譙明鳴 ，熊 亮 ，劉 宇 ，郭 力 ，劉 菲 ＊＊，彭 成

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 成都 611137；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所 成都 611137）

姜黃和莪術(shù)為姜科姜黃屬（Curcuma）中不同種植物的干燥根莖，其中姜黃來源單一，為姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖，是著名的川產(chǎn)道地藥材，而莪術(shù)有多種基源，為蓬莪術(shù)Curcuma phaecocaulisVal.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 或溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥根莖[1]，但其中僅蓬莪術(shù)屬于川產(chǎn)道地藥材。因此，本研究著重對(duì)兩種川產(chǎn)道地藥材姜黃和蓬莪術(shù)展開研究。兩者的功效類似，均可活血行氣、通經(jīng)止痛，但又有所區(qū)別。姜黃始載于《新修本草》，主心腹結(jié)積，下氣；莪術(shù)始載于《藥性論》，治女子血?dú)庑耐?，破痃癖冷氣?！侗静菥V目》曰：“姜黃入脾，兼治血中之氣；莪術(shù)入肝，治氣中之血，稍有不同?！薄侗静萁?jīng)疏》中記載“姜黃，入足太陰，亦入足厥陰經(jīng)，苦能瀉熱，辛能散結(jié)，故主心腹結(jié)積之屬于血分者，兼能治氣，故又云下氣；莪術(shù)，入足厥陰肝經(jīng)氣分，能破氣中之血，入氣藥發(fā)諸香，主積聚諸氣，為最要之藥”。今之學(xué)者[2]結(jié)合古代典籍和臨床經(jīng)驗(yàn)，將活血化瘀中藥歸為和血、活血、破血三類，其中姜黃歸為“活血”類，而莪術(shù)歸為“破血”類藥物，現(xiàn)代《臨床中藥學(xué)》教材[3]亦根據(jù)兩者功效主治特點(diǎn)將姜黃歸為“活血止痛藥”，而莪術(shù)歸為“破血消癥藥”，但兩者活血功效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

現(xiàn)代研究表明，姜黃與莪術(shù)中均已發(fā)現(xiàn)了生物堿、黃酮、甾體、單萜、二萜、三萜、姜黃素類等[4-6]各類成分，其中主要成分類型有兩類[7]：姜黃素類、倍半萜類。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)姜黃提取物能不同程度的影響凝血功能[8]、抑制血小板聚集[9]以及抗血栓作用[10]，臨床上常用于預(yù)防和治療腫瘤、各種心血管疾病以及痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等婦科疾病[11-14]；莪術(shù)提取物也顯示出一定的抗腫瘤[15]、抗血小板聚集[16]和抗血栓作用[17]，臨床上尤其多用于治療胃癌、肺癌等各種常見惡性腫瘤疾病[18-19]。姜黃與莪術(shù)來源相近，所含化學(xué)成分類型相似，現(xiàn)代藥理作用亦有相同之處，但臨床用藥卻差異明顯，不可混用。前人研究多以姜黃或莪術(shù)單味藥為研究對(duì)象，鮮見將兩者同時(shí)作為研究對(duì)象于同一試驗(yàn)中對(duì)比研究的報(bào)道，未能系統(tǒng)的闡述兩者活血功效差異原因。因此，本實(shí)驗(yàn)采用抗血小板聚集試驗(yàn)和舒張離體血管試驗(yàn)比較研究姜黃和莪術(shù)中姜黃素類和萜類成分的活性差異，以期闡明兩者傳統(tǒng)活血功效差異的原因。

1 材料

1.1 儀器

本研究的實(shí)驗(yàn)儀器包括：ACUITYTM 超高效液相色譜-SYNAPT G2 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS，美國(guó)Waters 公司），SC-2000 型血小板聚集測(cè)試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司），Allegra X-30R 型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司），優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司），RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器），DZKW-S-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），AL104 電子天平（瑞士Mettler Toled 公司），4°C 低溫冰箱（青島海爾股份有限公司），M870B5/10 型離體組織灌流系統(tǒng)、ML870 型PowerLab 生物信號(hào)采集系統(tǒng)、MLT0201 型張力換能器、LabchartPro 均購(gòu)自埃德儀器國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 藥材

本研究的藥材：姜黃飲片購(gòu)于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室李敏教授鑒定為姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖。蓬莪術(shù)藥材采于四川省崇州市三江鎮(zhèn)宋橋村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物研究室李敏教授鑒定為蓬莪術(shù)Curcuma phaecocaulisVal.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

本研究的藥品與試劑：聚酰胺（江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司）；分析純無水乙醇、枸櫞酸三鈉（二水）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、分析純葡萄糖（Glucose，C6H12O6）、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、分析純氯化鈣（Calcium Cloride，CaCl2）、分 析 純 磷 酸 二 氫 鉀（Potassium Dihydrogen Phosphate，KH2PO4）、分 析 純 碳 酸 氫 鈉（Sodium Hydrogen Carbonate，NaHCO3）、分析純氯化鉀（Potassium Chloride，KCl）、分析純氯化鈉（Sodium Chloride，NaCl）和分析純硫酸鎂（Magnesium Sulfate，MgSO4）均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；阿魏酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S31124）；0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；腺苷-5′-二磷酸鈉鹽（批號(hào)SLBB1854V）、苯腎上腺素（PHE，批號(hào)1000957684）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 動(dòng)物

新西蘭兔，雄性，體質(zhì)量約2.5 kg；SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，均購(gòu)自成都達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)溫度21℃～27 ℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照動(dòng)物管理章程。

2 方法

2.1 溶液的配制

枸櫞酸三鈉抗凝劑的配制：稱取3.8 g 枸櫞酸三鈉，加生理鹽水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，再加生理鹽水定容至刻度，搖勻，即得3.8%枸櫞酸三鈉溶液。

腺苷-5′-二磷酸鈉鹽溶液的配制：稱取6.40 mg腺苷-5′-二磷酸鈉鹽于50 mL量瓶中，加入生理鹽水定容至刻度，搖勻，即得300μmol/L腺苷-5′-二磷酸鈉鹽溶液。

陽(yáng)性藥（阿魏酸鈉）溶液的配制：稱取0.6 g阿魏酸鈉于50 mL 量瓶中，加入生理鹽水定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為60 mg/mL 阿魏酸鈉高劑量溶液。采用二倍稀釋法稀釋后得30 mg/mL 阿魏酸鈉中劑量溶液和15 mg/mL阿魏酸鈉低劑量溶液。

K-H 液（Kreb’-Henseleit solution）配制(g)：NaCl，13.87；KCl，0.7；KH＜sub＞2＜/sub＞PO＜sub＞4＜/sub＞ ，0.32；MgSO＜sub＞4＜/sub＞，0.28；NaHCO＜sub＞3＜/sub＞，4.2；Glucose，3.64；EDTA，0.018；CaCl＜sub＞2＜/sub＞ ，0.56，加超純水至2 L，pH 7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 姜黃莪術(shù)萜類與姜黃素類成分群的分離與確定

姜黃、莪術(shù)藥材各2 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液并濃縮得總浸膏?？偨嘤镁埘０飞V柱經(jīng)70%甲醇水和100%甲醇洗脫，濃縮后經(jīng)TLC 和UPLC-Q/TOF-MS 檢測(cè)，確定姜黃和莪術(shù)的不同成分群。

2.3 抗血小板聚集試驗(yàn)

家兔心臟取血，3.8%枸櫞酸三鈉溶液抗凝（血液:抗凝劑=9:1），收集于離心管中，混勻抗凝劑和血液。血液以800 r/min 離心10 min，取上層血漿；余下部分再以相同的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心第二次，取上層血漿與第一次所得血漿混勻，即得PRP（富血小板血漿）。取第二次離心的下層血液，以3000 r/min 離心10 min，取上層血漿即PPP（貧血小板血漿）。

試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、阿魏酸鈉低、中、高（15 mg/mL、30 mg/mL、60 mg/mL）劑量組，姜黃和莪術(shù)不同成分群低、中、高（6 mg/mL、12 mg/mL、24 mg/mL）劑量組。取比濁管，分別加入280μL PPP 后，再分別加入各組對(duì)應(yīng)溶液10μL，作為空白溶液。另取比濁管，各加入280μL PRP，再分別加入各組對(duì)應(yīng)劑量溶液10μL，作為相應(yīng)的待測(cè)溶液。血小板聚集儀預(yù)熱至37 ℃，以空白溶液調(diào)零，后換為對(duì)應(yīng)待測(cè)溶液，預(yù)熱60 s，加入 10μL 腺苷-5′-二磷酸鈉鹽溶液，測(cè)定各組血小板聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率[20]，比較姜黃莪術(shù)不同成分群抗血小板聚集活性差異。

聚集抑制率＝(對(duì)照組血小板聚集率－給藥組血小板聚集率)/對(duì)照組血小板聚集率×100%

2.4 舒張離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)

頸椎脫臼處死大鼠，快速取出胸主動(dòng)脈，并置于O2飽和 4°C 的 K-H 液，剔除周圍結(jié)締組織，剪去支旁小血管，將血管剪成3～5 mm 的血管環(huán)。血管環(huán)用兩根不銹鋼蹬型掛鉤水平懸掛于浴管內(nèi)，一端固定于浴管內(nèi)，另一端連接張力換能器，調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力為1 g，采用離體組織灌流模型和PowerLab 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)采集和記錄離體血管環(huán)等距張力的變化。浴槽內(nèi)含K-H 液，恒溫 37°C，持續(xù)通 95% O2+CO2，平衡 60 min，每15 min 更換K-H 液。此后，用KCl（60 mmol/L）預(yù)收縮血管環(huán)，當(dāng)收縮張力達(dá)到坪值后，用預(yù)熱到37 ℃的K-H 液連續(xù)沖洗3 次，每次5 min，待恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力為1 g，再穩(wěn)定30 min。當(dāng)連續(xù)的兩次收縮幅度小于10%，認(rèn)為血管環(huán)組織結(jié)構(gòu)完整，血管環(huán)活性良好，可以開始試驗(yàn)[21]。

經(jīng)活性檢驗(yàn)證明血管環(huán)活性良好后，往浴槽內(nèi)加入KCl（60 mmol/L）預(yù)收縮胸主動(dòng)脈環(huán)，血管收縮張力達(dá)到坪值時(shí)，浴槽內(nèi)累積加入姜黃莪術(shù)各成分群，使其終濃度為 6μg/mL ～500μg/mL，觀察和比較不同濃度下姜黃莪術(shù)各成分群對(duì)KCl（60 mmol/L）預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。KCl（60 mmol/L）所致的最大收縮張力為100%，計(jì)算各濃度姜黃莪術(shù)各成分群所致的舒張百分比，建立姜黃莪術(shù)各成分群濃度依賴收縮曲線[22]，比較不同成分群舒張血管環(huán)作用差異。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad prism 5軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 姜黃莪術(shù)萜類與姜黃素類成分群的分離與確定

姜黃和莪術(shù)總浸膏經(jīng)聚酰胺色譜70%甲醇水洗脫部分，在TLC 檢測(cè)時(shí)，可見光下無顯色，后經(jīng)硫酸乙醇顯色又呈粉色或紫紅色，結(jié)合藥材主要化合物類型，初步推測(cè)為萜類成分；而100%甲醇洗脫部分在可見光下即為鮮黃色，初步推測(cè)為姜黃素類成分。

隨后通過UPLC-Q/TOF-MS 檢測(cè)姜黃70%甲醇水洗脫部分，結(jié)果顯示（見圖1、表2），該部分主峰有7個(gè)，其紫外最大吸收波長(zhǎng)（λmax）均在200～280 nm，分子量范圍大多為200～280，符合萜類化合物的UV和MS特征[23-24]；其中，峰1～6的化合物骨架有15個(gè)碳原子，故推測(cè)屬于萜類中倍半萜類型；峰1、3、4和5的λmax在240 nm附近，這說明其可能為含有α,β不飽和酮的倍半萜類成分[21]，這與此前文獻(xiàn)中報(bào)道的姜黃和莪術(shù)中主要為倍半萜類成分相符。以相同的方法檢測(cè)了莪術(shù)70%甲醇水洗脫部分（見圖2、表2），發(fā)現(xiàn)此部分主峰有6個(gè)，其λmax在200～280 nm，分子量范圍在200～280，也符合萜類化合物的UV和MS特征[23-24]，其中4、5號(hào)離子峰占比最大，說明其所代表的成分在此部分浸膏中含量最高。

姜黃和莪術(shù)100% 甲醇洗脫部分經(jīng)UPLC-Q/TOF-MS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其主要成分λmax在 430 nm 左右，分子量范圍為290～400，符合姜黃素類化合物的UV 和MS特征[25-26]（見圖3、圖4、表3、表4）。

3.2 抗血小板聚集試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示（見圖5），與空白組比較，姜黃與莪術(shù)姜黃素類成分群在低濃度（6 mg/mL）時(shí)對(duì)血小板聚集的抑制作用尚不明顯（P＞0.05），而在中濃度和高濃度時(shí)均能一定程度的抑制血小板聚集（P＜0.05），并呈濃度依賴性。同時(shí)，姜黃-姜黃素中濃度和高濃度抑制率分別為12.0%±3.68%和22.2%±4.18%，與莪術(shù)-姜黃素中濃度抑制率（12.1%±7.31%）和高濃度抑制率（16.3%±5.31%）比較，無顯著性差異。而莪術(shù)-萜類低濃度對(duì)血小板聚集抑制率為16.86%±6.27%，已強(qiáng)于姜黃-萜類高濃度抑制率7.89%±3.89%，差異顯著，故就萜類成分群而言，莪術(shù)-萜類（P＜0.01）抑制血小板聚集作用明顯強(qiáng)于姜黃-萜類（P＞0.05）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃與莪術(shù)抗血小板聚集活性差異可能與萜類成分群密切相關(guān)。

表1 姜黃-萜類UPLC-Q/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

3.3 舒張離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

活性良好的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)血管環(huán)于1 g 靜息張力平衡后，經(jīng)KCl 誘導(dǎo)收縮，待張力收縮到達(dá)坪值，以累計(jì)給藥的方式加入姜黃和莪術(shù)各成分群（6μg/mL～500μg/mL）處理血管環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果顯示（見圖6），姜黃-萜類和莪術(shù)-萜類均濃度依賴性（6μg/mL～500μg/mL）舒張KCl 預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)。當(dāng)姜黃-萜類濃度為50μg/mL 時(shí)，血環(huán)管舒張幅度達(dá)50%，EC50為31.2μg/mL；而莪術(shù)-萜類濃度為150μg/mL 時(shí)，血管環(huán)舒張幅度超過50%，EC50為90.8μg/mL。這說明對(duì)于KCl 預(yù)收縮的離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)，姜黃-萜類對(duì)其舒張作用稍強(qiáng)于莪術(shù)-萜類。而姜黃和莪術(shù)中的姜黃素類成分群濃度在500μg/mL 對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)均無明顯舒張作用。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃和莪術(shù)中萜類成分群可能是兩者發(fā)揮舒張胸主動(dòng)脈環(huán)（KCl 預(yù)收縮）作用的主要活性成分群，且兩者在舒張作用上的差異與其所含萜類成分密切相關(guān)。

圖2 莪術(shù)-萜類總離子流圖

表2 莪術(shù)-萜類UPLC-Q/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

圖3 姜黃-姜黃素總離子流圖

表3 姜黃-姜黃素UPLC-Q/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

圖4 莪術(shù)-姜黃素總離子流圖

表4 莪術(shù)-姜黃素UPLC-Q/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

圖5 姜黃與莪術(shù)各成分群對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集影響（，n=6）

圖6 姜黃與莪術(shù)各成分群對(duì)KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力影響（，n=6）

4 討論

姜黃和莪術(shù)為同屬異種活血化瘀藥，臨床上廣泛用于治療痛經(jīng)、經(jīng)閉、胸痹心痛等血瘀證候，但兩者傳統(tǒng)活血功效有所差異，姜黃歸為“活血”類藥物，莪術(shù)則歸為“破血”類藥物，二者活血能力不同，而造成這一差異的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)，通過聚酰胺柱色譜并結(jié)合UPLC-Q/TOF-MS 分析技術(shù)分離并確定了姜黃和莪術(shù)的萜類成分群和姜黃素類成分群，隨后采用抗血小板聚集、離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)對(duì)姜黃和莪術(shù)的姜黃素類成分群和萜類成分群的抗血小板聚集和舒張血管活性進(jìn)行了比較研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩者姜黃素類成分群活性無明顯差異，但萜類成分群差異顯著。莪術(shù)-萜類能明顯抑制血小板聚集（P＜0.01），而姜黃萜類無明顯作用（P＞0.05）；姜黃和莪術(shù)萜類成分群雖均能在一定程度上舒張KCl預(yù)收的血管環(huán)，但姜黃-萜類的舒張作用（EC50=31.2μg/mL）強(qiáng)于莪術(shù)-萜類（EC50=90.8μg/mL）。由此可見，姜黃莪術(shù)中萜類成分群為其主要活性成分群，且兩者活血功效差異與其萜類成分密切相關(guān)。

上述研究初步表明，姜黃與莪術(shù)的藥理作用在活血化瘀方面有諸多相似之處，但又存在一定差異，提示兩者在臨床運(yùn)用上需根據(jù)證候特點(diǎn)，區(qū)別使用。雖然以抗血小板聚集試驗(yàn)和舒張離體大鼠血管環(huán)試驗(yàn)來反應(yīng)兩者傳統(tǒng)活血功效差異，不是非常全面，但該研究從一定程度上揭示了兩者在臨床上的區(qū)別使用與物質(zhì)基礎(chǔ)密切相關(guān)，這為姜黃與莪術(shù)進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了方向和依據(jù)。本課題組接下來的研究將對(duì)姜黃和莪術(shù)萜類成分群進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化、鑒定，從中得到單體成分，以單體成分驗(yàn)證姜黃與莪術(shù)的活血功效差異。