劉 星，趙 榮，李 波，江國托，劉 艷*

（1.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，江蘇 邳州 221300；2.盤錦市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 盤錦 124010；3.大連三儀生命科學(xué)研究院，遼寧 大連 116036）

豆粕是目前飼料工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的植物蛋白源。但由于其自身的理化特點如氨基酸不平衡，存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，質(zhì)地結(jié)構(gòu)致密，導(dǎo)致其適口性較差，不易被完全消化，限制了豆粕的應(yīng)用價值。尤其是在國家倡導(dǎo)節(jié)能減排，降低飼料中蛋白含量，提高我國飼料蛋白自主性，減少對大豆進口的依賴性的社會環(huán)境下，如何更好的利用大豆蛋白成為迫切的需要[1]。

發(fā)酵豆粕的實質(zhì)就是利用發(fā)酵技術(shù)對豆粕進行發(fā)酵預(yù)處理，其目的是提高豆粕的飼用品質(zhì)。豆粕中的蛋白多為大分子蛋白，肽鏈較長，難以被動物直接消化利用，且消化率不高[2]。利用發(fā)酵技術(shù)，可以將大豆蛋白較長的肽鏈變成較短的肽鏈，且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，使豆粕由致密變得較蓬松，從而提高其適口性，促進動物采食[3-4]。同時，發(fā)酵過程中，有益菌大量繁殖。在用發(fā)酵豆粕飼喂動物的同時，實際上也飼喂了動物大量有益菌，這對維持動物腸道健康平衡，提高腸道吸收營養(yǎng)效率均有益處[5]。

雖然發(fā)酵豆粕的應(yīng)用已經(jīng)有較長的歷史，其顯著作用也被行業(yè)廣泛認(rèn)可，但由于發(fā)酵豆粕工藝繁多，菌種和酶制劑多種多樣，使得不同工藝的發(fā)酵豆粕其指標(biāo)差異較大，且不同發(fā)酵工藝的發(fā)酵豆粕指標(biāo)平行比較的數(shù)據(jù)較少或者較不完整[6]。本試驗將幾種具有代表性的發(fā)酵工藝而得的發(fā)酵豆粕進行主要指標(biāo)的平行對比，為發(fā)酵豆粕廠家及用戶選擇何種工藝的發(fā)酵豆粕提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)條件

植物乳酸桿菌SAM0038（實驗室保藏），MRS培養(yǎng)基，37℃，靜置培養(yǎng)[7]；丁酸梭菌SAM0109（實驗室保藏），參考夏會麗等方法[8]；釀酒酵母（實驗室保藏）SAM0252，PDA培養(yǎng)基，30℃，220 r·min-1[9]；枯草芽孢桿菌（實驗室保藏）SAM0125，LB培養(yǎng)基，37 ℃，220 r·min-1[10]。

蛋白酶（酶活力10萬U·g-1，購自河南仰韶生化工程有限公司）[11]。

1.2 樣品處理方法

分別將各菌種發(fā)酵液以5%（w/w）的比例加入至發(fā)酵豆粕中，調(diào)整水分為48%，混勻。植物乳酸桿菌處理的豆粕直接裝入排氣袋，密封，置于37℃48 h；釀酒酵母處理的豆粕直接裝入排氣袋，敞口置于37℃48 h；丁酸梭菌處理的豆粕放入排氣袋中，抽真空后，密封，置于37℃48 h；枯草芽孢桿菌處理豆粕，鋪平放于不銹鋼托盤中，置于37℃48 h；蛋白酶按照0.1%（w/w）的比例添加入豆粕中，調(diào)整水分48%，混勻鋪平于不銹鋼托盤中，置于37℃48 h。所有實驗樣品60℃（試驗過程發(fā)現(xiàn)，烘干溫度＞75℃，影響蛋白溶解度；＜45℃較難烘干）烘干后，測量水分，并換算成與原料水分11.56%相同水分條件下進行其他指標(biāo)平行對比。

1.3 指標(biāo)測量方法

水分測定方法：GB/T 6435-2014；pH測定方法：DB15/T 1458-2018；酸溶蛋白測定方法：GB/T 22492-2008；KOH蛋白溶解度測定方法：GB/T 19541-2017附錄A；揮發(fā)性鹽基氮測定方法：GB/T 32141-2015；總酸測定方法（以乳酸計）：GB/T 12456-2008；蛋白電泳測定方法（SDS-PAGE方法）：稱取0.1 g樣品與20 mL樣品緩沖液混合均勻，并于沸水中煮沸5 min，冷卻至室溫。濃縮膠和分離膠濃度分別為12%和5%。上樣量為15 μL，電泳緩沖液：0.19 mol·L-1甘氨酸，0.1%十二烷基磺酸鈉和0.025 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷。于單向垂直電泳儀中，25 V 30 min，50 V 90 min。染色液染色30 min，脫色液脫色4 h。各溶液配制方法參考詹玉春等方法[12]。

2 試驗結(jié)果

2.1 各工藝發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)變化曲線

發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)變化曲線見圖1。

圖1 發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)變化曲線

由圖1可知，各發(fā)酵工藝發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量均有所上升，其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵對豆粕蛋白質(zhì)的濃縮作用最明顯，發(fā)酵48 h后，粗蛋白含質(zhì)量從45.28%提高至48.37%（換算成同一水分條件下，下同）。

2.2 各工藝發(fā)酵豆粕pH變化曲線

發(fā)酵豆粕pH變化曲線見圖2。

圖2 發(fā)酵豆粕pH變化曲線

豆粕經(jīng)過幾種不同發(fā)酵工藝發(fā)酵后，pH均有所降低。其中，植物乳酸桿菌在排氣袋密閉條件下發(fā)酵豆粕pH降低最為明顯，發(fā)酵36 h后，pH可降至4.76。在48 h內(nèi)，除釀酒酵母處理外，乳酸菌、丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌，蛋白酶制劑發(fā)酵豆粕pH均呈逐漸降低變化趨勢，釀酒酵母發(fā)酵豆粕發(fā)酵pH在36 h之后，稍有上升。

2.3 各工藝發(fā)酵豆粕總酸變化曲線

發(fā)酵豆粕總酸變化曲線見圖3。

圖3 發(fā)酵豆粕總酸變化曲線

在發(fā)酵48 h周期內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸量（以氫氧化鈉滴定總酸計）最為明顯，產(chǎn)酸量最高可達2.86%。釀酒酵母、丁酸梭菌產(chǎn)酸量較低，最高分別可達1.21%、1.62%?？莶菅挎邨U菌與蛋白酶發(fā)酵豆粕含酸量基本持平，變化較小。

2.4 各工藝發(fā)酵豆粕酸溶蛋白變化曲線

發(fā)酵豆粕酸溶蛋白變化曲線見圖4。

圖4 發(fā)酵豆粕酸溶蛋白變化曲線

在發(fā)酵周期48 h內(nèi)，乳酸菌、釀酒酵母、丁酸梭菌發(fā)酵豆粕其酸溶蛋白含量較原料豆粕無明顯提升；枯草芽孢桿菌、蛋白酶制劑發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量提升明顯，最高分別可達14.27%、15.28%，說明枯草芽孢桿菌和蛋白酶制劑對豆粕中蛋白有顯著的降解作用；乳酸菌、釀酒酵母、丁酸梭菌對豆粕中蛋白降解作用不明顯。

2.5 各工藝發(fā)酵豆粕KOH蛋白溶解度變化曲線

發(fā)酵豆粕KOH蛋白溶解度變化曲線見圖5。

圖5 發(fā)酵豆粕KOH蛋白溶解度變化曲線

在發(fā)酵周期48 h內(nèi)，乳酸菌、丁酸梭菌發(fā)酵豆粕KOH蛋白溶解度與原料豆粕比較接近，從初始值70.16%分別變?yōu)?2.18%、68.25%；蛋白酶制劑發(fā)酵豆粕發(fā)酵48 h后，KOH蛋白溶解度有所提升，從初始值70.16%提升至75.14%；釀酒酵母、枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕發(fā)酵48 h后，KOH蛋白溶解度有所降低，從初始值70.16%分別降低至54.12%、66.37%。

2.6 各工藝發(fā)酵豆粕揮發(fā)性鹽基氮變化曲線

發(fā)酵豆粕揮發(fā)性鹽基氮變化曲線見圖6。

圖6 發(fā)酵豆粕揮發(fā)性鹽基氮變化曲線

在發(fā)酵周期48 h內(nèi)，乳酸菌、釀酒酵母和丁酸梭菌發(fā)酵豆粕中，揮發(fā)性鹽基氮（VPN）與原料豆粕相比變化不明顯；但枯草芽孢桿菌與蛋白酶發(fā)酵豆粕中揮發(fā)性鹽基氮（VPN）與原料豆粕相比顯著增高，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕中揮發(fā)性鹽基氮含量最高可達109.27 mg·100 g-1，蛋白酶發(fā)酵豆粕中揮發(fā)性鹽基氮含量最高可達106.82mg·100 g-1。

2.7 各工藝發(fā)酵豆粕SDS-PAGE圖

發(fā)酵豆粕SDS-PAGE條帶見圖7。

圖7 發(fā)酵豆粕SDS-PAGE條帶

發(fā)酵48 h后，從蛋白電泳圖結(jié)果來看，乳酸菌發(fā)酵豆粕，釀酒酵母發(fā)酵豆粕，丁酸梭菌發(fā)酵豆粕中蛋白與原料中蛋白比較相似。枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕和蛋白酶發(fā)酵豆粕中，大分子蛋白含量較原料豆粕明顯減少，相應(yīng)的，中小分子蛋白含量明顯增多。說明，枯草芽孢桿菌和蛋白酶降解大豆蛋白的作用比較明顯，而乳酸菌、釀酒酵母和丁酸梭菌在降解豆粕中蛋白作用，效果不明顯。

3討論

發(fā)酵豆粕中，酸溶蛋白含量、揮發(fā)性鹽基氮和蛋白電泳條帶中蛋白分布可能有一定關(guān)系。酸溶蛋白含量高，說明大豆中蛋白的降解程度可能較高，大豆蛋白中有一部分大分子蛋白轉(zhuǎn)化為小分子蛋白，從蛋白電泳條帶上來看就呈現(xiàn)出上面代表大分子蛋白的條帶減少或變淺，下面代表小分子蛋白的條帶增多或顏色加深，與理論上的蛋白條帶變化相一致。豆粕中蛋白的進一步分解，可能會導(dǎo)致氨氣的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性鹽基氮的升高。發(fā)酵飼料通常以酸溶蛋白含量高，蛋白溶解度高，揮發(fā)性鹽基氮含量低為質(zhì)量較高。如果是幾種合適的菌種組合或菌酶協(xié)同發(fā)酵，可能會提高酸溶蛋白和蛋白溶解度的同時，不提高或降低揮發(fā)性鹽基氮的含量。

工藝不同可能會對發(fā)酵豆粕的KOH溶解度造成明顯的差異。乳酸菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、蛋白酶制劑對豆粕的KOH溶解度影響不顯著，但釀酒酵母發(fā)酵豆粕KOH蛋白溶解度顯著降低，由70.16%降低至54.12%。

各發(fā)酵工藝存在一定缺陷，如排氣袋即使抽真空密封也無法保障嚴(yán)格厭氧環(huán)境，不利于丁酸梭菌生長發(fā)酵，都用37℃溫室發(fā)酵，不一定是其最適溫度。同理，48%的發(fā)酵水分也不一定是其最佳水分，其他因素如pH等因素也應(yīng)考慮。

4結(jié)論

枯草芽孢桿菌提高粗蛋白質(zhì)含量最優(yōu)，將原料蛋白45.28%提高至48.37%（同一水分下）。乳酸菌密閉發(fā)酵豆粕產(chǎn)酸量最高，產(chǎn)酸量可達2.86%?？莶菅挎邨U菌和蛋白酶制劑提高酸溶蛋白含量和揮發(fā)性鹽基氮作用明顯，其酸溶蛋白含量分別可達14.27%和15.28%；其揮發(fā)性鹽基氮含量分別可達109.27和106.82 mg·100 g-1。釀酒酵母發(fā)酵豆粕KOH溶解度降低明顯，從70.16%降低至54.12%，枯草芽孢桿菌和蛋白酶制劑發(fā)酵豆粕揮發(fā)性鹽基氮含量升高明顯。