任宏偉 孟寒寒 徐瑤 趙永麗 高婷

摘要?目的：對(duì)藥用植物珊瑚菜Glehnia littoralis BAHD?；D(zhuǎn)移酶（Acyltransferase，AT）基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法：用茉莉酸甲酯（MeJA）處理珊瑚菜幼苗，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)GlAT候選基因的表達(dá)量，在已建立的珊瑚菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出表達(dá)量較高且MeJA處理后上調(diào)表達(dá)的1條GlAT基因序列，對(duì)該基因cDNA序列進(jìn)行全長(zhǎng)克隆;根據(jù)所得的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，利用MEGA 6.0構(gòu)建該蛋白序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果：GlAT的全長(zhǎng)開放閱讀框ORF（Open Reading Frame）為1 443 bp，編碼480個(gè)氨基酸。該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為52 844.14，等電點(diǎn)為6.92，為親水性蛋白，屬于轉(zhuǎn)移酶超家族。珊瑚菜GlAT蛋白與同科植物胡蘿卜Daucus carota subsp.sativus的AT蛋白親緣關(guān)系最近。結(jié)論：首次獲得珊瑚菜GlAT基因的ORF全長(zhǎng)序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步開展該基因的功能和遺傳調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?藥用植物;珊瑚菜;轉(zhuǎn)錄組;?；D(zhuǎn)移酶;基因篩選;克隆;生物信息學(xué)分析;次生代謝

Cloning and Bioinformatics Analysis of Acyltransferase Gene in Medicinal Plant Glehnia littoralis（GlAT）

REN Hongwei1， MENG Hanhan1，2， XU Yao1， ZHAO Yongli1， GAO Ting1

（1 Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province， College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China 2 College of Life Sciences， Northeast Agricultural University， Harbin 150036， China）

Abstract?Objective：To analyze the BAHD acyltransferase （AT） gene sequence of medicinal plants， Glehnia littoralis from bioinformatics perspective.Methods：Glehnia littoralis seedlings was treated with methyl jasmonate （MeJA）.The real-time fluorescent quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the gene expression.A GlAT gene sequence with high expression and up-regulated expression after MeJA treatment were screened from established transcriptome data of Glehnia littoralis.The cDNA sequence of the gene was cloned in full-length; the physical and chemical properties， secondary structure and tertiary structure of the protein were analyzed based on obtained amino acid sequence; and NJ phylogenetic tree based on AT proteins sequence was build using MEGA 6.0 software.Results：The full-length ORF of GlAT was 1 443 bp， encoding 480 amino acid residues.The relative molecular weight of the protein was 52 844.14， and the isoelectric point was 6.92.It was a hydrophilic protein and belonged to the transferase superfamily.GlAT protein of Glehnia littoralis was closely related to the AT protein of Daucus carota subsp.sativus.Conclusion：For the first time， the full-length ORF sequence of GlAT gene from G.littoralis was obtained and bioinformatics analysis was performed， which laid foundation for further research on the function and genetic regulatory mechanism of this gene.

Keywords?Medicinal plant; Glehnia littoralis; Transcriptome; Acyltransferase; Gene screening; Clone; Bioinformatics analysis; Secondary metabolism

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.005

植物中存在大量次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物的合成一般涉及到氧化還原、脫羧、?；?、羥基化等過程[1]。?；侵参锎紊x中一類重要反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證明?；谥参锷L(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝中均發(fā)揮重要作用[2]，其可以增加植物細(xì)胞中化合物的積累，從而使植物抵御外界生物脅迫以及非生物脅迫。BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族是植物中特有的一類蛋白，參與次生代謝產(chǎn)物合成和?；揎?，以?；鵆oA作為底物，產(chǎn)生各種揮發(fā)性脂類、修飾后的花青素及與植物抵御外界脅迫相關(guān)的化合物。這些化合物與植物代謝相關(guān)，某些化合物還具備一定的藥理活性[3-5]。如BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族的蛋白參與長(zhǎng)春花堿的生物合成及紫杉醇的生物合成[6-8]。

對(duì)目前已知的BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較，該家族蛋白氨基酸序列中都包含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，位于催化活性中心的HXXXD氨基酸序列，以及位于C末端的DFGWG氨基酸保守序列。上述2個(gè)氨基酸保守序列中的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸發(fā)生突變，都會(huì)導(dǎo)致?；D(zhuǎn)移酶蛋白活性減弱。在擬南芥、水稻和楊樹中發(fā)現(xiàn)BAHD成員分別為：64、119和94個(gè)。在煙草等植物中，BAHD家族成員的功能也被研究和鑒定[1，9-10]。Vinorine Synthase作為BAHD?；D(zhuǎn)移酶家族蛋白成員之一，Ma等獲得了Vinorine Synthase蛋白晶體，并對(duì)該蛋白晶體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析：該蛋白為一球狀蛋白，由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由Loop相連，HXXXD位于活性中心部位，活性中心位于2個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域之間。DFGWG序列位于11～13β折疊區(qū)域，接近C端。推測(cè)DFGWG氨基酸序列可能對(duì)CoA結(jié)合口袋的完整性有重要影響[11-13]。

藥用植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.屬傘形科珊瑚菜屬，該植物的干燥根稱北沙參[14]Glehniae Radix，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，為“補(bǔ)肺之要藥”，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效[15]。珊瑚菜中含有香豆素、香豆素苷、聚炔、以及單萜、多元醇、脂肪酸等類型化合物等重要活性成分。這些重要活性成分已被證實(shí)具有鎮(zhèn)痛、抗菌、平喘、抗過敏、抗病毒多種生物活性，已應(yīng)用于臨床[16-17]。然而，天然藥材中次生代謝產(chǎn)物含量較低。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)調(diào)控珊瑚菜中重要次生代謝產(chǎn)物的生物合成能有效解決該問題。珊瑚菜中?；D(zhuǎn)移酶研究未見報(bào)道，開展相關(guān)的研究具有一定科學(xué)價(jià)值。

本研究擬在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上，挖掘藥用植物珊瑚菜的?；D(zhuǎn)移酶（GlAT）候選基因。進(jìn)而利用分子生物學(xué)手段對(duì)該基因的cDNA序列進(jìn)行了克隆，獲得了全長(zhǎng)ORF序列并初步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究有利于珊瑚菜次生代謝產(chǎn)物合成分子機(jī)制的解析，將為進(jìn)一步研究珊瑚菜的分子育種和利用生物技術(shù)提高珊瑚菜品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，具有重要的理論價(jià)值和良好的應(yīng)用前景，對(duì)藥用植物研究具有示范意義。

1?材料與試劑

1.1?植物材料

采集山東省萊陽市高格莊鎮(zhèn)新鮮的三年生珊瑚菜，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高婷副教授鑒定為傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜（Glehnia littoralis）。清潔后液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?試劑

DNA Marker（大連寶生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ91887A）、6×Loading Buffer（大連寶生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AI51553A）;植物多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180327）;高保真酶產(chǎn)品PrimeSTARHS DNA Polymerase（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ11396）;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ60432A）;TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ61475A）;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit膠回收試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ81894A）;pMDTM18-T Vector Cloning Kit試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AJ52169A）。

1.3?儀器

高溫高壓滅菌器（上海輔澤商貿(mào)有限公司，美國(guó)，型號(hào)：GI80TW/GI100TW）;專業(yè)型分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司，瑞士，型號(hào)：DV215CD）;松下制冰機(jī)（北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司，遼寧，型號(hào)：SIM-F140BDL）;小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京海天友誠(chéng)科技有限公司，德國(guó)，型號(hào)：Centrifuge 5424R）;超純水機(jī)（默克化工技術(shù)（上海）有限公司，法國(guó)，型號(hào)：Milli-Q Integral）;核酸瓊脂糖水平電泳儀（北京金時(shí)速儀器設(shè)備經(jīng)營(yíng)部，國(guó)產(chǎn)，型號(hào)：DYCP-31CN）;凝膠成像儀（北京宇艾奇電子科技有限公司，國(guó)產(chǎn)，型號(hào)：SQ-Tanon3500）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（圣湘生物科技股份有限公司，美國(guó)，型號(hào)：Applied biosystems QuantStudio 5）。

2?方法

2.1?MeJA處理

取生長(zhǎng)狀況良好的珊瑚菜無菌苗，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各5株。用50%乙醇溶液作為溶劑配制200 μmol/LMeJA溶液，將該溶液均勻的涂抹在珊瑚菜無菌苗真葉的上下表皮，作為實(shí)驗(yàn)組材料，空白組僅用50%乙醇溶液涂抹真葉，其他處理方法與實(shí)驗(yàn)組保持一致。隨后室溫下黑暗避光處理16 h備用。

2.2?珊瑚菜真葉總RNA提取

將實(shí)驗(yàn)組與空白組的珊瑚菜材料每株選取1～2片真葉，置于液氮速凍，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取珊瑚菜真葉中的總RNA，采用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最終獲得實(shí)驗(yàn)材料的cDNA。

2.3?熒光定量PCR

使用Primer-BLAST對(duì)GlAT的閱讀框全長(zhǎng)序列進(jìn)行熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)，引物序列為F：GAAGGGAAGGGGATGGAAGTG，R：GACTTGTCTTCGTACACTGGATTT。引物合成在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。以珊瑚菜內(nèi)源Actin為內(nèi)參基因，以2.2合成的cDNA為模板，構(gòu)建體系后置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)。定量程序第1步：95 ℃，30 s。第2步：95 ℃，5 s、54 ℃，30 s、72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。第3步：95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，1 s。

2.4?珊瑚菜GlAT基因克隆及測(cè)序

基于篩選的轉(zhuǎn)錄組GlAT候選基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)該基因進(jìn)行克隆，采用Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列：F：ATGCCTTCTTCCTCAGTTCATATC，R：TTACGATACATATTGCATGAACTCTG。反應(yīng)體系包括：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）2 μL，前引物0.5 μL，后引物0.5 μL，cDNA 1 μL，滅菌水15.5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL。PCR程序?yàn)椋?8 ℃，10 s;53 ℃，5 s;72 ℃，90 s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)25 μL高保真酶PCR體系中加入0.25 μL LAtaq酶，72 ℃，20 min，加入Poly（A）尾。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體16 ℃連接16 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有AMP抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落，菌液PCR初步驗(yàn)證后選取3個(gè)陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

3?生物信息學(xué)分析

使用NCBI的ORFFinder和ConservedDomains在線網(wǎng)站分別進(jìn)行ORF和保守結(jié)構(gòu)域分析;使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）的Protscale及TMHMM Server在線網(wǎng)站分別分析蛋白親疏水性并預(yù)測(cè)跨膜區(qū)。使用SOMPA在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）。使用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建三維模型并用PyMOL軟件對(duì)其進(jìn)行分析;最后使用MEGA6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

4?結(jié)果與分析

4.1?熒光定量PCR結(jié)果?根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出表達(dá)量較高的1條GlAT候選基因序列c71961_g1。見圖1，MeJA處理后，該候選基因的表達(dá)量顯著提升，表達(dá)量近乎為空白組的兩2倍。已有研究表明，外施茉莉酸甲酯能夠有效的刺激植物，促進(jìn)香豆素等次生代謝產(chǎn)物的積累。因此，推測(cè)該GlAT候選基因參與了珊瑚菜的次生代謝。

4.2?珊瑚菜GlAT基因的擴(kuò)增和序列分析

利用轉(zhuǎn)錄組的GlAT候選基因序列設(shè)計(jì)引物，以珊瑚菜cDNA為模板，進(jìn)行克隆擴(kuò)增，得到一條約1 400 bp的目的條帶，見圖2。將其回收純化、測(cè)序、序列比對(duì)后得到該基因的全長(zhǎng)ORF為1 443 bp，編碼480個(gè)氨基酸，見圖3。將上述AT蛋白序列與NCBI上植物的同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，其與近源物種胡蘿卜Daucus carota subsp.sativus（XP_017254085）BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族的AT蛋白序列相似性為91.25%，確定克隆得到的為珊瑚菜AT基因的cDNA序列，將其命名為GlAT。

4.3?同源性分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)?將GlAT蛋白序列與NCBI上部分植物的同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，GlAT與胡蘿卜Daucus carota subsp.sativus（XP_017254085）、葡萄Vitis vinifera（CAN62119、XP_002278801）的蛋白序列相似性分別為91.25%、70.33%。對(duì)GlAT蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白屬于轉(zhuǎn)移酶超家族（Transferase superfamily），見圖4。且GlAT蛋白具有BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域HXXXD及DFGWG氨基酸序列。

4.4?蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)GlAT蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析：GlAT蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為52 844.14，等電點(diǎn)為6.92。使用ExPASy的Protscale在線工具預(yù)測(cè)GlAT蛋白親疏水性，見圖5。GlAT蛋白在第247個(gè)氨基酸位點(diǎn)，最低峰值是-2.133，在第281個(gè)氨基酸位點(diǎn)，最高峰值是1.878，總平均親水性為-0.158。使用TMHMM Server在線工具對(duì)AT蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明GlAT蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。

4.5?擬南芥與珊瑚菜AT蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)?預(yù)測(cè)的GlAT二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）中有160個(gè)氨基酸參與形成了α-螺旋，占33.33%。82個(gè)氨基酸參與了延伸鏈的形成，占17.08%。24個(gè)氨基酸參與了β-轉(zhuǎn)角的形成，占5%。214個(gè)氨基酸參與了無規(guī)卷曲的形成，占44.58%。GlAT主要結(jié)構(gòu)為α-螺旋和無規(guī)卷曲，α-螺旋是最為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋的比例在30%以上，因此推測(cè)此蛋白相對(duì)穩(wěn)定。將擬南芥（Arabidopsis thaliana）與珊瑚菜的（Glehnia littoralis）的AT基因蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的氨基酸數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)物種AT基因蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸數(shù)量均較為相似，見表1。

對(duì)珊瑚菜以及擬南芥AT蛋白進(jìn)行三維建模，見圖7A。以5kjt.1.A蛋白作為模體，相似性為26.39%，三維結(jié)構(gòu)包括16個(gè)β-折疊、13個(gè)α-螺旋、28個(gè)無規(guī)則卷曲。見表2。預(yù)測(cè)GlAT蛋白三維結(jié)構(gòu)包含了470個(gè)氨基酸，占編碼氨基酸總數(shù)的97.92%;擬南芥AT蛋白以5kjt.1.A蛋白作為模體，相似性為28.09%，三維結(jié)構(gòu)包括16個(gè)β-折疊、15個(gè)α-螺旋、30個(gè)無規(guī)則卷曲，見圖7B。預(yù)測(cè)AT蛋白三維結(jié)構(gòu)包含了459個(gè)氨基酸，占編碼氨基酸總數(shù)的95.42%。以上數(shù)據(jù)表明，珊瑚菜與擬南芥AT蛋白模型中的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)十分接近，推測(cè)珊瑚菜與擬南芥AT蛋白在功能上可能存在一定的保守性，蛋白功能可能較為相似。

4.6?系統(tǒng)進(jìn)化分析?從NCBI數(shù)據(jù)庫選取代表性植物（含薔薇科、檳榔科、禾本科、楊柳科、傘形科、菊科、茄科、十字花科、豆科植物）的AT蛋白序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖8。結(jié)果表明，珊瑚菜與胡蘿卜Daucus carota subsp.sativus的AT蛋白親緣關(guān)系較近，而與野大豆Glycine soja、擬南芥Arabidopsis thaliana、月季為Rosa chinensis、玉米Zea mays等植物的AT蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合進(jìn)化關(guān)系。

5?討論

本研究利用珊瑚菜GlAT轉(zhuǎn)錄組序列對(duì)其所編碼的序列進(jìn)行了基因克隆及生物信息學(xué)分析，序列比對(duì)結(jié)果顯示這個(gè)基因與胡蘿卜的AT基因同源性最高為91%。保守結(jié)構(gòu)與分析顯示：GlAT蛋白屬于轉(zhuǎn)移酶超家族，具有該超家族的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域HXXXD及DFGWG氨基酸序列。此外，MeJA處理后的定量分析結(jié)果顯示，GlAT基因可能參與了珊瑚菜的次生代謝途徑。本研究有利于珊瑚菜呋喃香豆素類生物合成分子機(jī)制的解析，將為進(jìn)一步研究珊瑚菜的分子育種和利用生物技術(shù)提高呋喃香豆素產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)，具有重要的理論價(jià)值和良好的應(yīng)用前景，對(duì)其他藥用植物研究也具有示范意義。

David等人研究結(jié)果顯示：擬南芥的AT蛋白是BAHD?；D(zhuǎn)移酶超家族的成員之一，它能利用輔酶A硫酯催化形成一系列的次生代謝產(chǎn)物，擬南芥的AT突變體更容易受到鹽度、滲透壓和缺水脅迫條件的影響[18]。因此，AT基因?qū)M南芥的抗逆及次生代謝產(chǎn)物的累積具有十分重要的意義。通過本文二、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：珊瑚菜和擬南芥的AT基因可能存在一定的同源性，推測(cè)它們的蛋白功能上可能存在一定相似性。珊瑚菜GlAT基因能否對(duì)珊瑚菜的抗逆起到關(guān)鍵的作用，能否產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物，從而帶來更多的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有待于對(duì)該基因功能的進(jìn)一步的探索。此外，該此外，GlAT家族基因成員可能不止一個(gè)，其相互關(guān)系及具體功能有待開展。

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（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）