陳海軍 薄璐 郭鑫 張堃 赫麗杰 李強 李雨澤

我國是結核病大國，同時也是糖尿病大國，2017年我國結核病新發(fā)患者約為88.9萬例，糖尿病患者約為1.14億例[1-2]。研究顯示，糖尿病患者是并發(fā)活動性肺結核的高危人群，且二者結合后疾病預后差，復發(fā)率、死亡率均明顯上升[3-5]，加大了臨床中2型糖尿病并發(fā)肺結核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)治療和控制的難度。目前關于T2DMTB的病因研究成為了熱點，其中從遺傳學角度探討炎癥因子基因多態(tài)性與T2DMTB的關系為學者們在T2DMTB的病因?qū)W研究中打開了思路。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水準上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，SNP會影響個體對一些疾病易感性發(fā)生改變。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體，在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮抗感染作用[6]。Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)是TLR中的重要成員，研究顯示TLR2在抗結核中至關重要[7]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種屬于磷酸肌醇3-激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究表明mTOR有抗菌、免疫抑制和抗癌等特性，在細胞生長、增殖凋亡等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[8-10]。本研究對黑龍江省部分T2DMTB患者與單純2型糖尿病患者TLR2的rs3804100、rs3804099位點及mTOR的rs2295080位點的基因多態(tài)性進行檢測，探討這3個位點的基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)肺結核的關系。

材料和方法

一、研究對象

觀察組患者男199例，女101例；年齡20～87歲，平均(51.97±11.87)歲。對照組患者男171例，女129例；年齡20～87歲，平均(58.73±11.46)歲。

二、納入及排除標準

納入標準：對照組符合2型糖尿病的診斷，診斷標準見文獻[13]；觀察組除符合2型糖尿病的診斷，同時符合肺結核的診斷，診斷標準見文獻[14]。排除標準：非黑龍江省人群，非漢族人群，艾滋病、病毒性肝炎(乙、丙型)、梅毒患者，并發(fā)各種腫瘤、結締組織疾病、其他內(nèi)分泌疾病患者。

三、質(zhì)量控制

1. 調(diào)查員培訓：所有參與書寫病例的醫(yī)師均經(jīng)過統(tǒng)一培訓，明確錄入受試者信息的目的和意義，充分掌握錄入信息內(nèi)容的標準及注意事項。本研究統(tǒng)一規(guī)定了基本信息錄入表的填寫方法、相關定義說明、樣本的采集及保存方法。

2. 錄入信息的核實：所有參與書寫病例的醫(yī)師均經(jīng)過主治醫(yī)師及以上級別醫(yī)師培訓，通過查找患者找到研究所需要的受試者信息，在查找取得的患者信息不完整時，應與受試人群當面進行信息核實。

四、研究方法

(一)收集血清及資料

采集患者外周血2 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，低溫靜置，在4 ℃下以4500×g離心15 min后分離出上清液即血清樣本，存放于-80 ℃冰箱。收集T2DMTB、2型糖尿病患者基本資料，包括患者姓名、病歷號、性別、年齡、身高、體質(zhì)量等。

(二)實驗過程

1. 血液DNA提?。翰捎帽本┨旄萍加邢薰旧a(chǎn)的血液(細胞或組織)基因組DNA提取試劑盒提取血液DNA，按照說明書步驟進行操作。

2. PCR擴增：使用定性PCR擴增儀(7500 Fast型，美國Life公司)、Taqman探針法及Roche LightCycler480檢測系統(tǒng)(瑞士羅氏公司)對基因進行分型。在每96孔板中隨機選擇1～2個空白對照，每個SNP信號都在滿足形成3個明顯分型點聚集簇的情況下，由LightCycler480的Endpoint Genotyping 軟件完成基因型分析。對于每個SNP位點，隨機選擇5%的樣本重復檢測[13]。探針信息：rs3804100，購于美國ThermoFisher公司，貨號為4351379， ID為C_ _25607727_10；rs3804099，購于美國ThermoFisher公司，貨號為4351379，ID為C_ _22274563_10；rs2296080，購于美國ThermoFisher公司，貨號為4351379，ID為C_ _16189146_10。熒光定量PCR反應體系見表1。

表1 熒光定量PCR反應體系及條件

五、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以“率(%)”表示。采用χ2檢驗對基因TLR2、mTOR的rs3804100、rs3804099、rs2295080位點在T2DMTB與2型糖尿病人群之間的分布差異進行比較，并進一步采用logistic回歸分析3種基因位點在兩組患者間的分布差異，采用后退法，帶入回歸模型的分類變量賦值，見表2。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 logistic回歸模型中分類變量賦值情況

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤

結 果

1. 3種位點等位基因在觀察組和對照組之間的分布：TLR2的2個基因位點rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位點的等位基因在觀察組和對照組中分布差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表3。

2. 各因素與T2DMTB發(fā)病關系的單因素分析：兩組患者性別、年齡在觀察組和對照組中分布差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，TLR2的2個基因位點rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位點在觀察組和對照組中分布差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表4。

表3 觀察組和對照組中等位基因的對比分析

注a：胞嘧啶；b：鳥嘌呤；等位基因頻率=等位基因頻數(shù)/600×100%

表4 各因素與T2DMTB發(fā)病關系的單因素分析

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；年齡分組考慮到本研究收集的患者主要集中在≥50歲人群，<50歲人群例數(shù)較少，且疾病變化較≥50歲人群慢，故合并為一組，而≥50歲人群按每10歲為年齡段進行分組

3. T2DMTB發(fā)病的logistic多因素分析：因單因素分析后顯示年齡、性別在兩組患者間的分布差異有統(tǒng)計學意義，所以將年齡和性別帶入logistic回歸模型中與分析變量一起進行多因素分析。結果顯示，TLR2及mTOR各基因位點多態(tài)性與T2DMTB之間均無相關性(P值均>0.05)。見表5。

表5 各因素與T2DMTB發(fā)病關系的logistic多因素分析

討 論

糖尿病與肺結核相互影響，相互促進。糖尿病患者一般因為機體代謝紊亂而不能滿足對營養(yǎng)的基本需求，因此免疫功能低下，機體感染結核分枝桿菌的概率增加。有研究顯示，2型糖尿病患者感染肺結核的概率是普通人感染肺結核的4～8倍[15]。同時，結核病又會加重糖尿病病情，消耗機體大量能量，加重糖尿病患者血糖的波動[16]。Toll樣受體和mTOR是免疫防御體系中重要的炎癥因子，它們SNP位點的改變會影響正常的信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄水平，甚至影響蛋白質(zhì)功能和免疫應答，從而使機體對某些感染的易感性增加。一些研究表明，TLR及mTOR均與機體抗結核免疫水平密切相關[12, 17]，且通過閱讀大量文獻可以得知TLR2的rs3804100、rs3804099位點及mTOR的rs2295080位點與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥密切相關[18-20]。在大量的文獻報道中[12,17-20]，不乏關于基因位點與單純結核病、單純糖尿病、糖尿病并發(fā)其他并發(fā)癥(非結核性)分別相關的研究，但關于基因位點與已經(jīng)發(fā)生糖尿病的患者易感結核病的研究分析并不多見，所以本研究對黑龍江省部分T2DMTB患者與單純2型糖尿病患者中TLR2的rs3804100、rs3804099位點及mTOR的rs2295080位點的基因多態(tài)性進行檢測，探討這3個位點的基因多態(tài)性與T2DMTB的關系。

logistic分析結果顯示，TLR2的rs3804100、rs3804099位點及mTOR的rs2295080位點的基因多態(tài)性均與T2DMTB無關。分析原因首先可能是因為樣本量還不夠大；且由于研究群體為黑龍江省人群，不能代表其他地區(qū)人群也有相同結論；如之前有研究顯示，在河北省石家莊人群中rs3804099的CC基因型與結核易感性有關[21]，但本研究中并未得出此結論，可能跟地區(qū)、人群差異有關。另外，本研究中沒有納入健康人群作為對比，由于兩組均為2型糖尿病患者，有可能在兩組患者中都存在3個位點的基因多態(tài)性。并且也沒有通過ELISA試劑盒檢測TLR2、mTOR在患者血清中的水平；研究中只檢測了3個位點的基因多態(tài)性，TLR2、mTOR均與肺結核相關，途徑中可能存在其他位點及單倍型[22]；其次本研究僅通過校正控制了年齡、性別在兩組中的均衡性，并沒有對其他可能影響基因多態(tài)性與疾病關系的因素進行控制，也可能對結果產(chǎn)生偏倚。

在今后的相關研究中，需要繼續(xù)擴大樣本量，并納入一部分匹配的健康人作為對照；并對影響因素如體質(zhì)量指數(shù)，是否吸煙、飲酒，空腹血糖情況，是否口服降糖藥，是否使用胰島素等在組間的均衡性進行嚴格控制。同時對TLR2及mTOR的其他位點進行分析，并對患者進行相關血清分子學檢測，從分子水平、基因水平及其他水平共同分析探討，豐富完善對TLR2及mTOR基因多態(tài)性與T2DMTB關系的研究。