李志紅 楊萌萌 徐靜雅 凡貞潔 王瑤瑤 王龍 侯典云

摘要?目的：獲得山茱萸轉(zhuǎn)錄因子CobHLH2的cDNA序列。方法：以山茱萸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中的c101916_g1序列為參考，利用Primer Premier 5.0軟件在其開放閱讀框兩端設(shè)計(jì)特異性引物，把山茱萸果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作模板，通過PCR擴(kuò)增、純化回收和克隆測(cè)序，獲得CobHLH2序列，并經(jīng)生物信息學(xué)分析初步了解其基本結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)果：CobHLH2的ORF長(zhǎng)度為795 bp，共編碼264個(gè)氨基酸，為親水性蛋白。CobHLH2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲和α-螺旋為主，有少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，CobHLH2的氨基酸序列與獼猴桃和茶樹的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子同源性較高。結(jié)論：首次獲得山茱萸CobHLH2轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為深入研究bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?山茱萸;轉(zhuǎn)錄組;轉(zhuǎn)錄因子;CobHLH2;基因;克隆;生物信息學(xué);分析

Cloning and Analysis of Transcription CobHLH2 Genes in Cornus officinalis

LI Zhihong1， 2， YANG Mengmeng1， 2， XU Jingya1， 2， FAN Zhenjie1， 2， WANG Yaoyao1， 2， WANG Long1， 2， HOU Dianyun1， 2

（1 College of Agricultural， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China; 2 The Luoyang Engineering Research Center of Breeding and Utilization of Dao-di Herbs， Luoyang 471023， China）

Abstract?Objective：To obtain the cDNA sequence of CobHLH2 transcription factor in Cornus officinalis.Methods：Based on the c101916_g1 sequence from the transcriptome data of C.officinalis as the reference， a pair of specific primers were designed at the 2 ends of its open reading frame using Primer Premier 5.0 software.The total RNA of Cornus officinalis fruits was extracted and reversed transcribed into cDNA as the model.The CobHLH2 sequence was obtained by PCR amplification， purification recovery and clone sequencing.Its basic structure and function through bioinformatics analysis were understood.Results：The ORF of CobHLH2 was 795 bp in length， encoding 264 amino acids and it was a hydrophilic protein.The secondary structure of CobHLH2 protein mainly was Random curl and α-helix， and β-turns and extended chains were less.The analysis of multiple sequence alignments and phylogenetic trees showed that the amino acids sequence of CobHLH2 shared high homology with bHLH transcription factors of Camellia sinensis and Actinidia chinensis.Conclusion：The cDNA sequence of CobHLH2 from C.officinalis was cloned for the first time and bioinformatics analysis was performed， which would lay the foundation for further study on the structure and function of bHLH transcription factors.

Keywords?Cornus officinalis; Transcriptome; Transcription factors; CobHLH2; Gene; Cloning; Bioinformatics; Analysis

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.007

山茱萸（Cornus officinalis）為山茱萸科多年生的木本植物，《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定山茱萸以干燥的成熟果肉入藥，具有補(bǔ)益肝腎的功效[1]。山茱萸廣泛分布在中國(guó)的秦嶺、伏牛山等地[2]。山茱萸的果實(shí)中含有多種活性物質(zhì)，如多糖、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類和鞣質(zhì)等[3]。研究表明，山茱萸具有廣泛的藥理活性，如保護(hù)肝腎、抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗衰老等[4-7]?，F(xiàn)今山茱萸在臨床上的應(yīng)用已十分廣泛。

bHLH（basic Helix-loop-helix）類轉(zhuǎn)錄因子的C端含有α-螺旋-環(huán)-α-螺旋結(jié)構(gòu)，N端則由堿性氨基酸組成，因此得名[8]。HLH區(qū)結(jié)構(gòu)富含疏水性氨基酸，主要是與DNA結(jié)合從而發(fā)揮功能[9]。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員對(duì)植物生長(zhǎng)過程中起著重要的調(diào)控作用[10]，如調(diào)節(jié)花青素的物質(zhì)合成[11]、植物抗逆性[12]、腺毛或根毛的形成以及表皮細(xì)胞建成[13-14]等生理作用。MYC蛋白的主要是由2個(gè)bHLH蛋白聚合形成的[15-16]，2個(gè)結(jié)構(gòu)域共同參與了活性DNA結(jié)合復(fù)合物的形成[17]。有研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)還可與MYB轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同發(fā)揮作用，可調(diào)控黃酮類物質(zhì)的合成[18]。完整的bHLH蛋白還可與缺少堿性區(qū)域的bHLH蛋白結(jié)合形成二聚體，從而抑制目的基因的表達(dá)[19]。

眾多研究發(fā)現(xiàn)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黃酮類、生物堿類、萜類等物質(zhì)的合成有重要的調(diào)控作用。CsbHLHs和CsMYBs轉(zhuǎn)錄因子在山茶生長(zhǎng)過程中有特定的表達(dá)模式用以調(diào)節(jié)重要的類黃酮物質(zhì)的合成，有助于山茶形成獨(dú)特的風(fēng)味[20]。丹參SmbHLH3的過表達(dá)植株使得丹參酮等活性物質(zhì)含量減少，功能鑒定結(jié)果表明SmbHLH3可通過抑制丹參酮合成關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄而下調(diào)其在植物體內(nèi)的積累[21]。PbbHLH4過表達(dá)可顯著增加蝴蝶蘭中揮發(fā)性單萜物質(zhì)的合成和積累，顯著增加了該蘭花的香氣[22]。

本研究根據(jù)山茱萸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[23]，成功克隆了山茱萸CobHLH2基因，并利用生物信息學(xué)分析該基因序列及其編碼蛋白，為研究轉(zhuǎn)錄因子bHLH轉(zhuǎn)錄因子在山茱萸生長(zhǎng)代謝過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)材料選自河南省洛陽(yáng)市隋唐城遺址植物園，用蒸餾水清洗果實(shí)，快速分離果肉置于離心管中，液氮速凍后儲(chǔ)存在-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)。

1.2?試劑與儀器

EASYspinPlus多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（RN37）、TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（PC1802）、2×long Taq PCR Master Mix（PC1501）、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（DR01）與Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit（CV2101）均購(gòu)買自艾德萊生物科技;DH5α感受態(tài)細(xì)胞（上海昂羽生物公司，型號(hào)：AYBIO-G6016）;氨芐青霉素（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：A7490）。Thermo MultiskanGO酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：MultiskanGO）、PCR儀（Biometra公司，德國(guó)，型號(hào)：Tpersonal）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)，型號(hào)：3K15）、電泳儀（BIO-RAD公司，美國(guó)，型號(hào)：PowerPac Basic）。

1.3?引物設(shè)計(jì)

以山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到的Unigene c101916_g1序列為參考，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，引物序列為CobHLH2F：5′-TCGGTGCTTATTTCGGTTGG-3′ 和CobHLH2R：5′-CTCCCTACTACTTCCCCACT-3′，引物送華大基因有限公司合成。

1.4?總RNA提取與cDNA合成

將試驗(yàn)材料放置于液氮中并充分研磨，根據(jù)RN35-EASYspinPlus多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒的說明提取山茱萸的總RNA。取適量總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其完整性，并利用MultiskanGO酶標(biāo)儀檢測(cè)其純度和濃度。按照TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?CobHLH2基因克隆與測(cè)序

CobHLH2基因的PCR體系是25 μL，2×long Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物終濃度為0.1 μM，cDNA模板為1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體積。設(shè)定的程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，設(shè)置32個(gè)循環(huán)，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸5 min。待PCR結(jié)束后電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，與T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素（Amp）抗性的LB固體平板上過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后送至上海美吉生物公司測(cè)序。

1.6?CobHLH2的生物信息學(xué)分析

利用美國(guó)生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）提供的ORFfinfer和Conserved Domains-search在線分析其開放讀碼框（ORF）及保守結(jié)構(gòu)域;使用ProtParam tool和ProtScale在線分析CobHLH2編碼蛋白的理化性質(zhì)與親/疏水性;利用SOPMA網(wǎng)站在線分析CobHLH2的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用SWISS-MODEL工具構(gòu)建其三維模型;利用BLAST搜索與CobHLH2相似性較高的氨基酸序列，并利用DANMAN 8.0進(jìn)行多序列比對(duì)，基于多序列比對(duì)結(jié)果使用MEGA 7.0構(gòu)建NJ樹分析其同源性。

2?結(jié)果與分析

2.1?山茱萸果實(shí)總RNA提取

取若干無酶的裝有3個(gè)小鋼珠的1.5 mL離心管，向其中加入約100 mg的山茱萸果肉，利用球磨儀將其研磨成粉狀，按照植物總RNA提取試劑盒提取其總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，RNA的條帶清晰，可進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

2.2?CobHLH2克隆與測(cè)序

利用Primer Premier 5.0軟件，在轉(zhuǎn)錄本c101916_g1序列的ORF兩端設(shè)計(jì)特異性引物（CobHLH2-F和CobHLH2-R）。以山茱萸的第一鏈cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.0%的凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2所示?；厥占兓摿翈Вc載體pTOPO-T連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，經(jīng)菌液PCR鑒定，挑選陽(yáng)性菌液測(cè)序。測(cè)序結(jié)果去除污染載體序列，獲得長(zhǎng)度為1 047 bp的CobHLH2目的片段。

2.3?CobHLH2編碼蛋白的特征分析

利用NCBI提供的ORFfinder工具預(yù)測(cè)，CobHLH2序列含有一個(gè)完整的ORF，長(zhǎng)795 bp，共編碼264個(gè)氨基酸。ProtParam分析表明，CobHLH2蛋白分子式為C1268H2030N370O411S8，相對(duì)分子質(zhì)量為29.29 kDa，其理論pI值8.77。利用ProtScale工具分析CobHLH2蛋白的親/疏水性，結(jié)果見圖3，總體來看，該蛋白整體的親水性氨基酸數(shù)量要多于疏水性氨基酸，因此初步推定此蛋白為親水性蛋白。

利用Conserved Domain-search工具分析CobHLH2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見圖4，CobHLH2蛋白具有HLH結(jié)構(gòu)域和特定的DNA結(jié)合位點(diǎn)，表明該編碼蛋白屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族。

2.4?CobHLH2二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA工具在線預(yù)測(cè)CobHLH2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5。CobHLH2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)共有4種，無規(guī)卷曲（紫色）、α-螺旋（藍(lán)色）、延伸鏈（紅色）與β-轉(zhuǎn)角（綠色）所占比例分別為48.48%、33.33%、12.12%、6.06%。

利用SWISS-MODEL工具在線預(yù)測(cè)構(gòu)建CobHLH2蛋白的三維結(jié)構(gòu)見圖6。其三維結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋與無規(guī)卷曲，這與預(yù)測(cè)的CobHLH2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

2.5?CobHLH2的同源性分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp工具搜索CobHLH2蛋白的相似性較高的序列，序列下載后用DANMAN 8.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖7所示，CobHLH2與藍(lán)果樹（Nyssa sinensis，KAA8517024）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002282897）、菜豆（Phaseolus vulgaris，XP_007162273）、胡桃（Juglans regia，XP_018858223）、獼猴桃（Actinidia chinensis，PSS36323）、番木瓜（Carica papaya，XP_021894046）、豇豆（Vigna unguiculata，QCD97477）、茶樹（Camellia sinensis，XP_028114859）等序列相似性較高，表明植物bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化過程中相對(duì)保守。

基于CobHLH2的多序列比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建CobHLH2的NJ樹，并通過1 000次Bootstrap重復(fù)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹各分支的可信度。結(jié)果見圖8，山茱萸CobHLH2序列與獼猴桃（Actinidia chinensis，PSS36323）和茶樹（Camellia sinensis，XP_028114859）的親緣關(guān)系較近，而與幾個(gè)豆科植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3?討論

藥用植物的提取物或其衍生物是許多化學(xué)藥物的重要原料，其中多數(shù)已是臨床用藥[24]，但關(guān)于藥用植物活性物質(zhì)的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究較為緩慢。隨著本草基因組學(xué)的提出和快速發(fā)展[25]，利用全基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序技術(shù)獲得大量的基因組數(shù)據(jù)，是研究藥用植物功能基因組學(xué)的重要基礎(chǔ)[26]。鐵皮石斛[27]、人參[28]等藥用植物活性物質(zhì)合成的基因組研究已取得了較大的進(jìn)展。

本研究基于對(duì)山茱萸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上[23]，通過基因克隆，獲得了CobHLH2序列，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，CobHLH2序列含有HLH保守結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)的保守序列，與已報(bào)道文獻(xiàn)一致[29]，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)藥用植物的有效成分含量具有重要的調(diào)節(jié)作用，有研究表明MYC2過表達(dá)可產(chǎn)生較多的花青素，且轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)茉莉酸甲酯的敏感性高于野生型[30]。白樺BpbHLH4[31]和烏拉爾甘草GubHLH3[32]的表達(dá)可影響三萜類及其皂苷等物質(zhì)的生物合成。長(zhǎng)春花CrBIS1亦是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，與單萜類物質(zhì)吲哚生物堿的生物合成途徑有關(guān)[33]。當(dāng)前，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[34]和基因工程等技術(shù)，改進(jìn)藥用植物有效成分合成過程中的調(diào)控元件，可極大地提高活性物質(zhì)的含量，有助于提高藥用植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

現(xiàn)今，山茱萸的基因組數(shù)據(jù)較為匱乏，其次生代謝物的生物合成的分子機(jī)制與轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究也較少。本研究已獲得了山茱萸的CobHLH2序列，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)特征和同源性分析，對(duì)于其功能分析還需深入研究，進(jìn)一步豐富山茱萸基因組學(xué)數(shù)據(jù)，從而發(fā)現(xiàn)山茱萸生長(zhǎng)發(fā)育過程與次生代謝產(chǎn)物積累的之間的分子機(jī)理，為山茱萸活性物質(zhì)的大量合成積累奠定基礎(chǔ)。

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（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）