徐兵，李蕾，陳貴元

(1.大理大學臨床醫(yī)學院，云南 大理；2.重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南 大理；4.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理）

0 引言

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，由RB1 基因的突變引起[1]。其發(fā)病率約1：20000，大多數患兒發(fā)病年齡小于5 歲[2-3]。由于RB 具有潛在致盲性甚至危及生命，因此可給家庭及社會造成嚴重的負擔[4-5]?，斂ǎㄎ靼嘌勒Z：Maca，學名：LepidiummeyeniiWalp），是一種十字花科植物，主產于秘魯東南部安第斯山脈，我國主要分布于云南迪慶、麗江等高寒山區(qū)[6-7]。其有改善性功能、提高生育能力、抗疲勞以及治療更年期綜合癥等作用。多糖普遍存在于生物體內，具有抗腫瘤、抗菌、降血糖、調節(jié)免疫等多種作用[8-9]。本文旨在研究瑪卡多糖對體外培養(yǎng)的Y79 細胞增殖、凋亡的影響以及其作用機制，為進一步研究瑪卡多糖的抗腫瘤作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪卡多糖的提取參考李月、陳貴元等[10]的研究方法進行提??；Y79 細胞株（北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院）；RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Thermo scientific 公司）；增強型CCK8 試劑盒（碧云天生物技術公司）；細胞周期檢測試劑盒（四正柏生物）；Trzol（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；逆轉錄試劑盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；ChamQTM SYBR? qPCR Master MiX（Vazyme Biotech Co.，Ltd），PCR 引物（金斯瑞生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理

Y79 細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行實驗?，斂ǘ嗵侨芙庥赗PMI 1640 培養(yǎng)基，過濾除菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞增殖檢測

Y79 細胞被制成1×105個/mL 細胞懸液，接種于96 孔板上，每孔為100μl；對照組加入RPMI 1640 完全培養(yǎng)基100μl，實驗組加入溶有瑪卡多糖的完全培養(yǎng)基100μl，終濃度分別為0.5、1、2、4mg/mL，每個濃度設置3 個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 小時。培養(yǎng)結束前4h，每孔加入增強型CCK8 試劑20μl，再于培養(yǎng)箱中孵育4 小時后以酶標儀在450nm 波長下檢測各孔吸光光度值（OD），計算細胞存活率。實驗重復三次。細胞存活率=[實驗組吸光光度值-空白組吸光光度值/對照組吸光光度值-空白組吸光光度值]×100%。

1.2.3 細胞周期檢測

收集Y79 細胞，實驗組以終濃度為1mg/mL 瑪卡多糖干預細胞，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 小時后，取1X106 個細胞以預冷的PBS 洗滌兩次后以75%乙醇4℃固定過夜，離心后加入100μl RNaseA，37℃水浴30min，加入400μl PI，4℃避光孵育30min 后上機檢測。實驗重復3 次。

1.2.4 熒光定量PCR 檢測CDK1、CyclinB1 的表達

收集實驗組（瑪卡多糖終濃度1mg/mL）和對照組（加入等體積完全培養(yǎng)基），培養(yǎng)48 小時后的Y79 細胞，以Trzol 試劑提取總RNA 后進行逆轉錄合成cDNA，使用ChamQTM SYBR? qPCR Master MiX 進行擴增。以β-actin 為內參，引物見表1，反應條件：95℃預變性5min、95℃變性15s、55℃退火15s，72℃延伸60s，循環(huán)40 次后分析各樣本Ct 值，然后采用2-ΔΔCt 計算基因的相對表達量。以上步驟均按試劑說明書進行。實驗重復3 次。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 瑪卡多糖對Y79 細胞增殖的影響

不同濃度的瑪卡多糖處理Y79 細胞不同時間后，實驗組各組的細胞存活率均低于對照組，且隨時間及瑪卡多糖濃度的增加生存率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或0.01）。表明，瑪卡多糖可抑制Y79 細胞增殖。詳見圖1、表2。

2.2 瑪卡多糖對Y79 細胞周期的影響

由圖2 可知，1.0mg/mL 瑪卡多糖Y79 細胞干預48h 后，流式細胞術檢測細胞周期分布發(fā)現，相比于對照組，實驗組Y79 細胞G2/M 期分布比例明顯增高（P＜0.01）。詳見圖2、表3。表明，瑪卡多糖可促使Y79 細胞周期停滯于G2/M 期。

圖1 瑪卡多糖對Y79 細胞增殖能力的影響

表2 瑪卡多糖在不同濃度和時間點Y79 細胞的存活率（n=3，

表2 瑪卡多糖在不同濃度和時間點Y79 細胞的存活率（n=3，

注：與對照組相比，*P＜0.01，# P＜0.05。

組別（mg/mL） 細胞生存率（%）24h 48h 72h 0.0 94.39±1.57 95.39±1.45 94.37±1.70 0.5 86.81±1.57# 55.71±2.30* 44.70±1.49*1.0 60.46±3.08* 32.08±1.58* 16.67±2.27*2.0 40.42±0.85* 21.23±1.88* 11.13±1.46*4.0 30.38±1.26* 14.50±1.25* 7.46±0.89*F 值 701.776 1080.155 1499.379 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 流式細胞術檢測Y79 細胞的周期分布

表3 流式細胞術檢測Y79 細胞周期的分布（n=3，

表3 流式細胞術檢測Y79 細胞周期的分布（n=3，

注：與對照組相比，* P＜0.01

分組 G0/G1（%） S（%） G2/M（%）陰性組 53.39±2.58 42.43±2.88 2.02±0.28 *瑪卡多糖組 41.05±2.30 46.96±3.68 9.61±1.25 *

2.3 瑪卡多糖對Y79 細胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表達的影響

熒光定量PCR 結果顯示，與對照組相比，1.0mg/mL 瑪卡多糖處理Y79 細胞48h 后，CDK1、CyclinB1 在mRNA 水平表達顯著降低（P＜0.05），表明瑪卡多糖可抑制Y79 細胞CDK1、CyclinB1在mRNA 水平的表達。詳見圖3。

圖3 瑪卡多糖對Y79 細胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表達的影響

3 討論

近年來，隨著個體化綜合治療以及眼底篩查等手段的開展，較多RB 患兒可獲得早期診斷及治療，這大大提高了患兒的生存率，但在很多欠發(fā)達國家和地區(qū)，生存率仍較低[11,12]。目前化療仍是臨床上廣泛運用的方法，而大多數諸如卡鉑等化療藥物可引起胃腸道不適、暫時性脊髓抑制和繼發(fā)性白血病等不良反應[13]，同時出現的腫瘤耐藥性限制了其臨床應用。由于RB 患兒大多數小于5 歲，這就要求化療藥物必須安全、有效?，斂ㄗ鳛槲覈膫鹘y(tǒng)中藥，長期運用于臨床治療多種疾病，具有安全、廉價等特點。因此我們探索了瑪卡多糖的抗RB 活性及機制。

經瑪卡多糖處理后，通過檢測Y79 細胞存活率發(fā)現，瑪卡多糖可抑制細胞增殖?，斂ǘ嗵菨舛扔傻偷礁?，細胞增殖抑制逐漸增加，而隨著時間的延長，細胞增殖抑制率亦逐漸增加。表現出明顯的濃度與時間依賴性。通過細胞周期檢測發(fā)現實驗組Y79 細胞G2/M 期比例高于對照組。因此，我們推測，Y79 細胞存活率的下降可能與瑪卡多糖促進細胞周期阻滯有關。

細胞周期調控蛋白CyclinB1 是Cyclin 家族的重要成員，通過與激酶CDK1 形成復合物后可引起下游的RB 蛋白磷酸化，RB 蛋白磷酸化后便失去了對轉錄因子E2F 的抑制活性，繼而E2F 恢復活性并加速細胞周期由G2 期進入M 期[14,15]。

通過熒光定量PCR 檢測，我們發(fā)現實驗組Y79 細胞的CDK1和CyclinB1 在mRNA 的表達上明顯低于對照組，而CDK1 和CyclinB1 是細胞周期通路中調節(jié)G2/M 期的關鍵蛋白。因此，我們認為瑪卡多糖可能通過下調CDK1、CyclinB1 的表達來促使Y79 細胞停滯在G2/M 期，從而導致細胞的凋亡。

總的來說，瑪卡多糖具有抗RB 活性，其可能的作用機制為通過調節(jié)細胞周期信號通路來實現?，斂ǘ嗵亲鳛橐环N全新的藥物，有望成為治療視網膜母細胞瘤的有效或輔助藥物。接下來我們將在動物水平進一步驗證其抗RB 活性。