周思遠，熊興江，何浩強，2，陳恒文，傅夢薇，2，劉蘭椿，2，王 階＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053；2. 北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京 100029）

冠心病（Coronary heart disease，CHD）是目前患病率與死亡率最高的疾病之一，已成為重大的公共衛(wèi)生問題?，F代醫(yī)學在緩解癥狀與改善遠期預后方面有較好療效，但也存在二級預防藥物治療不耐受等問題[1]。中醫(yī)藥治療冠心病已積累了數千年的經驗，早在《金匱要略·胸痹心痛短氣病》便有記載，現代病證結合理論下的冠心病中醫(yī)防治更是為提高臨床療效提供了新的方法。血瘀證是CHD 最主要證型之一[2]，活血化瘀是其基本治法。然而，目前關于冠心病血瘀證的發(fā)生機制以及活血化瘀中藥的作用機制研究仍未深入，一定程度上限制了中醫(yī)藥在冠心病的臨床應用與研究。因此，利用現代科學技術客觀化地闡明“冠心病-血瘀證-活血化瘀中藥”診療體系的科學內涵具有重要意義。代謝組學能將基因組、蛋白質組學變異以及環(huán)境因素變化有效橋接，從最終的“生化表型”來把握生物體的整體功能狀態(tài)[3]。通過發(fā)掘CHD發(fā)病過程中的關鍵代謝物，進一步探索其生物學作用，可為CHD 發(fā)病機制的研究提供新思路。此外，代謝組學技術能通過對機體代謝組的識別和量化研究，系統(tǒng)展示機體正常生理或病理刺激下的動態(tài)變化規(guī)律，為CHD 血瘀證的生物學基礎與活血化瘀中藥作用機制的揭示提供了有力工具[4]。

1 冠心病代謝組學研究概述

利用代謝組學開展冠心病研究已有數十年，最早用于生物標志物的探索，近年來已轉向發(fā)病機理與藥效機制的研究。隨著技術革新，目前應用于代謝組學研究的方法包括核磁共振技術（Nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜質譜聯用技術（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術、氣相色質譜聯用技術（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）等。利用這些技術，學者們已發(fā)現較多的可用于CHD 診斷的潛在生物標志物，同時，通過進一步的細胞功能學與藥理學研究，分析了這些可能的標志物在CHD 病理機制中的作用。已發(fā)現與CHD 相關的代謝物包括N乙酰神經氨酸[5]、氧化脂質[6]、不飽和脂肪酸[7]、苯乙酰谷氨酰胺[8]、磷脂酰膽堿[9]、氨基酸[10]、二十碳五烯酸[12]等。

研究發(fā)現體內代謝物可能與冠心病發(fā)生風險相關。一項研究對2324 例接受冠脈造影者的血漿代謝物進行檢測，鑒定出36個CHD相關代謝產物，其中N-乙酰神經氨酸水平與冠心病事件呈顯著正相關關系。進一步研究發(fā)現N-乙酰神經氨酸能通過激活Rho/ROCK-JNK/ERK 信號通路誘發(fā)心肌損傷[5]。另一研究發(fā)現了5個與絕經期婦女患冠心病風險相關的氧化脂質，包括2種羥基磷脂酰膽堿以及花生四烯酸的3種氧化衍生物（15-HETE、5-HETE 和11-HETE），色譜分析顯示HETE 譜與花生四烯酸的非酶氧化機制一致[6]。

體內代謝物還與不良心血管事件風險相關。一項涉及7256 例人群的前瞻性隊列研究發(fā)現血漿中較高的單不飽和脂肪酸、苯丙氨酸水平與心肌梗死等不良心血管事件風險正相關，而較高水平的二十二碳六烯酸、omega-6脂肪酸與低風險相關[7]。另一項研究則發(fā)現苯乙酰谷氨酰胺與心肌梗死等主要不良心血管事件相關，藥理學研究提示，其作用可能與其通過G蛋白偶聯受體介導血小板高反應性有關[8]。

代謝物可作為CHD 的潛在生物標志物。一項研究發(fā)現溶血磷脂酰膽堿、皮質醇和甘油磷脂酰膽堿可用于區(qū)分冠心病患者與健康者[9]。有研究發(fā)現2-異丙基蘋果酸，5-羥基吲哚乙醛，4-羥基馬尿酸和腺苷可作為冠心病潛在的生物標志物，涉及的信號通路包括氨基酸代謝和脂肪酸代謝等[10]。另有學者篩選出溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、單酸甘油酯等9種代謝物作為冠心病診斷的潛在生物標志物，基于上述代謝物建立的CHD 預測模型顯示出良好的CHD 風險預測能力[11]。

干預代謝物水平或能抑制動脈粥樣硬化進展。有學者發(fā)現經ω-3 多不飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)的小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積小且穩(wěn)定，其體內二十碳五烯酸代謝物——18-羥基二十五碳烯酸、17,18-環(huán)氧二十碳四烯酸水平升高。進一步研究發(fā)現這些代謝物可以通過NF-kB 信號通路減少內皮細胞活化，抑制動脈粥樣硬化進展[12]。

2 基于代謝組學的冠心病血瘀證生物學基礎

近年來，學者們從理化指標、基因組學、表觀遺傳學等不同層面探索了冠心病血瘀證的生物學基礎[1]，但仍未完全闡釋其發(fā)生機制。代謝組學可以從整體揭示生命活動的調控規(guī)律，并通過探索代謝物之間的相互作用闡釋機體的生理、病理機制，是揭示證候本質的有效途徑[4]。目前研究者已初步篩選出一些CHD血瘀證的潛在生物代謝標志物，包括葡萄糖、丙氨酸、檸檬酸等（表1）。

2.1 基于“同病異證”的冠心病血瘀證代謝物研究

“同病異證”是中醫(yī)臨床診斷的特色，明確證候的鑒別是臨床治療的關鍵。氣為血之帥，氣虛與氣滯是導致血瘀證形成的常見因素，探討CHD 不同血瘀證辨證分型的物質基礎對CHD 血瘀證證候本質的把握具有重要意義。研究顯示CHD 心血瘀阻證與氣虛血瘀證患者血漿代謝物存在差異，心血瘀阻證中檸檬酸、琥珀酸、3-羥基丁酸、谷氨酸等含量升高，不飽和脂肪酸、組氨酸等含量降低，氣滯血瘀證患者的血漿代謝產物譜與心血瘀阻證患者無明顯差異[13]。然而，另一項研究發(fā)現CHD 氣滯血瘀證與氣虛血瘀證存在氨基酸水平的差異，組氨酸、瓜氨酸等含量在CHD 氣虛血瘀證中升高[14]。另有研究顯示，溶血磷脂酰膽堿，亞油酸、花生四烯酸、鞘氨醇類物質構成了CHD 氣虛血瘀證代謝產物譜[15]。

血不利則為水，瘀血與痰濁常相互膠結共同為病，在病情復雜時有難以區(qū)分之弊，探索導致二者差異的物質基礎，對臨床精準辨證及“同病異治”內涵的揭示具有重要意義[16]。研究發(fā)現冠心病血瘀證和痰濁證既有共性代謝物，也有特異性代謝物，特異性代謝物主要有蘋果酸、葡萄糖、甘氨酸、棕櫚烯酸等，其中蘋果酸、葡萄糖等在血瘀證中含量較痰濁證升高[17]。另一項研究顯示CHD 血瘀證和痰濁證患者血漿的差異代謝物主要涉及氨基酸代謝（亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸），嘌呤代謝（尿酸、泛醌）和嘧啶代謝（脫氧尿嘧啶核苷酸、尿苷）[18]。CHD 血瘀證與痰濁證患者的尿液代謝物也存在一定差異，血瘀證尿液中檸檬酸、葡萄糖、肌酐、氧化三甲胺、馬尿酸等含量低于痰濁證，而膽汁酸、組氨酸的含量高于痰濁證組[19]。以上研究提示，代謝組學技術在CHD 血瘀證與其他證型鑒別方面有較大應用前景。

表1 冠心病血瘀證潛在生物代謝標志物

2.2 基于“異病同證”的冠心病血瘀證代謝物研究

“證同治同，異病同治”是中醫(yī)臨床的重要治則，比較冠心病血瘀證與其他疾病血瘀證相關代謝物的異同，有利于進一步明確CHD 血瘀證形成的物質基礎并全面揭示血瘀證的證候內涵。近年來研究發(fā)現，丙氨酸[20,21]、乳酸[20,21]、葡萄糖[20-22]、檸檬酸[20,23]、組氨酸[23]、纈氨酸[21,24]等可作為CHD 血瘀證潛在生物代謝標志物。相關學者在慢性心力衰竭[25]與2 型糖尿病[26]血瘀證患者的血漿代謝產物譜中發(fā)現了相似代謝物，其中丙氨酸、乳酸、纈氨酸、丙酮酸等構成了慢性心力衰竭血瘀證血漿代謝產物譜[25]，丙酮、甘氨酸、檸檬酸、延胡索酸等代謝物含量的異常構成了2型糖尿病血瘀證患者代謝特征[26]。此外，有學者利用UHPLC-TOF-MS 聯用技術分析了CHD 血瘀證與肝硬化血瘀證異病同治的物質基礎，結果顯示檸檬酸、組氨酸、羥基丁酸、谷氨酰胺等7種內源性代謝物為血瘀證的潛在生物標志物[27]。

尿液是人體代謝終產物，冠心病血瘀證患者也存在特異性的尿液代謝物，檸檬酸、丙氨酸、葡萄糖、纈氨酸等代謝物含量的異常構成了不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的代謝組學特征[28]。另有學者在乙肝肝硬化血瘀證患者的尿液代謝產物譜中也發(fā)現了相似代謝物，乙肝肝硬化血瘀證的潛在代謝標志物主要包括檸檬酸、丙氨酸、D-葡萄糖、甘氨鵝脫氧膽酸等[29]。以上結果提示，丙氨酸、檸檬酸、乳酸、葡萄糖等代謝物含量的異?？赡苁菍е卵鲎C形成的小分子物質基礎。

3 基于代謝組學的活血化瘀中藥作用機制

方證對應是中醫(yī)臨證的基本思維模式，活血化瘀是治療CHD 血瘀證的基本治法，但相關活血化瘀中藥干預CHD 血瘀證的作用機制尚未闡明，一定程度上影響了中藥在臨床的應用。代謝組學技術能夠揭示藥物作用于機體產生的復雜代謝產物組變化，并提供藥物作用途徑和作用靶點等方面的信息，可為闡明活血化瘀中藥藥效機制提供新的手段[30]。已有研究發(fā)現，血府逐瘀膠囊[31]、血府逐瘀湯[32,34]、復方丹參滴丸[33]、心可舒片[35]、桃紅四物湯[36]、血栓心脈寧片[37]、麝香保心丸[38]等活血化瘀中藥可以通過影響一些體內關鍵代謝物及信號通路，調整脂肪酸、磷脂、膽汁酸、氨基酸等物質代謝發(fā)揮改善心肌能量代謝、調整脂質代謝、抑制磷脂過氧化、影響類固醇激素生物合成等作用，這些關鍵代謝物及代謝通路的發(fā)現也有望為CHD 血瘀證的治療提供靶點。

活血化瘀中藥干預CHD 血瘀證與改善心肌能量代謝密切相關。一項研究利用UPLC-QTOF/MS 技術發(fā)現血府逐瘀膠囊糾正了CHD 血瘀證大鼠體內肉堿酯酰轉移酶1 蛋白的過表達，使L-肉堿、游離脂肪酸、乙酰肉堿含量增加，提示血府逐瘀膠囊能減輕心肌細胞的過度消耗狀態(tài)，并提供正常能量供應[31]。血府逐瘀湯則能促進脂肪酸β氧化及糖酵解產生ATP供能并保護心肌細胞，其促進脂肪酸β氧化與下調脂肪酸、四羧酸和順式烏頭酸相關，其促糖酵解與下調2-脫氧葡萄糖減輕對N-糖基化和糖酵解的抑制作用相關[32]。此外，復方丹參滴丸亦可通過調節(jié)心臟能量代謝改善心肌缺血，檸檬酸和3-羥基丁酸可能是復方丹參滴丸潛在的治療靶點[33]。

活血化瘀中藥還可以調節(jié)脂質代謝，抑制磷脂過氧化。研究顯示血府逐瘀湯可以上調鳥脫氧膽酸和糖膽酸促進膽汁酸代謝增加膽固醇流出而調節(jié)血脂；同時通過下調溶血磷脂酸含量，抗血小板聚集和血管平滑肌收縮[34]。血府逐瘀膠囊主要通過糾正磷脂酶A2 的過表達，降低溶血磷脂酰膽堿含量，減少磷脂過氧化物含量[31]。靶向干預脂肪酸、磷脂代謝可能是活血化瘀中藥發(fā)揮作用的重要機制之一，研究顯示，心可舒片可使心肌梗死大鼠的異常代謝物趨于正常，其中L-乙酰肉堿、鞘氨醇、花生四烯酸等13種代謝物與脂質代謝相關[35]。桃紅四物湯也主要通過調節(jié)脂肪酸、甘油磷脂代謝發(fā)揮治療作用，甘油磷膽堿、馬尿酸、吲哚基硫酸鹽等可能是桃紅四物湯潛在的抗凝、降脂作用靶點[36]。

活血化瘀中藥的治療作用與影響類固醇激素的生物合成相關。研究顯示血栓心脈寧片可以通過調節(jié)CHD 血瘀證大鼠皮質酮、3α,21-二羥基-5β-孕烯-11,20-二酮等代謝物含量，影響類固醇激素生物合成[37]。麝香保心丸則可以通過抑制皮質酮、醛固酮、皮質醇和腎上腺素等類固醇激素的生物合成，降低與心肌肥大有關的代謝產物的水平，逆轉急性心肌梗死的病理改變[38]。

4 小結與展望

綜上，代謝組學技術可以從整體的“生化表型”來把握生物體的整體功能狀態(tài)，在CHD 血瘀證病理基礎及活血化瘀中藥作用機制研究中發(fā)揮重要作用?，F有研究成果顯示，CHD 血瘀證的差異代謝物包括氨基酸、葡萄糖、有機酸等，丙氨酸、葡萄糖、檸檬酸等可作為潛在的診斷標志物，心肌能量代謝、脂質代謝、磷脂過氧化、類固醇激素生物合成可能是活血化瘀中藥的主要作用途徑。CHD 血瘀證的代謝組學研究雖取得上述進展，但也存在一些不足。首先，目前的代謝組學分析技術存在一定局限性，尚不能對生物體所有代謝產物進行全面定性定量分析，導致采用不同檢測方法可能獲得不同結果[39]。其次，尚無統(tǒng)一、嚴謹的生物樣本采集與處理規(guī)范，一定程度上影響了實驗結果的可靠性與可重復性[40]。此外，CHD 血瘀證生物學基礎研究存在樣本量不足且缺乏驗證等問題，尚未形成辨證分型的統(tǒng)一標準?；钛鲋兴幾饔脵C制研究停留在關鍵代謝物及代謝通路探明階段，藥物作用下整體代謝調控網絡的改變尚不明確。

針對上述問題，我們在未來的研究中可以采取如下策略：①完善目前的代謝組學檢測技術，探索更為廣譜、通用的代謝組學檢測方法；建立統(tǒng)一的生物樣本采集與處理規(guī)范，提高實驗人員科研素養(yǎng)，保證實驗過程的嚴謹性、可重復性。②擴大研究的樣本量，進一步挖掘與驗證CHD 血瘀證的差異代謝產物譜，探索統(tǒng)一的診斷和療效評價的生物標志物；也可以從已經發(fā)現的CHD 血瘀證潛在代謝標志物出發(fā)，對這些代謝物涉及的生物合成、表達等生物學事件展開研究，深入探究其在代謝網絡中發(fā)揮的作用。③充分利用現有的CHD 血瘀證基因、蛋白質等組學研究成果，將不同組學數據科學整合并系統(tǒng)分析，構建基于多組學技術的CHD 血瘀證的代謝調控網絡。④聯合應用多組學技術，建立不同組學信息間的相互聯系，探索代謝物與基因、蛋白質之間的相互作用，從而系統(tǒng)詮釋病證結合內涵，多組學技術聯合應用，也有利于克服單一平臺研究可能造成的實驗誤差[41]。⑤采用細胞代謝組學等新興技術，部分生物過程只發(fā)生在細胞中，細胞系代謝產物譜可作為整體代謝物研究的有效補充，并可直接與基因、蛋白質組數據聯用，在疾病機制與藥物機理研究中前景廣闊[42]。