韓明渠，李富偉，潘興亮，王玉田，鄭瑞峰

（1.北京科為博生物技術(shù)研究院，北京 100086；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

對(duì)飼用抗生素的限制使用已經(jīng)成為國(guó)際社會(huì)的共識(shí)，“飼料禁抗”是國(guó)際畜牧飼料行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。歐盟早在2006年就頒布法令禁止抗生素在飼料中使用，亞洲的日本和韓國(guó)也分別在2008年和2011年禁止在飼料中使用抗生素[1]。美國(guó)在2017年也開(kāi)始限制在飼料中使用抗生素[2]。2019年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號(hào)公告，促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑將在2020年全部退出。亟需尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品，微生物制劑產(chǎn)品成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢，發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的乳酸，屬于腸道乳酸菌，被稱為“有孢子性乳酸菌”[3]。凝結(jié)芽孢桿菌具有一般乳酸菌維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用。同時(shí)，由于能產(chǎn)生芽孢，抗逆性強(qiáng)，耐高溫，耐貯存，易于飼料加工，目前中國(guó)、美國(guó)和歐盟等國(guó)家均已將該菌種列入可在畜禽飼料中添加的益生菌[4]。本研究通過(guò)MRS培養(yǎng)基平板鈣溶圈法初篩，結(jié)合瓊脂擴(kuò)散牛津杯法進(jìn)行抑菌性能評(píng)估復(fù)篩，旨在從雞腸道及內(nèi)容物中篩選具有抑菌作用的凝結(jié)芽孢桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

雞腸道及內(nèi)容物樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

加富MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，無(wú)水氯化鈣0.15 g，氯化鈉2.5 g，硫酸錳0.1 g，L-半胱氨酸0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.2，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

MRS碳酸鈣培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，碳酸鈣6 g，pH 6.0，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母浸粉0.5 g，NaCl 1.0 g，加蒸餾水至100 mL，pH 7.0，121℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

人工胃液：取胃蛋白酶1.0 g溶于100 mL無(wú)菌水中，用9.5%～10.5%的鹽酸調(diào)節(jié)pH到3.0。

人工腸液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加無(wú)菌水500 mL溶解，用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL，每100 mL液體中加入1.0 g胰蛋白酶，加入不同量的豬膽鹽，混勻，膽鹽濃度分別為0.1%、0.3%和0.6%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

初篩：稱取雞腸道及內(nèi)容物樣品1.0 g，放入裝有玻璃珠的無(wú)菌250 mL三角瓶中，加入99 mL無(wú)菌水，220 r·min-1振蕩30 min。然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適宜稀釋度涂布在加富MRS培養(yǎng)基固體平板，40℃培養(yǎng)48 h。待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落接種到MRS碳酸鈣培養(yǎng)基固體平板上，37℃培養(yǎng)48 h，挑取產(chǎn)生鈣溶圈的菌落，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩：將從樣品中劃線分離出的菌株，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1，培養(yǎng)48 h。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為病原指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法評(píng)估各菌株的抑菌能力，篩選抑菌能力強(qiáng)的菌種。

1.2.2 菌種的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察劃線純化后的菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2.2 生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

gyrB基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序：以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增gyrB基因，擴(kuò)增引物采用gyrB-F（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3'）和gyrB-R（5'-AGCAGGGTACGGAT GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）（生工生物工程股份有限公司合成）[7]。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析：擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定由生工生物工程股份有限公司完成。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，然后選擇相似性較高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，用鄰位相連法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1 000次重復(fù)的Bootstraps統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.3 抗逆性研究

菌株人工胃液的耐受性：將菌株CA04121培養(yǎng)物接種于人工胃液中，分別在靜置0、60、120、180 min進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。

菌株膽鹽的耐受性：將菌株CA04121培養(yǎng)物接種于不同膽鹽濃度（0、0.1%、0.3%、0.6%）的人工腸液中，分別在靜置6 h后進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌活性凝結(jié)芽孢桿菌的篩選

通過(guò)加富MRS培養(yǎng)基和MRS碳酸鈣培養(yǎng)基固體平板初篩，抑菌能力評(píng)估復(fù)篩，得到4株可以產(chǎn)酸并具有抑菌活性的芽孢桿菌菌株，抑菌效果見(jiàn)圖1。其中，菌株CA04121對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖1 抑菌效果圖（左圖病原指示菌為金黃色葡萄球菌，右圖病原指示菌為大腸桿菌）

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

在MRS培養(yǎng)基平板表面上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，有明顯鈣溶圈；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，芽孢端生，見(jiàn)圖2。

2.2.2 生理生化特征

接觸酶和V-P測(cè)定反應(yīng)均呈陽(yáng)性，可在50℃溫度條件下生長(zhǎng)，生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.3 gyrB基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

菌株CA04121的gyrB基因測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其序列全長(zhǎng)為1 184 bp，與芽孢桿菌屬的gyrB基因序列相似性最高。選取Paenibacillus amylolyticus BCRC 14684（EU272024）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建菌株CA04121與芽孢桿菌屬部分模式種gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。菌株CA04121與Bacillus coagulans B10（MH427055）同處一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。

表1 生理生化特征

圖3 gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株CA04121鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），該菌種已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.16244。

2.3 抗逆性能研究

2.3.1 耐酸性能

CA04121菌株在人工胃腸液中的存活率見(jiàn)表2。

表2 CA04121菌株在人工胃腸液中的存活率

由表2可知，在人工胃液中靜置60min，存活率可達(dá)90.9%，靜置180 min后存活率仍可達(dá)72.7%。該凝結(jié)芽孢桿菌菌株具有較強(qiáng)的耐酸能力，能耐受胃酸環(huán)境，為其益生特性的發(fā)揮奠定重要基礎(chǔ)。

2.3.2 耐膽鹽性能

凝結(jié)芽孢桿菌膽鹽耐受力見(jiàn)表3。

表3 CA04121菌株在不同濃度膽鹽溶液中的存活率

在膽鹽濃度為0.1%時(shí)，菌株存活率達(dá)到86.4%，在膽鹽濃度為0.3%時(shí)，菌株存活率達(dá)到68.2%，而在膽鹽濃度為0.6%時(shí)，菌株存活率仍可達(dá)到54.5%。因此，該菌株具有良好的耐膽鹽能力。

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)MRS培養(yǎng)基平板鈣溶圈法初篩，結(jié)合瓊脂擴(kuò)散牛津杯法進(jìn)行抑菌性能評(píng)估復(fù)篩，從雞腸道及內(nèi)容物中得到一株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)抑制作用的菌株CA04121。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因進(jìn)化分析結(jié)果，鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。該菌種具有較好的產(chǎn)酸性能，同時(shí)具有較強(qiáng)的抑菌能力。這與嚴(yán)濤等從泡菜中分離的凝結(jié)芽孢桿菌及趙麗娜從健康仔豬盲腸及糞便中分離的凝結(jié)芽孢桿菌[的研究結(jié)果基本一致[7-8]。通過(guò)抗逆性能研究，該凝結(jié)芽孢桿菌菌種在模擬胃液中處理180 min存活率可達(dá)到72.7%，在0.6%的膽鹽溶液中處理6 h存活率達(dá)到54.5%，結(jié)果表明，其可以較好地適應(yīng)動(dòng)物腸道環(huán)境。下一步需進(jìn)行該菌種的工業(yè)化生產(chǎn)及其在動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)等方面研究，充分發(fā)揮其在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中調(diào)整動(dòng)物腸道健康、替代抗生素抑制有害菌等方面的應(yīng)用潛力。