徐少華，黃 婷

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢驗檢測中心廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518005）

全氯霉素是一種抑制性的廣譜抗生素，可以抑制骨髓細胞中蛋白質的合成，對人類和動物的骨髓細胞和肝細胞具有毒性作用，不僅可引起細胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導致嚴重的胃腸道反應、二重感染等[1-2]。長期微量攝入氯霉素不僅使沙門氏菌、大腸桿菌等產(chǎn)生耐藥性，還會導致機體正常菌群失調，使人們易患各種疾病。隨著人們生活水平的提高，動物性食品的食用安全越來越受關注。世界上很多國家都對其作出了規(guī)定，我國在農(nóng)業(yè)部235號公告中也明確地將氯霉素列為禁用藥物。目前監(jiān)測氯霉素類藥物殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法[3-6]等。現(xiàn)有的氯霉素類藥物檢測方法前處理往往比較復雜，消耗試劑較多，檢測周期長成本高。本研究建立了一種針對雞肉中氯霉素的液相色譜—串聯(lián)質譜的檢測方法。本方法減少試劑用量、改善提取液凈化步驟，簡單快捷、靈敏度高，可以檢測市場上雞肉中氯霉素的含量，對質量檢測方法的進步和市民的身體健康有重大意義。

1 材料與方法

1.1 設備與儀器

液相色譜—串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（美國Agilent LC 1290/Sciex 5500）；電子天平（感量0.01 g、感量0.000 1 g）（梅特勒電子天平）；高速離心機（美國sigma公司）；固相萃取裝置；超聲波清洗儀；可控溫氮吹濃縮儀；渦旋振蕩器。

1.2 試驗材料

水符合GB/T 6682規(guī)定的一級水；標準物質：氯霉素（氯霉素、氯霉素-D5）純度≥99.6%，購自德國DR公司；試劑：甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH），色譜純：均購自德國默克公司；溶劑：乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸；甲醇水溶液：10%甲醇水+0.1%甲酸；濾膜：水相，0.22 μm（上海安譜）；PRIME HLB（6 cc 200 mg）固相萃取柱（美國Waters）。

1.3 試劑配制

標準儲備液：每種標準物質均用甲醇配制成1.00 mg·mL-1，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為6個月。

標準中間液（1.00 μg·mL-1）：將標準儲備液用甲醇逐級稀釋成1.00 μg·mL-1標準中間溶液，在-18℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個月。

內(nèi)標工作液（100 ng·mL-1）：準確吸取氯霉素-D5內(nèi)標中間溶液1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至10 mL，在4℃條件下于棕色瓶中保存，有效期為3個月。

標準工作液：根據(jù)藥物的靈敏度和儀器線性范圍，用乙腈水溶液配成不同濃度的混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 試驗方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）（美國waters公司）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣量：5.0 μL；

流動相及梯度洗脫程序見表1。

表1 氯霉素藥物流動相梯度洗脫

2.1.2 質譜參考條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應離子監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4 500 V。

離子源溫度（TEM）：550℃；氣簾氣CUR：35 psi；碰撞氣壓力CAD：8 psi；噴霧氣GS1：55 psi；輔助加熱氣GS2：55 psi；藥物保留時間、定性定量離子對及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表2。

表2 氯霉素藥物及氯霉素內(nèi)標的CAS號、保留時間、定性定量離子對及去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）

2.2 前處理

2.2.1 提取

稱取試樣2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管內(nèi)，加入100 ng·mL-1的內(nèi)標工作液（1.3.3）40 μL，加乙腈水溶液（1.2.6）10 mL，震蕩搖勻30 s，超聲波清洗儀超聲5 min，高速離心機6 000 r·min-1離心6 min。

2.2.2 凈化

于上述離心后提取液中移取3.5 mL上清液，直接過6 cc規(guī)格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持速度1 s·滴-1。用玻璃小管收集全部流出液, 準確移出2.5 mL至15 mL帶刻度小管內(nèi)。流出液在40℃水浴下氮氣吹0.5 mL。殘留液用甲醇水溶液（1.2.7）定容至1.00 mL，過0.22 μm水相濾膜，待上機測定。

2.3 標準工作曲線的制備

精密量取氯霉素藥物的標準溶液適量，用相應的空白樣品基質提取液制備混合標準濃度系列：氯霉素濃度為 0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1，供液相色譜—串聯(lián)質譜儀測定，并根據(jù)試劑濃度和響應的峰面積制備標準工作曲線。

2.4 試驗靈敏度、回收率和精密度的測試

本試驗以雞肉樣品為基質，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進行前處理和測定，平行樣品n=6，根據(jù)各樣品檢測值，計算出方法檢出限（MDL），計算公式見式1。

其中k為置信因子取3。本試驗通過陰性樣品加標實驗，根據(jù)加標樣品檢測值與加標濃度比值計算實驗回收率。再通過平行加標實驗，計算出試驗的精密度，用于評估實驗誤差和穩(wěn)定性。

2.5 結果計算

本試驗以內(nèi)標方法單點校準進行定量測定，計算出試樣中的氯霉素藥物的含量，計算公式見式2。

式中，X-試樣中待測組分殘留量（μg·kg-1）；CS-標準工作溶液濃度（ng·mL-1）；V1-試樣提取體積（mL）；V2-試樣移取體積（mL）；V3-試樣定容體積（mL）；m-樣品稱樣量（g）；A-樣液中待測目標物的峰面積；AS-標準工作溶液的峰面積；Asi-標準工作溶液中內(nèi)標物的峰面積；Ai-樣液中內(nèi)標物的峰面積。

注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，結果保留3位有效數(shù)字。

3 試驗結果

3.1 高效液相條件確定

為尋找分離度好，靈敏度高，峰形尖銳的液相條件，參考相關文獻及檢測標準，選用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）色譜柱，柱溫為40℃，采用乙腈和水作為流動相，進行梯度洗脫。進樣流速為0.30 ng·mL-1時，氯霉素響應強度1.3×103，背景基線非常低，峰形尖銳，保留時間適中，可有效進行氯霉素藥物的定性定量檢測。

圖1 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素離子通道色譜圖

3.2 前處理方法的確定

由于雞肉呈現(xiàn)纖維狀，所以需要用本方法先將雞肉做粉碎處理，選用乙腈水溶液作為提取液，超聲離心后可以充分提取氯霉素藥物，其中試劑也起到了稀釋的作用，有利于降低其他成分對于儀器檢測的干擾，并且提高儀器檢測的靈敏度。

3.3 線性范圍和方法檢出限

按照方法條件設置參數(shù)，配置一系列不同濃度的標準樣品溶液（0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1），待儀器穩(wěn)定之后，對系列標準樣品溶液進行測定，繪制其標準曲線，相關系數(shù)為r=0.999。

以雞肉樣品為基質，添加濃度為0.2 μg·kg-1，按照上述方法進行前處理和測定，平行樣品n=6，根據(jù)各樣品檢測值（0.18、0.20、0.20、0.16、0.20、0.18 μg·kg-1，計算出平均值X（0.187 μg·kg-1）及標準偏差Sb（0.0164），當被分析物的回收率在70%～120%時，可計算方法檢出限為0.05 μg·kg-1。

圖2 陰性樣品添加0.1 ng·mL-1氯霉素-D5離子通道色譜圖

3.4 方法精密度和回收率實驗

以雞肉樣品為基質，進行六組平行加標回收試驗，加標濃度分別為0.2、1.0、2.0 μg·kg-1。將加標樣品和空白樣品按前述方法進行處理，上機測試，加標試驗回收率范圍分別為80%～100%、88%～100%、93～100%。結果見表3。

表3 加標回收試驗精密度和回收率

4討論

本試驗討論建立雞肉中氯霉素藥物高相液相色譜串聯(lián)質譜的測定方法。該方法通過乙腈水溶液提取，離心氮吹的處理步驟。最終建立的方法檢出限達到 0.05 μg·kg-1，線性范圍為 0.1～100 μg·L-1，其相關系數(shù)r=0.999。雞肉樣品在0.2、1.0、2.0μg·kg-13個水平添加回收實驗條件下，回收率為80%～100%，相對標準偏差RSD為2.67%～8.81%。該方法具有分析過程簡單、穩(wěn)定性好、定量準確等優(yōu)點，能滿足雞肉中常見氯霉素藥物快速定性定量檢測的要求。