導(dǎo)致的急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)，可在短時(shí)間內(nèi)引起呼吸衰竭，此為流感患者最常見的死亡原因。支持性護(hù)理和抗病毒藥物是流感的主要治療手段，藥物當(dāng)中以神經(jīng)氨酸酶抑制劑(Neuraminidase Inhibitors,NAIs)[5]，如奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋等最為常用。美國感染病學(xué)會(huì)流感指南[6]推薦盡早啟用NAIs 進(jìn)行抗病毒治療，超過48小時(shí)后使用NAIs的臨床獲益將減少，但臨床上錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)的患者不在少數(shù)。流感中后期可以出現(xiàn)病毒性心肌炎、病毒性腦炎、膿毒性休克、多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[7]。傳統(tǒng)的抗病毒藥物僅針對(duì)病毒本身進(jìn)行打擊，如何降低細(xì)胞因子水平、改善由于炎癥浸潤引起的ALI 和ARDS 尚未引起足夠重視。使用NAIs是否能減少患者由于免疫紊亂罹患的并發(fā)癥、減少重癥發(fā)生率仍缺乏有力的臨床證據(jù)。此外，流感病毒存在抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)化的問題[8]，導(dǎo)致病毒持續(xù)變異[9]，這無疑加大了抗病毒藥物研發(fā)的成本和難度。綜上，宿主免疫功能失衡、炎癥反應(yīng)劇烈增加了重癥流感患者的不良結(jié)局，這使得從減輕炎性損傷、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)宿主的角度出發(fā)，研發(fā)新型流感藥物有其必要性和重要性。

已有研究表明中藥抗流感病毒的有效性毋庸置疑，其抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及宿主保護(hù)的作用也不容忽視。新香沖劑系全國名老中醫(yī)周仲瑛教授師法《溫病條辨》中的新加香薷飲，以清熱解表祛濕法為指導(dǎo)，基于嶺南濕熱為患的致病特點(diǎn)擬定。后由廣東省中醫(yī)院在嶺南道地藥材資源基礎(chǔ)上，結(jié)合嶺南地區(qū)居民身體素質(zhì)特點(diǎn)將其發(fā)展為院內(nèi)制劑。新香沖劑由香薷、廣藿香、青蒿、扁豆花、黃芩、連翹、鴨跖草、柴胡、前胡共9 味藥物組成。周老認(rèn)為流感的治療重在“芳香宣透”[9]，因此取香薷作為君藥以芳香化濕、祛暑解表，輔以青蒿、黃芩為臣藥清透血熱，佐以廣藿香、扁豆花、鴨跖草、連翹、柴胡、前胡共奏清熱祛濕、解表透邪之功。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，新香沖劑對(duì)急性病毒性上呼吸道感染有良好的治療效果，可明顯解熱鎮(zhèn)痛，改善患者頭身困重、乏力等癥狀，且未見明顯不良反應(yīng)[10-12]。同時(shí)周老認(rèn)為中醫(yī)對(duì)病毒感染疾患的治療不應(yīng)單純針對(duì)病毒，更應(yīng)重視調(diào)整人體的整體機(jī)能、充分發(fā)揮其非特異性治療作用[13]。周老所強(qiáng)調(diào)的“抗病毒”“調(diào)機(jī)能”雙管齊下的思想，與研發(fā)兼?zhèn)淇共《尽⒖寡?、調(diào)節(jié)免疫等多效用的流感新藥的思想，有異曲同工之妙。因此，本研究基于中醫(yī)理論、新香沖劑的有效性和安全性，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，闡明新香沖劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，嘗試從多角度探索新香沖劑治療流感的作用機(jī)制，以期將其在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 新香沖劑的成分收集與篩選

新香沖劑由9 味中藥組成，分別是香薷、廣藿香、青蒿、扁豆花、黃芩、連翹、鴨跖草、柴胡、前胡?；赟ymMap 數(shù)據(jù)庫[14](https://www.symmap.org/)搜集以上9味中藥的化合物成分，在PubChem 數(shù)據(jù)庫[15](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取成分的Canonical SMILES 號(hào)。為了嚴(yán)格甄選新香沖劑的活性成分，首先通過FAF-Drugs4 平臺(tái)[16](http://fafdrugs4.mti.univparis-diderot.fr/)評(píng)價(jià)化合物的吸收、分布、代謝和消除(Absorption, Distribution, Metabolism and Elimination,ADME)參數(shù)，選取評(píng)價(jià)為“accept”的成分。再利用TargetNet數(shù)據(jù)庫[17](http://targetnet.scbdd.com/)評(píng)價(jià)成分的里賓斯基五規(guī)則(Lipinski Rules of Five,LR)得分，選取LR得分≥75%的活性成分。

1.2 新香沖劑靶點(diǎn)預(yù)測

利用活性成分的Canonical SMILES 號(hào)，通過TargetNet 平臺(tái)預(yù)測各成分的靶點(diǎn)，收集Prob=1 的靶點(diǎn)，形成新香沖劑的靶點(diǎn)集。

1.3 流感靶點(diǎn)的獲取

為了得到更貼近臨床真實(shí)情況的流感疾病靶點(diǎn)集，以“influenza”為關(guān)鍵詞，檢索GEO 數(shù)據(jù)庫[18](https://www. ncbi. nlm. nih. gov/gds/)，選 取 物 種 為“Homo Sapiens”的芯片數(shù)據(jù)(編號(hào)：GSE101702)。該數(shù)據(jù)集包括了107 個(gè)流感樣本，和52 個(gè)健康人樣本。進(jìn)行GEO2R 分析，選取|logFC|＞1.5，P＜0.05 的靶點(diǎn)，利用GSEA 軟件對(duì)芯片靶點(diǎn)名稱進(jìn)行注釋，利用UniProt 網(wǎng)站[19](https://www.uniprot.org/)篩選人源化靶點(diǎn)，最終形成人類流感疾病的靶點(diǎn)集。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

構(gòu)建新香沖劑中藥-成分、成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，找出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。HINT數(shù)據(jù)庫[20](http://hint.yulab.org/)是一個(gè)高質(zhì)量的PPI 數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)主要來源于高通量測序和經(jīng)由文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。利用 Cytoscape3.6.0 軟件[21]，以 HINT 數(shù)據(jù)庫獲得的人類疾病基因作為背景網(wǎng)絡(luò)，分別構(gòu)建新香沖劑靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)，流感疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Merge功能，取新香沖劑PPI網(wǎng)絡(luò)和人類流感疾病PPI網(wǎng)絡(luò)的交集，提取交集網(wǎng)絡(luò)，形成新香沖劑靶向流感的核心子網(wǎng)絡(luò)。對(duì)核心子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)連接度(Degree)和介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)(Hub-target)。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8 在線分析工具[22](https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)核心子網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG[23]通路富集分析。選擇生物過程、分子功能、細(xì)胞組分3 個(gè)模塊，利用Graphpad Prism5.0 繪制條形圖；利用OmicShare tool 在線平臺(tái)(http://www.omicshare.com/tools)繪制通路富集氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系

基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析甄選出的關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用分子對(duì)接的方法驗(yàn)證二者的相互作用關(guān) 系 。 利 用 ChemBio3D Ultra13.0[24]和 Autodock Tool1.5.6[25]對(duì)關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，過程包括能量最小化、去除水分子、合并非極性氫。隨后利用Vina1.1.2 軟件[25]進(jìn)行盲法對(duì)接(Blind Docking)，能量范圍(Energy Range)設(shè)置為5，精度(Exhaustiveness)為100，輸出20 個(gè)預(yù)測結(jié)果。選取其中結(jié)合能得分(Affinity Score)最小的對(duì)接模型，利用LigPlus1.4[26]、PyMOL1.7[27]軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析，明確關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵化合物的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 新香沖劑的活性成分

從新香沖劑中搜集到了126個(gè)滿足條件的活性成分。一個(gè)中藥中包含多個(gè)活性成分；同一個(gè)活性成分可以存在多個(gè)中藥當(dāng)中。在新香沖劑中，至少對(duì)應(yīng)3個(gè)或以上中藥的活性成分，分別有槲皮素，丁香酚，芹菜素，木犀草素，1,8-桉葉素，山柰酚，廣藿香醇，百里香酚，阿魏酸(圖1)。

2.2 新香沖劑靶點(diǎn)和流感疾病靶點(diǎn)

TargetNet 成功預(yù)測了126 個(gè)活性成分的靶點(diǎn)，其中香薷 84 個(gè)、廣藿香 82 個(gè)、青蒿 75 個(gè)、扁豆花 35 個(gè)、黃芩 97 個(gè)、連翹 101 個(gè)、鴨跖草 54 個(gè)、柴胡 107 個(gè)、前胡88 個(gè)，除重后總共得到新香沖劑的140 個(gè)靶點(diǎn)。芯片分析得到86個(gè)流感疾病靶點(diǎn)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果

新香沖劑中藥-成分網(wǎng)絡(luò)(圖1)中包括131 個(gè)節(jié)點(diǎn)，167 條邊；成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)中包括264 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2943 條邊。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的連接度調(diào)節(jié)其形狀大小，連接度越大，則節(jié)點(diǎn)形狀越大，連接度越小，則節(jié)點(diǎn)形狀越小，連接度越大的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要。對(duì)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，連接度排在前9 名的活性成分為芹菜素，木犀草素，阿魏酸，丁香酚，1,8-桉葉素，對(duì)香豆酸，咖啡酸，丹皮酚，槲皮素，它們是新香沖劑中的重要活性成分。芹菜素的連接度在所有重要活性成分中排名第1，是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分。

新香沖劑靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和流感疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的唯一共同靶點(diǎn)是基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP9)，因此 MMP9 為這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將新香沖劑PPI 網(wǎng)絡(luò)與流感疾病PPI網(wǎng)絡(luò)取交集(圖3A)，從而形成核心子網(wǎng)絡(luò)(圖3B)。該核心子網(wǎng)絡(luò)中有119個(gè)節(jié)點(diǎn)，921條邊。對(duì)核心子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出連接度≥8、介數(shù)中心性≥0.014 的靶點(diǎn)，分別為熱休克蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)、細(xì)胞分裂周期蛋白37(Cell Division Cycle Protein 37, CDC37)、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)，它們是整個(gè)核心子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 基因本體和通路富集分析

對(duì)核心子網(wǎng)絡(luò)的119 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)分析，選擇P＜0.05的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分3個(gè)模塊繪制條形圖(圖4)。在生物學(xué)過程中，涉及了一氧化氮(Nitric Oxide,NO)生物合成過程的正向調(diào)節(jié)，缺氧反應(yīng)，Notch信號(hào)，IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控，核因子κB 抑制劑 (Inhibitor of NF-κB，I-κB)激酶/核因子 κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)，I 型干擾素(Type I Interferons,IFNs)生產(chǎn)的正向調(diào)節(jié)，細(xì)胞對(duì)TNF-α 的反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)，一氧化氮合酶活性的正向調(diào)節(jié)，EGFR 信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)，病毒過程，IFNs 介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)控，細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β)受體信號(hào)通路，細(xì)胞凋亡，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)活性激活，對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。在分子功能中，涉及了組蛋白結(jié)合，鈣粘附素與細(xì)胞間粘附的關(guān)系，酶結(jié)合，p53結(jié)合，一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性，熱休克蛋白結(jié)合等。在細(xì)胞組分中，核染色體，蛋白復(fù)合物，核小體，核質(zhì)等項(xiàng)目排名靠前。

圖1 新香沖劑中藥-成分網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 新香沖劑成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 A.流感靶點(diǎn)PPI-新香沖劑PPI交集B.新香沖劑靶向流感的核心子網(wǎng)絡(luò)

KEGG 通路分析共獲得 51 條通路，以P＜0.05，基因數(shù)≥4 為度，顯著富集的通路有44 條，與流感疾病顯著相關(guān)的重要通路12 條(圖5)。結(jié)果顯示，核心子網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)涉及的疾病通路為甲型流感通路。與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路有3 條，分別是TLR(Toll Like Receptors,TLR)信號(hào)通路，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding Oligomerization Domain,NOD)樣受體信號(hào)通路，RLR(RIG-I like Receptor,RLR)信號(hào)通路。涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路有6 條，分別為低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)信號(hào)通路，磷脂酰肌醇 3 激酶( Phosphatidylinositol 3 Kinase ,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/AKT)信號(hào)通路，叉頭家族轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead Box O,FoxO)信號(hào)通路，TGF-β信號(hào)通路，Notch 信號(hào)通路，NF-κB 信號(hào)通路。涉及細(xì)胞生長和死亡的通路有2 條，分別為有細(xì)胞凋亡，p53 信號(hào)通路。

2.5 關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析可知，芹菜素是成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，MMP9 是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。盲法對(duì)接后產(chǎn)生了20 個(gè)配體-蛋白結(jié)合預(yù)測模型，對(duì)結(jié)合能最低的Mode 1 進(jìn)行可視化分析(圖6、圖7)。由亮氨酸、組氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等氨基酸殘基形成結(jié)合口袋，芹菜素與MMP9 的谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、精氨酸之間通過7個(gè)氫鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)合力，表明芹菜素與MMP9的結(jié)合較為緊密。

圖4 新香沖劑靶向流感的核心子網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的GO分析

圖5 新香沖劑靶向流感核心子網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

中藥復(fù)方藥味多，成分繁雜，強(qiáng)調(diào)君臣佐使的配伍原則，一直是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的難題。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科，構(gòu)建復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從宏觀的角度探索生物網(wǎng)絡(luò)中各要素的相互作用[28]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的宏觀視野和中醫(yī)治病提倡的“整體觀念”是不謀而合的[29]。分子對(duì)接是研究配體與受體之間相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式和親合力，實(shí)現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)相似性輔助藥物設(shè)計(jì)的方法[30]。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，有望對(duì)新香沖劑的復(fù)雜組方進(jìn)行抽絲剝繭的分析，從整體的角度理解其治療流感的現(xiàn)代藥理學(xué)內(nèi)涵。

3.1 新香沖劑對(duì)流感的治療作用

新香沖劑的君藥為香薷，臣藥為青蒿和黃芩，廣藿香、扁豆花、鴨跖草、連翹、前胡、柴胡均為佐使藥物。香薷，有發(fā)汗解表，化濕和中之功效，臨床上主要用于惡寒發(fā)熱、暑濕感冒等[31]。香薷的主要成分黃酮類是發(fā)揮解熱抗炎、增強(qiáng)免疫作用的主要成分[32]。經(jīng)香薷乙醇提取物喂養(yǎng)的小鼠對(duì)流感病毒感染有保護(hù)作用且肺組織的病毒滴度較低；另外香薷水提物能降低脂多糖致熱大鼠的肛溫，降低TNF-α、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)、IL-1β 和過氧化物酶的表達(dá)水平，亦能增強(qiáng)體液免疫[33]。青蒿能截瘧解暑，用于暑邪發(fā)熱等。青蒿水提物中的多種成分如總香豆素等，能降溫解熱，通過下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)，抑制炎癥因子的表達(dá)[34]。黃芩清熱解毒，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤的功效，其提取物能顯著抑制流感病毒的活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，減輕IL-1β 誘導(dǎo)的炎癥損傷[35]。本次研究對(duì)新香沖劑“君、臣、佐、使”的配伍規(guī)律進(jìn)行了科學(xué)的解釋。通過成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，在9種最重要的活性成分中，其中7種來源于香薷，由此體現(xiàn)出香薷的君藥地位。青蒿-黃芩的共同靶點(diǎn)集與香薷靶點(diǎn)集有64.8%的共同靶點(diǎn)，說明青蒿、黃芩作為臣藥可以協(xié)同增強(qiáng)香薷之藥效。

圖6 芹菜素與MMP9相互作用的二維平面圖

圖7 芹菜素與MMP9相互作用的三維示意圖

新香沖劑成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的重要成分芹菜素、木犀草素、槲皮素屬黃酮類化合物，它們對(duì)流感的治療作用不僅體現(xiàn)在抑制病毒的血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的活性，還能保護(hù)宿主、降低病毒感染后的免疫炎性損傷。黃酮類化合物的抗病毒和抗炎的分子機(jī)制各異[36]。芹菜素通過抑制AKT的磷酸化降低病毒的復(fù)制效率[37]，通過阻斷NO介導(dǎo)的COX2 表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)[38]。木犀草素可通過干擾外殼蛋白I復(fù)合物表達(dá)降低甲型流感病毒的產(chǎn)量[39]，通過調(diào)控NF-κB 通路中TGF-β 活化的激酶結(jié)合蛋白2(TGF-beta-activated Kinase Binding Protein 2, TAB2)和NF-κB 等因子的表達(dá)量，減少下游炎性因子IL-1β、TNF-α 以及 COX2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[40，41]，且抑制 MMP9 的分泌[42]。槲皮素、阿魏酸、咖啡酸的抗氧化活性強(qiáng)，能清除自由基，保護(hù)宿主細(xì)胞免受活性氧誘導(dǎo)的損傷[43-45]。阿魏酸抑制COX2 啟動(dòng)子活性從而降低COX2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[46]，阻斷前列腺素合成從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，抑制血小板聚集繼而改善肺部微循環(huán)[47]。丁香酚調(diào)節(jié)鈣鈉離子通道發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[48]，抑制巨噬細(xì)胞的IL-1β，TNF-α 和 COX2 的 mRNA 表達(dá)[49]。1,8-桉葉素是桉樹油的主要成分，可以減少由炎癥介導(dǎo)產(chǎn)生的粘液，用于氣道炎性疾病中改善呼吸困難的癥狀、改善肺功能[50]。接受1,8-桉葉素作為補(bǔ)充治療的小鼠存活時(shí)間更長，炎癥反應(yīng)更輕，肺指數(shù)、病毒滴度和死亡率較低[51]。

EGFR 是新香沖劑靶向流感的核心子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，TGF/EGFR 信號(hào)通路可增強(qiáng)人類肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)[52]，這表明新香沖劑可能靶向EGFR 調(diào)控天然免疫治療流感。GO 分析發(fā)現(xiàn)核心子網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過程有IFNs 的產(chǎn)生和信號(hào)通路的調(diào)控，KEGG 分析發(fā)現(xiàn)了TLR 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、RLR 信號(hào)通路等免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路。以上均佐證了新香沖劑具有調(diào)節(jié)免疫的作用。KEGG 分析涉及的疾病通路是甲型流感通路，說明新香沖劑對(duì)甲型流感有一定的靶向性。

綜上，新香沖劑對(duì)流感的治療作用包括：抑制病毒復(fù)制增殖，降低細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，兼以調(diào)節(jié)免疫，抗氧化保護(hù)宿主細(xì)胞，改善肺部微循環(huán)，鎮(zhèn)痛等。這體現(xiàn)了新香沖劑通過多物質(zhì)，作用于多靶點(diǎn)，經(jīng)由多途徑治療流感的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。

3.2 新香沖劑治療流感的潛在藥靶

本研究發(fā)現(xiàn)MMP9是新香沖劑靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和流感疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的直接共同靶點(diǎn)，MMP9 的重要性不言而喻。MMP9 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，由宿主的正常肺泡巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞因子介導(dǎo)、中性粒細(xì)胞遷移，巨噬細(xì)胞分化等生物學(xué)過程[53]。MMP9與流感、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多種急慢性呼吸道疾病密切相關(guān)，MMP9 的高表達(dá)量和肺功能的低水平呈相關(guān)性[54]。甲型流感病毒能誘導(dǎo)MMP9 在巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)[55]，增加MMP9 在血清、肺和心臟中的表達(dá)，從而降解細(xì)胞外間質(zhì)，參與流感的病理過程?！凹仔土鞲胁《?細(xì)胞因子-胰蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶循環(huán)”是重癥流感患者多器官功能衰竭的重要機(jī)制之一[56，57]。因此阻斷 MMP9 表達(dá)，降低 MMP9 的表達(dá)水平，是減輕流感炎癥反應(yīng)、降低流感重癥轉(zhuǎn)化率的途徑之一。在感染早期，克拉霉素可通過減少心臟和肺的炎性細(xì)胞聚集，明顯抑制血清中MMP9 的表達(dá)[58]。黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1 也能對(duì)MMP9 起到間接抑制作用，它是NF-κB 的陽性調(diào)節(jié)因子，可以降低肺泡巨噬細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)因子，從而減少M(fèi)MP9 的表達(dá)[59]。治療流感的方劑，例如由金銀花、連翹、板藍(lán)根組成的疏風(fēng)宣肺方和麻黃、石膏、羌活組成的解表清理方，也有抑制MMP9 的作用[60]。本次研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素與MMP9可以通過多個(gè)氫鍵緊密結(jié)合。新香沖劑組方中有9 種藥物，其中5 種含芹菜素，它們分別是香薷、青蒿、黃芩、廣藿香、扁豆花?；诖?，我們推斷新香沖劑的作用途徑之一是通過調(diào)控宿主細(xì)胞MMP9的表達(dá)發(fā)揮其治療流感的作用。MMP9 是流感、哮喘等多種呼吸道疾病的重要靶點(diǎn)，芹菜素靶向MMP9 治療多種呼吸道疾病的具體機(jī)制有待深入研究。

盡管本次研究有一些新的發(fā)現(xiàn)，但仍然存在局限性。第一，對(duì)于免疫低下或免疫缺陷的特殊人群，例如老人、器官移植術(shù)后患者、艾滋病人等，基于調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥損傷發(fā)揮作用的新香沖劑對(duì)該類人群的流感治療效果難以評(píng)價(jià)。第二，數(shù)據(jù)庫搜集藥物成分時(shí)，受限于現(xiàn)有的科研條件，缺失Canonical SMILES 號(hào)的化合物沒被納入做ADME 參數(shù)評(píng)價(jià)，這可能會(huì)剔除了名稱未被規(guī)范、但有研究價(jià)值的化合物。第三，中藥數(shù)據(jù)庫中扁豆花、鴨跖草等冷門生僻的藥物成分信息少，不能反映藥物的真實(shí)全貌，這可能會(huì)錯(cuò)失一些新發(fā)現(xiàn)。由此引出對(duì)未來研究的啟示，一是針對(duì)病毒本身進(jìn)行打擊的藥物靶點(diǎn)仍不失其研究價(jià)值；二是需要建立更多信息完善的、高質(zhì)量的中藥數(shù)據(jù)庫，以方便進(jìn)行中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究。