嚴(yán)黎 劉琬菁 楊成民 張建紅 陳泓宇 羅紅梅

摘要?目的：為了驗(yàn)證丹參類(lèi)黃酮-3′，5′-羥基化酶（Flavonoid 3′，5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）基因與丹參花色表型的相關(guān)性，本研究克隆并分析了紫花丹參99-3株系和一些白花丹參中的F3′5′H基因。方法：本研究通過(guò)提取紫花丹參和白花丹參中的總RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增獲得F3′5′H基因全長(zhǎng)序列。再利用生物信息學(xué)分析方法，分析了該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性狀、結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化等特點(diǎn)，并預(yù)測(cè)了該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)等;利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了該基因的表達(dá)特異性;利用毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了該基因的過(guò)表達(dá)陽(yáng)性毛狀根株系。結(jié)果：F3′5′H基因全長(zhǎng)1 551 bp，編碼516個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為57.4 kDa。該基因在丹參花中高豐度表達(dá)。在42份（紫花25份;白花17份）丹參樣品中發(fā)現(xiàn)一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）位點(diǎn)在紫花和白花丹參中呈現(xiàn)與花色相關(guān)的穩(wěn)定變化。系統(tǒng)發(fā)育分析表明丹參F3′5′H與美女櫻的F3′5′H具有較高序列同源性。獲得了過(guò)表達(dá)F3′5′H的毛狀根株系。結(jié)論：本研究在丹參中克隆到F3′5′H基因，對(duì)其序列進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究丹參F3′5′H基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?丹參;類(lèi)黃酮-3′，5′-羥基化酶;基因克隆;表達(dá)分析;生物信息學(xué)分析;SNP位點(diǎn)分析;丹參花色;轉(zhuǎn)基因毛狀根

Cloning and Expression Analysis of F3′5′H from Salvia Miltiorrhiza

YAN Li， LIU Wanjing， YANG Chengmin， ZHANG Jianhong， CHEN Hongyu， LUO Hongmei

（Key Lab of Chinese Medicine Resources Conservation， National Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China， Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education， Institute of Medicinal Plant Development， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract?Objective：To verify the correlation between the Salvia miltiorrhizaF3′5′H （SmF3′5′H） and the phenotype of S.miltiorrhiza flower.This study cloned and analyzed the F3′5′H genes from S.miltiorrhiza 99-3 with purple flowers and some S.miltiorrhiza plants with white flowers.Methods：The total RNA was extracted from S.miltiorrhiza with purple flowers and some S.miltiorrhiza with white flowers.And it was reversed and transcribed into cDNA.Using this cDNA as a template， the full-length of F3′5′H gene order was obtained by PCR method.Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of physicochemical properties， domains， system evolution and other characteristics.The subcellular localization and transmembrane region etc.of the protein were also predicted.The gene expression features of the genes were detected by real-time quantitative PCR.The transgenic hairy roots of genes were obtained by hairy root genetic transformation method.Results：The length of F3′5′H was 1551 bp， encoding 516 amino acids， and the relative molecular mass was 57.4 kDa.This gene is highly expressed in the flowers of S.miltiorrhiza.One SNP was found in 42 samples （25 purple flowers; 17 white flowers） of S.miltiorrhiza plants.This locus showed a stable change related to flower color in S.miltiorrhiza with purple and white flowers.Phylogenetic analysis showed that F3′5′H had high sequence homology with the F3′5′H of Glandularia x hybrida.The hairy roots over-expressing F3′5′H were obtained.Conclusion：This study cloned and analyzed the F3′5′H from S.miltiorrhiza.These results lay the foundation for further research on the F3′5′ H function of Salvia miltiorrhiza .

Keywords?S.miltiorrhiza;Flavonoids-3′，5′-hydroxylase;Gene clone;Expression analysis;Bioinformatics analysis;SNP locus analysis;Flower color of S.miltiorrhiza;Transgenic hairy roots

中圖分類(lèi)號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.006

花色是植物在花期的一個(gè)表現(xiàn)性狀，主要由存在于液泡中的色素物質(zhì)決定[1-2]。這些色素主要包括類(lèi)黃酮（Flavonoids）、類(lèi)胡蘿卜素（Carotenoids）和甜菜色素（Betalains）。其中，類(lèi)黃酮色素是植物中最常見(jiàn)的調(diào)控花色的色素，而花色素苷是類(lèi)黃酮中一類(lèi)主要的色素，它控制植物花的紅、藍(lán)、紫等顏色[3]?；ò曛蓄?lèi)黃酮化合物的羥基化模式?jīng)Q定了花瓣呈現(xiàn)的顏色，而類(lèi)黃酮的羥基化過(guò)程由細(xì)胞色素P450（Cytochromes P450，CYP450）負(fù)責(zé)催化完成[4]。

在高等植物中，類(lèi)黃酮-3′，5′-羥基化酶（Flavonoid-3′，5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）和類(lèi)黃酮-3′-羥基化酶（Flavonoid-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）是催化二氫黃酮到二氫黃酮醇的關(guān)鍵酶，它們催化花青素生物合成途徑中的羥基化過(guò)程。其中，F(xiàn)3′5′H催化花青素B環(huán)3′和5′位置的羥基化反應(yīng)[5]。這兩類(lèi)細(xì)胞色素P450都屬于CYP75亞家族[6]，是催化二氫黃酮到二氫黃酮醇的關(guān)鍵酶[7]?；ㄇ嗨谺環(huán)上的羥基數(shù)目影響著花的顏色，羥基數(shù)量越多藍(lán)色越深[4]。F3′5′H 在番茄（Solanum lycopersicum）[8]和瓜葉菊（Senecio cruentus）[9]等多種植物中已被克隆分離。在矮牽牛（Petunia hybrida）中異源表達(dá)蔓長(zhǎng)春花（Vinca major）F3′5′H 基因使紅色矮牽牛的花瓣變?yōu)樽仙玔10]。在葡萄（Vitis vinifera L.cv Shiraz）中，VvF3′5′H 在紅葡萄的果皮中高豐度表達(dá)，而在白葡萄的果皮中表達(dá)量極低[11]。在一些觀賞植物如玫瑰和康乃馨中，如果F3′5′H 不表達(dá)，將導(dǎo)致不能形成藍(lán)色和紫色花。通過(guò)在玫瑰和康乃馨中表達(dá)F3′5′H ，產(chǎn)生了藍(lán)色玫瑰和藍(lán)色康乃馨[12]，這些藍(lán)色花卉被廣泛運(yùn)用于商業(yè)化生產(chǎn)。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）屬于雙子葉唇形科鼠尾草屬藥用植物，異花傳粉。自然界中丹參的花有白花、紫花或白色和紫色的混雜色（淺紫色）。在丹參基因組中，14個(gè)參與黃酮生物合成途徑的酶基因已被鑒定[13]，其中，丹參F3′5′H（SmF3′5′H）是一個(gè)單拷貝基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SmF3′5′H的功能，我們?cè)谧匣ǖ?9-3品系中，分別克隆了SmF3′5′H的編碼區(qū)序列（cDNA）和基因組序列（gDNA）;并在栽培的白花丹參和紫花丹參（包含淺紫色花丹參）中，分別克隆了SmF3′5′H的cDNA序列。進(jìn)一步對(duì)SmF3′5′H進(jìn)行序列測(cè)定和比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)并篩選到一個(gè)與丹參花色（紫花和白花）相關(guān)的SNP位點(diǎn)。同時(shí)，利用毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化方法[14]獲得了該基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。本研究還分析了SmF3′5′H的表達(dá)譜，并預(yù)測(cè)了SmF3′5′H理化性質(zhì)和蛋白特性，這些結(jié)果表明，SmF3′5′H是一個(gè)調(diào)控丹參花色的關(guān)鍵基因，為丹參花色研究奠定基礎(chǔ)。

1?儀器與試劑

1.1?儀器?冷凍高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：Legend Micro 17R型），渦旋儀（賽洛捷克公司，美國(guó)，型號(hào)：1400059999型），96孔梯度PCR儀（賽默飛世爾科（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：2990234871型），DYY-8C型電泳儀（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：Power Pac型）。

1.2?試劑?RNAprep Pure植物多糖多酚總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：R6313），PrimeScriptTM II 1st strand cDNA合成試劑盒（普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0000375832）;10×PCR Buffer與pyrobest DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號(hào)：R005A）。pEASY-Blunt Zero Cloning試劑盒（北京全式金生物公司，型號(hào)：CB501-02），質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP103-03），普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP209-03），SYBR Premix Ex TaqTM（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號(hào)：RR820A）。

1.3?實(shí)驗(yàn)材料?丹參99-3植株分別采自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地和本實(shí)驗(yàn)的組培苗。其他紫花和白花以及淺紫色花的丹參花序分別采自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地和藥用植物園。采集樣品的花色見(jiàn)圖1所示。同時(shí)采集了2年生的紫花丹參的根、莖、葉、花。

2?方法與結(jié)果

2.1?RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)?將采得樣品每株分別清洗去除雜質(zhì)后，用吸水紙吸干樣品表面水分，用鋁箔紙包裝并編號(hào)，立即置于液氮中速凍，并移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ「蓛舻闹参锊牧希?0～100 mg），液氮研磨至均勻粉末，采用天根植物多糖多酚總RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μL RNase-Free ddH2O于Nanodrop 2000 Spectrophotometer儀器上設(shè)立空白對(duì)照，取1 μL RNA溶液進(jìn)行濃度檢測(cè)，獲得RNA溶液濃度、OD260/OD280、OD260/OD230的數(shù)值。取2 μL RNA溶液和1 μL上樣緩沖液（Loading Buffer），補(bǔ)充3 μL RNase-Free ddH2O，混勻?yàn)? μL樣品，制備1%濃度的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)RNA完整性及質(zhì)量。

2.2?cDNA全長(zhǎng)克隆?以提取的總RNA為模板，通過(guò)PrimeScriptTM II 1st strand cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)丹參基因組數(shù)據(jù)，選取F3′5′H基因的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）區(qū)域，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物：SmF3′5′H-F/R，引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板配制PCR反應(yīng)體系，加入1 μL cDNA，0.1 μL Pyrobest DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer和特異性基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物SmF3′5′H-F/R各0.1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;10 ℃保溫。將全部PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分離，將回收產(chǎn)物按照pEASY-Blunt Zero試劑盒提供的方法連接pEASY載體。取1 μL pEASY載體與4 μL回收產(chǎn)物混合，室溫反應(yīng)5 min，將連接產(chǎn)物加入50 μL Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min后，42 ℃水浴熱激90 s，再置于冰上孵育2 min，加入250 μL LB液體培養(yǎng)基，在150 r/min 37 ℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)1 h。取200 μL轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞的菌液涂布于含50 mg/L Amp（氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。待生長(zhǎng)出菌落后，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，取陽(yáng)性菌株送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行Sanger測(cè)序。

2.4?序列處理?獲得的測(cè)序結(jié)果為序列的正向測(cè)序結(jié)果和反向測(cè)序結(jié)果，原始數(shù)據(jù)均以AB1格式和SEQ格式儲(chǔ)存。原始數(shù)據(jù)中，包含低質(zhì)量的接頭片段、低質(zhì)量堿基和未測(cè)出的堿基。為排除這些干擾，需去掉這些不可讀的序列信息，獲得質(zhì)量可靠的測(cè)序結(jié)果。使用Codoncode處理原始數(shù)據(jù)，包含以下步驟：1）將正反兩條序列的AB1文件打開(kāi)，拼接獲得Contig序列。2）當(dāng)正反兩條序列所得的測(cè)序結(jié)果不一致時(shí)，如含低質(zhì)量堿基和未測(cè)出的堿基，則以測(cè)序質(zhì)量高的一條測(cè)序結(jié)果為準(zhǔn)。3）當(dāng)同一條序列在某一位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，則以峰高、峰銳的峰圖為準(zhǔn)。

2.5?序列分析?使用DNAMAN將測(cè)序獲得的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，得到差異位點(diǎn)分布信息，篩選在紫花丹參和白花丹參樣品中穩(wěn)定變化的SNP位點(diǎn)。將克隆得到的正確丹參序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上BLAST搜索其他植物中的同源性序列，使用MEGA 6進(jìn)行Clustal W多序列比對(duì)，并采用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）對(duì)全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。使用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。同時(shí)，使用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive/）進(jìn)行三維同源建模。

2.6?構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體?將2.2中測(cè)序正確的陽(yáng)性菌株加入10 μL LB液體培養(yǎng)基中搖菌，按照質(zhì)粒小提試劑盒的方法，取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒。設(shè)計(jì)SmF3′5′H基因全長(zhǎng)的過(guò)表達(dá)（Over-expression，OE）引物，根據(jù)Gateway原理在引物前添加attB序列，所用引物名稱(chēng)為：SmF3′5′H-OEF/R，引物序列見(jiàn)表1。以重組質(zhì)粒pEASY-SmF3′5′H為模板，使用SmF3′5′H-OEF/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收，再將回收產(chǎn)物進(jìn)行BP反應(yīng)，BP反應(yīng)體系：25 ng attB-PCR回收產(chǎn)物，75 ng pDONR221入門(mén)載體，1 μL LR clonase II enzyme，補(bǔ)充ddH2O至5 μL。將其反應(yīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含50 mg/L Kan（卡那霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，回收pDONR221-SmF3′5′H重組質(zhì)粒進(jìn)行LR反應(yīng);LR反應(yīng)體系：75 ng pDONR221-SmF3′5′H回收產(chǎn)物，75 ng pK7WG2D受體載體，1 μL LR clonase II enzyme，補(bǔ)充ddH2O至5 μL。反應(yīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取200 μL菌液涂布于含50 mg/L Spec（壯觀霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，菌落PCR檢測(cè)后選擇陽(yáng)性菌株送公司測(cè)序;取測(cè)序正確的克隆提取重組質(zhì)粒pK7WG2D-SmF3′5′H，將重組質(zhì)粒（pK7WG2D-SmF3′5′H）和空載體（pK7WG2D）分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060中，分別獲得SmF3′5′H的過(guò)表達(dá)毛狀根株系（ZC-OE）和對(duì)照株系（ZC-pk-OE）。

2.7?侵染丹參葉片?取生長(zhǎng)旺盛的丹參組培苗幼嫩葉片，剪切成0.5 cm2大小的葉盤(pán)于MS培養(yǎng)基25 ℃預(yù)培養(yǎng)2 d。將轉(zhuǎn)化得到發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060 28 ℃培養(yǎng)于含50 mg/L Spec+50 mg/L Rif（利福平）的液體YEB培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6，使用MS培養(yǎng)基重懸菌體，混合侵染后置于MS平板上，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)48～72 h。將共培養(yǎng)的葉盤(pán)分別用無(wú)菌水和含500 mg/L Car（羧芐青霉素）的無(wú)菌水中洗干凈后，置于含500 mg/L Car+50 mg/L Kan的MS平板上，25 ℃黑暗條件下篩選培養(yǎng)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的毛狀根，待其生長(zhǎng)至2.0～3.0 cm后切下，置于含200 mg/L Car+15 mg/L Kan+0.1 mg/L IAA的6，7-V固體培養(yǎng)基上刺激一周后轉(zhuǎn)接至不含IAA的固體培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出較多側(cè)根后，使用熒光顯微鏡檢測(cè)載體質(zhì)粒含有的標(biāo)簽蛋白——綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，判斷轉(zhuǎn)基因毛狀根是否為陽(yáng)性株系。將選擇3株陽(yáng)性株系標(biāo)記為ZC-OE-1、ZC-OE-2和ZC-OE-3轉(zhuǎn)接至6，7-V液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.8?丹參F3′5′H表達(dá)分析?取液體培養(yǎng)1個(gè)月的只轉(zhuǎn)化了空載體的對(duì)照株系（PK）和過(guò)表達(dá)株系（OE）毛狀根，以及采集的丹參根、莖、葉、花器官，分別提取總RNA，再將這些RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。挑選SmF3′5′H基因特異性片段設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）引物：SmF3′5′H-qF/R，引物序列見(jiàn)表1。以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內(nèi)參基因，制備qRT-PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq II 2.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，RNase-free ddH2O 4.5 μL。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。65～95 ℃時(shí)做熔解曲線，收集Ct值，以2-△△Ct方法[15]計(jì)算不同樣品間該基因相對(duì)表達(dá)量。

2.9?結(jié)果

2.9.1?SmF3′5′H全長(zhǎng)克隆及序列比對(duì)?以紫花丹參99-3株系的cDNA和基因組DNA為模板，分別克隆得到了SmF3′5′H的cDNA的完整ORF和基因組序列。該基因cDNA全長(zhǎng)為1 551 bp，編碼516個(gè)氨基酸;該基因的基因組序列全長(zhǎng)1 634 bp，經(jīng)與cDNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因的基因組序列（gDNA）中含有一段長(zhǎng)為83 bp的內(nèi)含子序列。見(jiàn)圖2。在采集的42株丹參樣品中，17株為白花丹參，標(biāo)記為B（白花）;25株為紫花丹參，標(biāo)記為Z（紫花），其中3株為淺紫花丹參，標(biāo)記為QZ（淺紫花）。

在紫花丹參和白花丹參F3′5′H基因序列的1 230 bp處存在一個(gè)與丹參花色相關(guān)的SNP位點(diǎn)，見(jiàn)圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)，在紫花丹參中，該處的堿基為C;在白花丹參中，該處堿基為T(mén);在淺紫色花丹參中，該處的堿基為C或T。經(jīng)仔細(xì)核對(duì)序列的測(cè)序峰圖，發(fā)現(xiàn)在淺紫色花丹參中，該位點(diǎn)處都為C/T雙峰。見(jiàn)圖4。依據(jù)堿基相應(yīng)的峰高情況選擇此處位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基，所以，我們發(fā)現(xiàn)在三株淺紫花丹參中，有兩株丹參在此位點(diǎn)的堿基為C，另一株淺紫花丹參此位點(diǎn)的堿基為T(mén)。見(jiàn)圖3。因?yàn)榈槌．惢ㄊ诜壑参铮茰y(cè)淺紫色花丹參可能與白花丹參和紫花丹參的天然雜交有關(guān)，因此，該位點(diǎn)在淺紫色花丹參中為C或T。除此位點(diǎn)外的其他SNP位點(diǎn)均不與丹參花色——白花、紫花和淺紫花這一性狀具有明顯的相關(guān)性，見(jiàn)圖3中所示的1 189 bp處的A/G這一SNP位點(diǎn)。

2.9.2?SmF3′5′H序列分析和三維同源建模?利用ExPASy對(duì)SmF3′5′H蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示SmF3′5′H的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為57.4 kDa，等電點(diǎn)為8.77。根據(jù)Interpro預(yù)測(cè)結(jié)果，SmF3′5′H屬于CYP450超基因家族，Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)中SmF3′5′H同源序列的序號(hào)為IPR002401。預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在SmF3′5′H氨基酸序列的7～29位點(diǎn)處有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，1～7位點(diǎn)處為該蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，29～516位點(diǎn)為非細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖5所示。SmF3′5′H蛋白質(zhì)序列的三維同源建模以Swiss-Model數(shù)據(jù)庫(kù)中的5ylw.1.A蛋白質(zhì)為模板，SmF3′5′H蛋白質(zhì)序列與模板蛋白質(zhì)序列相似度為33.62%。見(jiàn)圖6。

2.9.3?F3′5′H系統(tǒng)進(jìn)化分析?將SmF3′5′H氨基酸序列與其他植物F3′5′H氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。這些植物包括棉花（Gossypium hirsutum）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum tuberosum）、矮牽牛（Petunia x hybrida）、蔓長(zhǎng)春花（Vinca major）、長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）、洋桔梗（Eustoma grandiflorom）、夏堇（Torenia hybrid cultivar）、美女櫻（Glandularia x hybrida）。選擇以上植物的F3′5′H氨基酸序列均來(lái)自于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。繪制F3′5′H的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖7所示，SmF3′5′H與美女櫻和夏堇中的F3′5′H親緣關(guān)系較近。

2.9.4?SmF3′5′H過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因毛狀根獲得?將含有SmF3′5′H基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌（ACCC10060）最終獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，見(jiàn)圖8a。使用熒光顯微鏡檢測(cè)毛狀根中的GFP蛋白的綠色熒光情況，發(fā)現(xiàn)所獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根有綠色熒光，見(jiàn)圖8b，表明轉(zhuǎn)基因毛狀根構(gòu)建成功。利用qRT-PCR方法檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中SmF3′5′H的相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照株系相比，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平在ZC-OE-2過(guò)表達(dá)株系顯著增高，而在ZC-OE-3株系中略有增高，在ZC-OE-1中該基因的表達(dá)水平與對(duì)照株系相近。見(jiàn)圖9。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們初步獲得了SmF3′5′H過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根株系ZC-OE-2，可用于后續(xù)基因功能研究。

2.9.5?SmF3′5′H的表達(dá)譜分析?利用SmF3′5′H的qRT-PCR的引物，以2年生丹參的根、莖、葉、花的cDNA為模板，檢測(cè)了該基因在丹參不同器官中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明，該基因在丹參花（zc-F）中顯著高豐度表達(dá)，在莖（zc-S）中的表達(dá)量次之，在根（zc-R）和葉（zc-L）中表達(dá)量較低。見(jiàn)圖10。

3?討論

由于F3′5′H參與植物花青素的生物合成過(guò)程，所以對(duì)植物花色形成具有關(guān)鍵作用。研究F3′5′H基因及其編碼蛋白質(zhì)的理化特性和功能，有助于闡明植物花色的形成機(jī)制。本研究從丹參中克隆到SmF3′5′H基因的cDNA和gDNA序列，并發(fā)現(xiàn)該基因序列中只含有一個(gè)內(nèi)含子，其編碼區(qū)包含2個(gè)外顯子。見(jiàn)圖2。在丹參基因組[16]中，該基因是一個(gè)單拷貝基因，這與矮牽牛中有2個(gè)基因（Hf1和Hf2）編碼F3′5′H不同[17]，并且矮牽牛這2個(gè)基因功能不同[18-19]。由此推測(cè)SmF3′5′H在決定丹參花色性狀方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在分析采自試驗(yàn)地里的42株丹參樣品的SmF3′5′H cDNA序列時(shí)發(fā)現(xiàn)在1 230 bp處，有一個(gè)SNP位點(diǎn)與丹參的白花和紫花性狀具有相關(guān)性，見(jiàn)圖3;并且在3株淺紫色花丹參中，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)處堿基的峰圖是C/T雙峰，見(jiàn)圖4，推測(cè)這可能是由于這些丹參在試驗(yàn)地里生長(zhǎng)時(shí)發(fā)生過(guò)自然雜交，子代分離從而導(dǎo)致花色分離的現(xiàn)象。將從白花丹參中克隆獲得的SmF3′5′H與GenBank中的SmF3′5′H（MH447665.1）經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這兩條序列僅存在2個(gè)堿基差異，分別存在于1 189 bp和1 230 bp處。其中，GenBank中SmF3′5′H與克隆到的白花丹參SmF3′5′H的1 189 bp處堿基位點(diǎn)分別為G和A，這樣的堿基差異引起相應(yīng)的SmF3′5′H 397氨基酸位點(diǎn)從天冬氨酸（D）到天冬酰胺（N）的改變;而這2個(gè)SmF3′5′H（MH447665.1和本研究克隆的SmF3′5′H）在1 230 bp處堿基分別為C和T（序列比對(duì)結(jié)果未顯示），由此表明SmF3′5′H在丹參不同個(gè)體的基因組中其序列相對(duì)較為保守;且GenBank中的丹參F3′5′H序列可能從紫花丹參中分離獲得。大多數(shù)類(lèi)黃酮生物合成酶被認(rèn)為是可溶性蛋白，固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上發(fā)揮代謝引導(dǎo)作用，使黃酮類(lèi)化合物的合成代謝途徑更高效[20-21]。SmF3′5′H屬于CYP450，而CYP450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，作為一種末端加氧酶，參與了生物體內(nèi)的多種代謝物的生物合成過(guò)程。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SmF3′5′H蛋白N端具有跨膜結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖5，表明它可能是個(gè)膜蛋白。qRT-PCR檢測(cè)到SmF3′5′H在丹參花中顯著性高表達(dá)，見(jiàn)圖10，暗示該基因主要參與花中類(lèi)黃酮化合物的生物合成途徑。本研究還獲得了過(guò)表達(dá)SmF3′5′H的轉(zhuǎn)基因毛狀根，這為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。隨著本草基因組學(xué)研究[22-23]的不斷深入，多組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，極大地促進(jìn)了丹參作為藥用模式植物[24]的功能基因組學(xué)研究，因此，開(kāi)展SmF3′5′H調(diào)節(jié)丹參花色形成機(jī)制的研究，具有重要理論意義;同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與丹參花色性狀緊密相關(guān)的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)為后續(xù)開(kāi)展基于花色的丹參品種鑒定及優(yōu)良種質(zhì)選育提供靶基因。

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（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）