陳 明，江弘遠(yuǎn)，曹 峰

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

葉菜類飼料是指自然水分含量＞60%的一類飼料，可以為畜禽提供豐富的維生素及礦物質(zhì)來源。但是葉菜類飼料不合理的儲(chǔ)存及加工，會(huì)使亞硝酸鹽含量增多。亞硝酸鹽具有強(qiáng)氧化性，會(huì)對(duì)身體系統(tǒng)造成危害，長(zhǎng)期攝入亞硝酸鹽，也會(huì)引發(fā)亞硝基化合物中毒[1]。因此，人們非常關(guān)注葉菜類飼料中的亞硝酸鹽污染，控制亞硝酸鹽的攝入以及何種方式能減少亞硝酸鹽的含量，正成為飼料安全衛(wèi)生的重要因素[2]。2015年8月5日起，我國(guó)開始實(shí)施關(guān)于《蔬菜中硝酸鹽限量》的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)適用于葉菜類、莖菜類、瓜類、豆類、根菜類飼料。但是，葉菜類飼料中的硝酸鹽含量與其在各地區(qū)生長(zhǎng)方式、施肥方式、各地區(qū)土壤條件、儲(chǔ)存條件和加工方式有關(guān)系，因此，不同地域的葉菜類飼料中的硝酸鹽含量可能會(huì)出現(xiàn)差別[3-4]。因此，檢測(cè)研究葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的多少及其變化規(guī)律，以及控制動(dòng)物體攝入亞硝酸鹽量已成為至關(guān)重要的措施。試驗(yàn)研究了5種葉菜類飼料在敞口儲(chǔ)存7 d，不同加工溫度（220、80℃），密封狀態(tài)下不同儲(chǔ)存溫度（20、5℃）對(duì)葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的影響，為養(yǎng)殖者飼養(yǎng)畜禽提供衛(wèi)生健康的葉菜類飼料提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 葉菜類飼料樣品

參加試驗(yàn)的葉菜類飼料種類分別是白菜、青菜、包菜、菠菜、生菜，均購(gòu)買于江蘇省泰州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器主要包括：UV-1700SPC型可見光分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司），BSA124S型普通分析天平（蘇州金鉆稱重設(shè)備系統(tǒng)開發(fā)有限公司），JJ224BC型電子分析天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），CH～06型便攜式榨汁機(jī)（深圳市寶安區(qū)沙井廣式電器廠）。

1.1.3 試劑及其濃度

亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）；乙酸鋅溶液（220 g·L-1）；飽和硼砂溶液（50 g·L-1）；60%乙酸溶液；對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）；鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）；氯化銨緩沖液；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（220 μg·mL-1）；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg·mL-1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儲(chǔ)存時(shí)間

用自來水把各葉菜類飼料樣品洗干凈，去除爛葉及黃葉，再用去離子水把之前洗凈的葉菜類飼料樣品洗干凈，風(fēng)干水分。將葉菜類飼料樣品儲(chǔ)存在室溫（20℃）的環(huán)境下，并在第1～7天每天分別測(cè)定5種葉菜類飼料樣品中的吸光度，并將吸光度帶入亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，得出亞硝酸鈉的含量。

1.2.2 加工方法

將洗凈的葉菜類飼料樣品進(jìn)行加工處理，加工方法是放在鍋上炒制，溫度為220和80℃，按試驗(yàn)步驟操作，最后對(duì)于處理好的待測(cè)液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，并計(jì)算出亞硝酸鈉的含量。放置24 h后，再次測(cè)定兩種葉菜類飼料樣品的吸光度值，并計(jì)算出亞硝酸鈉的含量。

1.2.3 不同儲(chǔ)存溫度

將葉菜類飼料樣品塑料袋密封，分別在常溫（20℃）和冷藏（5℃）環(huán)境下儲(chǔ)存1、2、3、4、5、6、7 d，每天8:00對(duì)密封儲(chǔ)存在室溫（20℃）和冷藏（5℃）環(huán)境下的5種葉菜類飼料分別進(jìn)行采樣，共7 d，進(jìn)行吸光度檢測(cè)，并計(jì)算出亞硝酸鈉的含量。

1.3 待測(cè)液的制備

稱取葉菜類飼料樣品10.00 g→放置在25 mL燒杯中→加飽和硼砂溶液12.5 mL（50 g·L-1）→攪拌均勻→精確加入70℃去離子水30 mL→100℃水浴鍋加熱15 min→取出冷卻至室溫→將試樣洗入250 mL容量瓶→加入亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）5.0 mL→搖勻→加入乙酸鋅溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精確加水至刻度，搖勻→放置30 min→上清液過濾，棄去初濾液30 mL→繼續(xù)過濾→吸取之后過濾所得濾液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混勻→靜置3～5 min→加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精確加超純水至刻度→混勻→靜置15 min，后留作測(cè)定吸光度所用。

1.4 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用刻度吸管精確移取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液0、 0.10、 0.20、 0.30、 0.40、 0.50、 0.75、 1.00、1.25 mL→分別置于25 mL棕色容量瓶中→精確加去離子水至12.5 mL→分別加入對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2 mL→混勻→靜置 3～5 min后→各加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1 mL→精確加超純水至25 mL刻度，混勻→靜置15 min。用1 cm比色管，以黑色遮光體調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度，以亞硝酸鈉的質(zhì)量（m）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；其回歸線方程為y=0.1x+0.001 8，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，之后每天所測(cè)吸光度均要帶入此方程進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 亞硝酸鈉含量的測(cè)定，采用文獻(xiàn)進(jìn)行測(cè)定

稱取葉菜類飼料樣品10.00 g→放置在25 mL燒杯中→加飽和硼砂溶液（50 g·L-1）12.5 mL→攪拌均勻→精確加入70℃去離子水30 mL→100℃水浴鍋加熱15 min→取出冷卻至室溫→將試樣洗入250 mL容量瓶→加入亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）5.0 mL→搖勻→加入乙酸鋅溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精確加水至刻度，搖勻→放置30 min→上清液過濾，棄去初濾液30 mL→吸取余下濾液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混勻→靜置3～5 min→加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精確加去離子水至刻度→混勻→靜置15 min，用1 cm比色管，以黑色遮光體調(diào)零，含亞硝酸鈉0.00 mg的試液作為對(duì)照，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度。亞硝酸鈉含量的計(jì)算公式見式1。

式中，X為各葉菜類飼料試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為mg·kg-1（換算而來）；m1表示測(cè)定用樣液（測(cè)完吸光度后帶入亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算所得出的結(jié)果）中亞硝酸鈉的質(zhì)量，單位為μg；m0表示試樣（每天稱量各葉菜類飼料樣品時(shí)的質(zhì)量，精確記錄）的質(zhì)量，單位為g；V1是測(cè)定用樣液的體積；V0是試樣處理液的總體積，單位為mL；以在重復(fù)前提下獲得的5次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表現(xiàn)出亞硝酸鈉的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行初步處理，再用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan's多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

室溫敞口儲(chǔ)存葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量見表1。

由表1可知，在儲(chǔ)存溫度（室溫20～25℃），儲(chǔ)存方式（露天儲(chǔ)存）7 d中，白菜中亞硝酸鈉含量增加了 4×10-4mg，差異顯著（P＜0.05）；包菜、青菜、生菜中亞硝酸鈉含量增加了7×10-4～1.1×10-3mg，差異顯著（P＜0.05）；菠菜中亞硝酸鈉含量變化較大，尤其在第6天達(dá)到峰值，之后便開始呈下降趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05）。

不同葉菜類飼料7 d，在室溫敞口儲(chǔ)存下亞硝酸鈉含量的變化具體見圖2～6。

由圖2可知，第1～5天白菜中亞硝酸鈉的含量變化有著變化較為平穩(wěn)的趨勢(shì)，第3～5天變化甚微，僅有2×10-5mg，第5～6天急劇上升，達(dá)到2.18×10-3mg，第6～7天變化甚微，僅有2×10-5mg。

由圖2可知，第1～4天，包菜中亞硝酸鈉的含量呈緩慢增加趨勢(shì)，第4～5天急劇上升，達(dá)到3×10-4mg，第5～6天變化甚微，僅有4×10-5mg，第6～7天變化較大，達(dá)到2×10-4mg。

由圖3可知，第1～4天，青菜中亞硝酸鈉含量變化不明顯，第4～5天，急劇上升，達(dá)到4×10-4mg，第5～7天變化較為平緩。

表1 室溫敞口儲(chǔ)存葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量

圖2 白菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

圖3 包菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

圖4 青菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

由圖4可知，第1～4天，生菜中亞硝酸鈉含量有著較為快速的增長(zhǎng)趨勢(shì)，每天增加1×10-4mg，第4天作為一個(gè)分界點(diǎn)，第4～7天生菜中亞硝酸鈉含量增加趨勢(shì)較為平緩。

圖5 生菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

由圖5可知，第1～5天中菠菜中的亞硝酸鈉含量隨著天數(shù)的增加而呈現(xiàn)出緩慢上升趨勢(shì)，但增加甚微，在第5～6天亞硝酸鈉含量急劇上升，并在第6天達(dá)到峰值，在第6天后便呈下降趨勢(shì)。

圖6 菠菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

2.2 兩種加工溫度對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

采用220和80℃對(duì)5種葉菜類飼料進(jìn)行熱處理，亞硝酸鹽含量見表2，放置24 h后，5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量見表3。

由表2可知，兩種加工溫度下，5種葉菜類飼料在220℃比在80℃下亞硝酸鈉含量要高，包菜、菠菜最多，為1×10-3mg。白菜、青菜最少，為5×10-4mg。

表2 兩種加工溫度葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量 μg·kg-1

由表3可知，采用220和80℃放置24 h后，葉菜類飼料中亞硝酸鈉含量變化不大，生菜中亞硝酸鈉含量增加最多，增加1.7×10-3mg，青菜中亞硝酸鈉增加的最少，增加3×10-4mg，放置時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致葉菜類飼料中亞硝酸鈉含量隨之上升。

2.3 不同儲(chǔ)存溫度對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

不同儲(chǔ)存溫度對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響見表4～5。

由表4可知，在常溫密封儲(chǔ)存下，白菜、青菜、包菜和菠菜的亞硝酸鹽含量在第2～3天均不存在顯著差異（P＞0.05）。生菜的亞硝酸鹽含量在的第4～5天均不存在顯著差異（P＞0.05），菠菜的亞硝酸鹽含量在的第1天與第2天均不存在顯著差異（P＞0.05）。

由表5可知，在冷藏儲(chǔ)存下，白菜和包菜的亞硝酸鹽含量在第1天和第2天均不存在顯著差異（P＞0.05），青菜、菠菜和生菜的亞硝酸鹽含量均差異顯著（P＜0.05）。

5種葉菜類飼料在兩種儲(chǔ)存溫度下亞硝酸鹽含量7 d的變化見圖8～11。

表3 兩種加工溫度放置24 h后葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量 μg·kg-1

表4 密封儲(chǔ)存條件下常溫（20℃）5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的變化

表5 冷藏（5℃）儲(chǔ)存條件下5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的變化mg·kg-1

圖7 白菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖9 包菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖11 生菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

4討論

4.1 不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

試驗(yàn)中5種葉菜類飼料儲(chǔ)藏7 d，亞硝酸鈉的含量隨天數(shù)的增加而增加，達(dá)到峰值后便有所下降，尤其以菠菜最為明顯，新鮮菠菜中亞硝酸鈉含量很低，在常溫露天儲(chǔ)存下，菠菜中亞硝酸鈉含量隨天數(shù)增加而增加，在前5 d呈現(xiàn)出緩慢上升趨勢(shì)，在第6天達(dá)到峰值，并尤其明顯，亞硝酸鈉含量是第5天的9倍之多，之后便呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

在試驗(yàn)中，儲(chǔ)存時(shí)間（0～6 d）及儲(chǔ)存溫度（室溫20～25℃）對(duì)葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的影響，根據(jù)林周孟等人的存放時(shí)間及存放溫度對(duì)葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響的研究可知，在0～6 d的儲(chǔ)存時(shí)間中，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量均呈增加趨勢(shì)，但含量和增加趨勢(shì)有所差異，由于試驗(yàn)天數(shù)相對(duì)較少，但可以得出，白菜青菜包菜生菜中亞硝酸鹽含量隨著天數(shù)增加而所呈現(xiàn)出的增長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，但菠菜的亞硝酸鹽含量，前5 d增長(zhǎng)趨勢(shì)較為緩慢，在第6天達(dá)到峰值，之后便呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。不同種類的葉菜類飼料亞硝酸鹽含量存在較大差異[5]。從測(cè)定的5種葉菜類飼料來分析，根據(jù)徐貴華等做的存放時(shí)間對(duì)葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的試驗(yàn)，在正常儲(chǔ)存時(shí)間（0～6 d）內(nèi)以及在正常儲(chǔ)存溫度（室溫20～25℃）下，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的積累均不會(huì)超過飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（≤4 mg·kg-1）[6]。

圖8 青菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖10 菠菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

4.2 不同加工方式對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

根據(jù)梁斌的加工方法及加工后的存放時(shí)間對(duì)葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響的研究，可知不同的加工方式對(duì)不同的葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量也有不同的影響[7]。熱處理220℃的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量均比熱處理80℃下的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量要高5×10-4～1×10-3mg。根據(jù)呂元楷的隔夜菜中亞硝酸鹽含量的分析研究和張麗華等的葉菜類飼料中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量分析與評(píng)價(jià)，熱處理220℃放置24 h后，白菜，青菜中亞硝酸鹽含量要比熱處理80℃放置24 h高3×10-4～8×10-4mg，包菜、生菜、菠菜中亞硝酸鹽含量要比熱處理80 ℃放置24 h高3×10-4～1.7×10-3mg[8-9]。

4.3 不同儲(chǔ)存溫度對(duì)5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

葉菜類飼料在常溫密封儲(chǔ)存的過程中隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，而且在第3～4天葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量出現(xiàn)急速增長(zhǎng)，第5天，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量下降，第6天達(dá)到最大值，然后再次下降。其原因可能是葉菜類飼料中的硝酸鹽和亞硝酸鹽在一定條件下相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致亞硝酸鹽含量降低[10]。這與王子云等試驗(yàn)結(jié)果的變化規(guī)律基本一致[11]。菠菜和青菜在常溫密封儲(chǔ)存的第5天時(shí)便開始出現(xiàn)腐葉，說明在常溫下葉菜類飼料不宜儲(chǔ)存時(shí)間過長(zhǎng)。

冷藏儲(chǔ)存下的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量在1～3 d的時(shí)候變化不大，亞硝酸鹽含量在3～4 d的時(shí)候急劇增長(zhǎng)，在第6天時(shí)達(dá)到峰值。但冷藏儲(chǔ)存下的葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量較低一些，可能是因?yàn)樵诒鋬?nèi)低溫冷藏的條件下不利于微生物的生長(zhǎng)，這與魏穎等的研究結(jié)果一致[12]。其中菠菜、青菜和生菜在3～4 d的增長(zhǎng)變化較其他的而言增長(zhǎng)的變化比較大。

5結(jié)論

在室溫（20～25℃）敞口儲(chǔ)存條件下，葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量隨著天數(shù)的增加而增加。不同加工方式下，熱處理220℃的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量要高于熱處理80℃的葉菜類飼料亞硝酸鹽含量，放置24 h后，煮熟葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量明顯提高，不同儲(chǔ)存溫度下葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量的峰值大小順序?yàn)槌孛芊鈨?chǔ)存＞冷藏。因此，依據(jù)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（2018年5月1日頒布），葉菜類飼料適宜在4 d內(nèi)飼喂。另外，葉菜類飼料不適合過夜飼喂。儲(chǔ)存葉菜類飼料類飼料是最好是選擇低溫冷藏的儲(chǔ)存方式，但儲(chǔ)存的時(shí)間不宜太長(zhǎng)，應(yīng)≤3 d。