董 艷，陳恒文，劉詠梅，朱 爽，馮嵐嵐，王 階

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

血塞通軟膠囊（XST）是臨床治療冠心病血瘀證的常用藥，其主要成分是三七總皂苷，它是傳統(tǒng)活血止血中藥三七的活性提取物。由于三七總皂苷包含數(shù)十種皂苷成分，作用靶點(diǎn)繁多，作用環(huán)節(jié)交錯(cuò)，作用機(jī)制復(fù)雜，故而在一定程度上限制了XST 的臨床運(yùn)用和療效發(fā)揮。而現(xiàn)有三七總皂苷治療冠心病的機(jī)制研究主要圍繞“中心法則”的單一基因或蛋白質(zhì)[1-3]，結(jié)果分散、單一，難以形成清晰、系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。前期研究[4,5]已表明，冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證存在lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中l(wèi)ncR CTB-114C7.4、miR-3656 是關(guān)鍵上游調(diào)控因子，能形成lncR CTB114C7.4-miR3656 網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。因此，本研究采用臨床隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)觀察XST能否干預(yù)lncR CTB-114C7.4和miR-3656，以及細(xì)胞凋亡常見(jiàn)基因BCL2A1 mRNA 表達(dá)，以揭示其治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證的lncRNAmiRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2018年2月-2019年8月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科門診的冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者80 例。利用SPSS 23.0 軟件生成隨機(jī)分組方案，并進(jìn)行隨機(jī)方案隱藏，試驗(yàn)組和對(duì)照組各40 例。采用雙盲設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)受試者、研究者和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)者的盲法。研究過(guò)程中對(duì)照組脫落2 例，皆因療效欠佳退出；試驗(yàn)組病例無(wú)脫落，故實(shí)際完成試驗(yàn)78 人。本研究通過(guò)了倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批件號(hào)：2018-001-KY-01），并在“中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心”平臺(tái)完成國(guó)際注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR1800014980）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

凡符合冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡在40-80歲之間，且簽署知情同意書者均可納入。其中，疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2014年《ACC/AHA 非ST 段抬高型急性冠脈綜合征管理指南》；中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)則參考1986年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)修訂的血瘀證標(biāo)準(zhǔn)。分別由2位中級(jí)職稱及以上中醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立辨證，若意見(jiàn)不一致則參考第3 位中級(jí)職稱及以上中醫(yī)師的意見(jiàn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究排除標(biāo)準(zhǔn)為：①心功能為Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)；②其他心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、或心臟神經(jīng)官能癥等所致胸痛；③腦梗塞急性期；④合并肝腎功能不良；⑤合并其他嚴(yán)重原發(fā)?。ㄈ缪翰　⒛[瘤等）；⑥最近2周內(nèi)有急性感染；⑦血壓或血糖控制不良，或伴有較嚴(yán)重的并發(fā)癥；⑧伴有精神系統(tǒng)疾病或智力障礙，不具備獨(dú)立完成問(wèn)卷調(diào)查及隨訪工作者；⑨孕婦或哺乳期婦女。

1.4 治療方法

試驗(yàn)組給予西醫(yī)基礎(chǔ)治療+XST，2 粒/次，每日2次；對(duì)照組給予西醫(yī)基礎(chǔ)治療+XST 模擬劑，2 粒/次，每日2 次。導(dǎo)入期為1 周，療程為4 周，導(dǎo)入期間停服其他具有活血化瘀作用的中藥湯劑及中成藥。試驗(yàn)組和對(duì)照組藥物均由昆明圣火藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，XST的規(guī)格為0.33 g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字Z19990022；模擬劑的規(guī)格為0.33 g/粒，主要成分是淀粉，與XST 外觀、口感保持一致。

1.5 臨床觀察指標(biāo)

本研究的臨床觀察指標(biāo)包括3個(gè)方面：基線指標(biāo)、療效指標(biāo)和安全指標(biāo)。其中基線指標(biāo)為性別、年齡、吸煙、飲酒、體重指數(shù)、合并危險(xiǎn)因素、用藥情況和血運(yùn)重建情況等。療效指標(biāo)為心絞痛療效、硝酸甘油停減率、中醫(yī)證候療效及單項(xiàng)中醫(yī)癥狀體征療效。安全指標(biāo)包括血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂及凝血功能。

1.6 檢測(cè)lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網(wǎng)絡(luò)表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組治療前后外周血有核細(xì)胞中l(wèi)ncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)水平。采集患者空腹時(shí)靜脈血樣4 mL，置于真空抗凝采集管中。分別進(jìn)行靜脈血有核細(xì)胞分離與純化、有核細(xì)胞總RNA 提取、總RNA 濃度及純度測(cè)定、RNA 反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)操作。

目的基因lncR CTB-114C7.4、miR-3656和BCL2A1的引物序列如下：lncR CTB-114C7.4，上游：TAACCTTTGATGTAGCTTGGTCTC，下 游：CATCATAAGACATCACAAAGAGGA；miR-3656，上 游：GGCGGGTGCGGGGGT，下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG；BCL2A1，上 游：CGTCCTACAGATACCACAACCT，下游：GATGCCGTCTTCAAACTCCT。

內(nèi)參基因的引物序列如下：β-ACTIN，上游：GAGACCTTCAACACCCCAGCC，下游：AATGTCACGCACGATTTCCC；U6，上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）或四分位數(shù)表示。當(dāng)進(jìn)行兩組計(jì)量資料的比較時(shí)，若符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，則采用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗(yàn)或配對(duì)非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或構(gòu)成比表示，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。按照ΔΔCt =(Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組計(jì)算外周血中l(wèi)ncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 的2-ΔΔCt值 及 差 異 倍 數(shù)（fold change，F(xiàn)C），以分析網(wǎng)絡(luò)表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P≤0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 研究結(jié)果

2.1 基線情況

試驗(yàn)組和對(duì)照組在性別（P= 0.098）、年齡（P=0.992）、吸煙（P= 0.065）、飲酒（P= 0.108）、體重指數(shù)（P= 0.549）、合并危險(xiǎn)因素（P= 0.072）、用藥情況（P=0.257）和血運(yùn)重建情況（P=0.816）等方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明兩組具有可比性。

2.2 心絞痛療效

分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的心絞痛發(fā)作頻率（表1），比較治療前后的組間差異。結(jié)果顯示，兩組治療前的頻數(shù)分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.911），表明兩組治療前的心絞痛發(fā)作水平一致。經(jīng)XST 治療4 周后，試驗(yàn)組的心絞痛發(fā)作次數(shù)明顯減少，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（表1）。

表1 兩組患者心絞痛發(fā)作頻率表

2.3 硝酸甘油停減率療效

分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的硝酸甘油使用頻率（表2），比較治療前后的組間差異。結(jié)果顯示，兩組治療前的頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.070），表明兩組治療前的硝酸甘油使用情況一致。經(jīng)XST 治療4 周后，試驗(yàn)組的硝酸甘油使用量顯著降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

表2 兩組患者硝酸甘油使用頻率表

2.4 中醫(yī)證候療效

采用《冠心病心絞痛血瘀證療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[6]評(píng)價(jià)試驗(yàn)組和對(duì)照組的血瘀證積分變化，比較治療前后兩組的變化值情況（表3）。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)積分規(guī)則，分值越大表明血瘀證程度越重。同時(shí)，按照“減分率=100%”公式，計(jì)算兩組的尼莫地平減分率。根據(jù)減分率百分比“≥70%、≥30%、＜30%”，將療效分成3個(gè)等級(jí)，即“顯效、有效、無(wú)效”。

表3 兩組患者血瘀證積分值（Mean±SD）

結(jié)果顯示，治療前兩組的血瘀證積分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.518），表明二者的血瘀證輕重程度一致。經(jīng)XST 治療4 周后，試驗(yàn)組的血瘀證積分明顯降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。減分率統(tǒng)計(jì)分析顯示，試驗(yàn)組的平均減分率為34.44%，對(duì)照組則為6.63%。根據(jù)減分率百分比將臨床療效分為3組，試驗(yàn)組顯效和有效共27 人（顯效2%，有效65%），無(wú)效13人（占33%）；對(duì)照組無(wú)效30 人（占79%），有效8 人（占21%），兩組的療效分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.5 單項(xiàng)中醫(yī)癥狀體征療效

分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的胸痛、胸悶、心悸、唇齦暗紅、舌紫暗及脈澀的臨床表現(xiàn)。根據(jù)《冠心病心絞痛血瘀證療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)單項(xiàng)中醫(yī)癥狀體征的賦分規(guī)則，分別賦予不同的分值。去除治療前和治療后單項(xiàng)分值均為0 的病例，統(tǒng)計(jì)剩余患者各癥狀體征的變化值，當(dāng)治療后分值較治療前下降時(shí)視為臨床治療有效。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的胸痛治療有效率為80.65%，明顯優(yōu)于對(duì)照組29.73%，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）；試驗(yàn)組的胸悶治療有效率為76.32%，優(yōu)于對(duì)照組41.18%，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.002）；試驗(yàn)組的唇齦暗紅治療有效率為32.26%，明顯優(yōu)于對(duì)照組8.82%，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.018）。同時(shí)，試驗(yàn)組有緩解心悸、舌紫暗和脈澀的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.6 安全性分析

分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的血常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂及凝血功能等安全性指標(biāo)，以評(píng)價(jià)藥物的臨床安全性。其中，血常規(guī)包括白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）及血小板（platelet，PLT）；腎功能包括肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）；肝功能包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和 谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT）；凝血功能包括活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）和纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）；血脂包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density Lipoprotein，LDL）。試驗(yàn)組治療后比治療前的血糖、LDL、AST 和ALT 含量下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.019、P= 0.014、P= 0.006、P= 0.005），血常規(guī)、腎功能及凝血功能等指標(biāo)在治療前后均無(wú)變化；對(duì)照組的各項(xiàng)指標(biāo)在治療前后亦均無(wú)變化（表4）。該結(jié)果表明，XST具有調(diào)節(jié)血糖血脂水平和保護(hù)肝功能的作用，臨床運(yùn)用安全。

2.7 外周血有核細(xì)胞lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)水平

根據(jù)血瘀證療效統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選取試驗(yàn)組中血瘀證治療有效的全部病例，經(jīng)外周血有核細(xì)胞總RNA 濃度和純度檢測(cè)后確定20例為試驗(yàn)組最終檢測(cè)樣品；同時(shí)，將對(duì)照組中所有無(wú)效病例按照尼莫地平減分率升序排列，選擇百分比最小的前20位作為對(duì)照組病例。運(yùn)用qRT-PCR 檢測(cè)兩組治療前后的lncR CTB-114C7.4、miR-3656及BCL2A1表達(dá)水平（圖1）。

表4 兩組患者安全性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表（Mean± SD）

圖1 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各RNA的表達(dá)水平

以上結(jié)果表明，試驗(yàn)組治療后比治療前的lncR CTB-114C7.4表達(dá)上調(diào)（FC=7.4），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.526）；miR-3656 表達(dá)下調(diào)（FC= -2.4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；BCL2A1 表達(dá)顯著上調(diào)（FC=57.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）。而對(duì)照組治療后比治療前的lncR CTB-114C7.4和BCL2A1表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.332、P= 0.765），但對(duì)miR-3656 表達(dá)具有下調(diào)作用（FC= -1.3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040）。

進(jìn)一步組間比較發(fā)現(xiàn)，治療前試驗(yàn)組與對(duì)照組的lncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明兩組基因表達(dá)基線一致。治療后與對(duì)照組相比（表5），試驗(yàn)組的lncR CTB-114C7.4 表達(dá)顯著上調(diào)（FC=35.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046）；miR-3656 表達(dá)下調(diào)（FC= -1.9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；BCL2A1 表達(dá)上調(diào)（FC= 9.0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049）。

表5 治療后兩組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相對(duì)差異表達(dá)水平

本研究表明XST 減少心絞痛發(fā)作、提高硝酸甘油停減率及改善中醫(yī)證候和單項(xiàng)癥狀體征的臨床療效存在微觀物質(zhì)基礎(chǔ)。其潛在的作用機(jī)制為激活lncR CTB114C7.4 ↑-miR3656 ↓-BCL2A1 ↑調(diào) 控 網(wǎng) 絡(luò)。XST 上調(diào)lncR CTB114C7.4 表達(dá)后，lncR CTB114C7.4通過(guò)其miRNA 識(shí)別元件與miR-3656 結(jié)合，降低了游離miR-3656 表達(dá)水平，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了游離miR-3656與靶基因BCL2A1的結(jié)合，從而導(dǎo)致游離BCL2A1含量增多，而BCL2A1 作為編碼mRNA，能翻譯成BCL2A1蛋白質(zhì)，進(jìn)而表現(xiàn)出相應(yīng)的功能。因此，XST介導(dǎo)的該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將最終由BCL2A1 發(fā)揮出相應(yīng)的生物學(xué)功能，而lncR CTB114C7.4 和miR-3656 雖然不能直接翻譯蛋白，卻是激活該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵上游調(diào)控因子和中間環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上調(diào)控模式，并揭示該網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的下游細(xì)胞學(xué)功能，我們后續(xù)開(kāi)展了基于RNA 干擾技術(shù)的lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 敲降及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，這將為明確XST 的lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制提供更多的證據(jù)支撐，研究結(jié)果值得我們期待。

3 研究結(jié)論

通過(guò)臨床隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，本研究獲得如下結(jié)論：①XST 治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者，不僅能減少心絞痛發(fā)作次數(shù)，提高硝酸甘油停減率；還能降低患者的血瘀證積分，將平均減分率從6.63%提高到34.44%，并改善胸痛、胸悶和唇齦暗紅的單項(xiàng)中醫(yī)癥狀體征。②XST 對(duì)患者血常規(guī)、腎功能及凝血功能等無(wú)影響，并能改善血糖血脂和肝功能指標(biāo)，表明其臨床運(yùn)用安全。③XST 在臨床運(yùn)用有效和安全的前提下，能進(jìn)一步上調(diào)患者外周血中l(wèi)ncR CTB-114C7.4 和BCL2A1 表達(dá)，并下調(diào)miR-3656 表達(dá)水平，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑網(wǎng)絡(luò)的作用。

4 討論與展望

lncRNA、miRNA 均為非編碼RNA，能調(diào)節(jié)下游mRNA 表達(dá)量，進(jìn)而影響靶基因翻譯[7-10]，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。lncRNA 又屬于競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA[11]，含有miRNA識(shí)別元件，能與mRNA競(jìng)爭(zhēng)相同的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制miRNA 與mRNA 的結(jié)合，影響miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用。因此，lncRNA、miRNA、mRNA三者之間往往能形成lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，參與體內(nèi)的生理病理過(guò)程，是藥物干預(yù)的潛在作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制。目前，已有研究[4，5,12]報(bào)道lncRNAmiRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了冠心病血瘀證的發(fā)生機(jī)制，而lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 作為上游非編碼RNA，能調(diào)節(jié)多種mRNA，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。BCL2A1 是BCL2 家族的主要基因之一，具有抗細(xì)胞凋亡的作用[13，14]，能保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[15]。因此，本研究從lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 網(wǎng)絡(luò)層面研究XST 的作用機(jī)制。相比早期單一靶點(diǎn)及機(jī)制的研究結(jié)果[16-18]，該研究有利于揭示中藥多靶點(diǎn)、多層次、整體調(diào)節(jié)的作用優(yōu)勢(shì)，從而促進(jìn)中醫(yī)藥治療冠心病臨床療效的提高。