馮 慿,丁曉靜,高 鐵,杜茹蕓,陳泓序*

(1. SCIEX中國, 北京 100015; 2. 惠氏營養(yǎng)品(中國)有限公司, 上海 200041;3. 北京市疾病預(yù)防控制中心, 北京 100013; 4. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院, 上海 200233)

牛乳是重要的營養(yǎng)物質(zhì),它不僅是嬰幼兒獲取蛋白質(zhì)的重要來源之一,也為成年人提供高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。牛乳中的蛋白主要分為兩種,酪蛋白(CN)和乳清蛋白。其中約80%為CN, 20%為乳清蛋白[1]。牛乳中的CN主要由αS1-CN、αS2-CN、β-CN和k-CN這4種亞型組成,其中β-CN約占CN的33%～40%[1-3]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)世界上的奶?？梢院?3種不同的β-CN變異體[4]: A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、G、H1、H2和I。其中A1、A2、B、C和I是比較常見的5種變異體,其他變異體極為少見[4-6]。A1和A2出現(xiàn)的概率最高,C和I出現(xiàn)的概率很低。根據(jù)67位氨基酸是否發(fā)生突變,把這些β-CN變異體分為A1型β-CN和A2型β-CN兩類。如果蛋白的氨基酸序列中第67位氨基酸由原始的脯氨酸突變?yōu)榻M氨酸(如A1、B和C等變異體),則歸類為A1型β-CN;若67位氨基酸未發(fā)生突變,仍為原始或野生型(如A2和I等變異體),則歸類為A2型β-CN。有研究表明[5,7-10],經(jīng)過人體消化酶酶解后,含突變氨基酸的A1型β-CN會產(chǎn)生能被人體直接吸收并引起某些非傳染性疾病(如孤獨癥、精神分裂癥、I型糖尿病、冠心病等)的β-酪啡肽(BCM-7),或造成腸胃不適;而原始型A2型β-CN則不會產(chǎn)生BCM-7。全球有約30%奶牛只產(chǎn)A2β-CN[11],所謂A2乳制品是指由這些只產(chǎn)A2β-CN,或以產(chǎn)A2β-CN為主的奶牛產(chǎn)出的奶加工而成的乳制品。β-CN變異體引起的營養(yǎng)和病理的討論,至今仍是爭議很大的議題。即使如此,從亞洲到美洲和歐洲,市場上都出現(xiàn)了有關(guān)A2β-CN的奶制品及其功能聲稱,而且價格都明顯高于非A2β-CN的奶制品。目前,市面上的A2β-CN的奶制品也僅是聲稱A2β-CN“為主”,至于A2β-CN成分的含量并沒有明確的規(guī)定,這給各國政府法規(guī)制定帶來了很大的挑戰(zhàn)。為評價A2乳制品的真實質(zhì)量,以保護消費者的利益,建立乳制品中A2β-CN定量分析的方法非常必要。

目前有關(guān)乳制品中A2β-CN分析的方法有免疫學(xué)方法[11]、平板凝膠電泳法[12]、液相色譜法[2,13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14]、整蛋白液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[3,15]和毛細管電泳法(CE)[16-19]。免疫學(xué)和平板凝膠電泳方法難于精確定量;而液相色譜法無法對發(fā)生了美拉德反應(yīng)(高溫消毒或熱噴粉過程中,蛋白與乳糖發(fā)生的糖化反應(yīng))的蛋白進行分離,因此只適合巴氏殺菌的液態(tài)奶(簡稱巴氏奶)中A2β-CN的分離;液相色譜-質(zhì)譜法是基于蛋白組學(xué)的原理,使用胰蛋白酶酶解CN,通過質(zhì)譜檢測酶解產(chǎn)生的特異性肽段,來對乳制品中A1和A2β-CN進行鑒定和定量的方法,但由于美拉德反應(yīng)發(fā)生在賴氨酸上,而胰蛋白酶作用位點也是賴氨酸,這使該方法僅局限于對未生成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳制品中的A1和A2β-CN的定量測定[14];整蛋白液相色譜-高分辨質(zhì)譜法對儀器、分析軟件和人員的要求很高,目前只有一篇文章報道了該方法對乳制品中β-CN各變異體的定量測定[15];利用CE分析A2β-CN的已有報道中,大部分僅進行了CN的分離[16,17]或A1和A2β-CN的定性分析[18],未對A2β-CN進行含量的測定。僅有的使用CE方法對A1和A2β-CN進行定量測定的報道也僅局限于對未生成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳制品中的A2β-CN的定量測定[19]。

本文建立了對液態(tài)奶和奶粉中A2β-CN和總β-CN進行分離并定量的毛細管區(qū)帶電泳(CZE)方法。該方法不僅可以分析巴氏奶產(chǎn)品,而且對發(fā)生了美拉德反應(yīng)的超高溫殺菌(UHT)奶及奶粉中的A2β-CN和總β-CN,也可以進行有效地分離和定量分析。方法操作簡單,快速,具有良好的精密度和準確度。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

SCIEX PA 800 Plus藥物分析系統(tǒng)(毛細管電泳儀,配備紫外檢測器)和 32 KaratTM軟件10.1(SCIEX,美國); Vortex-Genie 2渦旋混合器(Scientific Industries,美國);超聲波振蕩儀(5510 Branson, Fisher Scientific,美國); Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜和Agilent 6545XT Q-TOF質(zhì)譜儀(Agilent,美國)。

尿素(分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;一水合磷酸二氫鈉(純度≥98%)、二水合磷酸氫二鈉(純度≥98%)、檸檬酸(純度≥99.5%)、磷酸(85%(質(zhì)量分數(shù))水溶液)購自德國Merck公司。羥丙基甲基纖維素(HPMC,分析純,貨號:09963)、羥乙基纖維素(分析純,相對分子質(zhì)量90 000,黏度75～100 cP)、2-羥乙基纖維素(分析純,相對分子質(zhì)量250 000,黏度80～125 mP)以及α-CN(純度≥70%)、β-CN (純度≥98% (PAGE))、κ-CN(純度≥70%)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin, 純度≥85%(PAGE))、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, 純度≥90%(PAGE))、牛血清蛋白(bovine serum albumin,純度≥98%)、免疫球蛋白G (immunoglobulin G,純度≥95%)、乳鐵蛋白(lactoferrin,純度≥85%(PAGE))均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 標準儲備液的配制

稱取70 mgβ-CN,置于5 mL容量瓶中,加入適量超純水超聲溶解(勿渦旋,防止太多泡沫產(chǎn)生),用超純水定容,混勻。根據(jù)β-CN的蛋白純度計算該儲備液質(zhì)量濃度為12 g/L。分裝0.5 mL于1.5 mL的安全鎖定微量離心管中,儲藏于-20 ℃,可穩(wěn)定至3個月(避免反復(fù)冷凍融化)。

1.3 分離緩沖溶液和樣品稀釋液的配制

以水作溶劑,分別配制10 mol/L尿素、0.2 mol/L Na2HPO4、1.0 mol/L檸檬酸和1% (質(zhì)量分數(shù)) HPMC作為儲備液。

分別移取10 mL尿素、6.25 mL Na2HPO4、3.5 mL檸檬酸和5 mL HPMC儲備液,均置于同一25 mL容量瓶中,用超純水稀釋、定容至刻度,混勻配制成50 mmol/L Na2HPO4+140 mmol/L檸檬酸+0.2% HPMC+4 mol/L尿素的分離緩沖溶液(pH為2.7)。

分別移取5 mL Na2HPO4、2 mL檸檬酸和12.5 mL尿素儲備液,均置于同一25 mL容量瓶中,用超純水稀釋、定容至刻度,混勻則配制成40 mmol/L Na2HPO4+80 mmol/L檸檬酸+5 mol/L尿素的樣品稀釋液(pH為2.7)。

1.4 實驗樣品及前處理

A2巴氏奶和普通(A1/A2)巴氏奶樣品分別購自上海和蘇州超市。A2全脂奶粉購于上海超市。普通(A1/A2)脫脂奶粉是用于生產(chǎn)嬰兒奶粉的脫脂奶粉原料。A2全脂奶粉和普通脫脂奶粉均經(jīng)噴粉干燥制得。A1脫脂奶粉是用不含A2變異體的牛奶在愛爾蘭小規(guī)模生產(chǎn)制得。

對于奶粉樣品,配制相當(dāng)于約10 g/L蛋白含量的樣品水溶液,渦旋混合均勻,再與樣品稀釋液以等體積比混勻。對于液態(tài)奶樣品,根據(jù)樣品中蛋白含量,先用水稀釋一倍或兩倍,再與樣品稀釋液以等體積比混勻。

1.5 毛細管電泳條件

毛細管的活化:0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、去離子水和分離緩沖液依次在138 kPa下沖洗30、2、2和10 min。每兩針運行間毛細管的沖洗:使用上述溶液在138 kPa下依次沖洗2、1、2和3 min。

熔融石英毛細管,50 μm×30/40 cm (有效/總長度)(SCIEX,美國);樣品溫度:25 ℃;毛細管溫度:38 ℃;窗口狹縫:2 (100 μm×200 μm);分離電壓:20 kV (500 V/cm);進樣壓力及進樣時間:3.5 kPa, 10 s;檢測器及波長:UV 214 nm。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件 色譜柱:Advance Bio RP-mAb C4柱,3.0 mm×150 mm, 45 nm, 3.5 μm;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B為80%(v/v,下同)異丙醇+10%ACN+9.9%水+0.1%甲酸;流速:0.6 mL/min;柱溫:80 ℃。

Q-TOF質(zhì)譜條件 離子化模式:AJS ESI,正離子模式;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:12 L/min;霧化氣:414 kPa;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:11 L/min;毛細管電壓:5 500 V;噴嘴電壓:1 200 V;碎裂電壓:380 V;掃描模式:1 scan/s。

1.7 總β-CN和A2 β-CN的積分和濃度計算

總β-CN的校準峰面積由β-CN各變異體的校準峰面積加和得到?？偊?CN標準溶液的濃度可以由β-CN標準品準確配制。A2β-CN的濃度由A2β-CN和總β-CN的校準峰面積比值與總β-CN的濃度計算得到。根據(jù)總β-CN和A2β-CN的校準峰面積對其濃度制作相應(yīng)的線性曲線,通過外標法來計算待測樣品中總β-CN和A2β-CN的濃度。對于高溫噴粉的奶粉或UHT奶,由于具有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,β-CN各變異體的校準峰面積是由變異體和其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物峰的校準峰面積加和來計算的。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離緩沖液種類、pH和分離溫度的選擇

本研究初期選用磷酸-磷酸鹽體系作為分離緩沖液。雖然α-CN的分離更好,β-CN的遷移時間更短,但對各β-CN的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分離差。為了改善各β-CN的分離,嘗試向分離緩沖溶液中加入3%的乙腈。結(jié)果表明乙腈的加入延長了各蛋白的遷移時間,但不會改善各β-CN之間的分離。而改用磷酸鹽-檸檬酸鹽體系,則β-CN和其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物獲得較好分離,故本研究選用磷酸鹽-檸檬酸鹽體系為最佳分離緩沖體系。

CN的pI為4.6左右,是富含磷酸根的疏水性蛋白。CN在液體中以膠束狀懸浮,并通過所帶的磷酸根與鈣等陽離子結(jié)合。當(dāng)分離緩沖溶液的pH低于CN的pI,且相差2左右時,CN帶正電。另外,CN膠束間的作用力以及磷酸根與鈣等陽離子的靜電力被酸性條件削弱,有利于β-CN從CN膠束中游離出來進入水溶液中,利于其準確定量。因此,分離緩沖體系選擇pH為2.7。

分離溫度為25 ℃和38 ℃時均可實現(xiàn)分離,但后者可縮短三分之一的電泳分析時間,故本研究將毛細管溫度控制在38 ℃。

2.2 分離緩沖液中添加劑的選擇

為進一步改善各峰間的分離,考察了纖維素類添加劑HPMC、羥乙基纖維素和2-羥乙基纖維素的分離效果。當(dāng)分離緩沖溶液中添加0.2%(質(zhì)量分數(shù))的羥乙基纖維素時,基線向上漂移,25 min內(nèi)未見蛋白峰;添加0.2%(質(zhì)量分數(shù))的2-羥乙基纖維素時,巴氏奶和經(jīng)高溫噴粉的奶粉樣品中,β-CN的B、A1和A2變異體均得到理想的分離,但在成分、基質(zhì)和加工工藝更復(fù)雜的嬰兒配方奶粉中,β-CN各變異體的分離不好。而使用HPMC作為添加劑時,巴氏奶、普通奶粉和嬰兒配方奶粉中的β-CN變異體都可以得到分離,故最終選擇HPMC為添加劑。

分離緩沖溶液中加入尿素也可破壞CN膠束間的作用力以及磷酸根與鈣等陽離子的靜電力,促使β-CN從CN膠束中游離出來,有利于其分離和定量。本研究發(fā)現(xiàn)尿素濃度會影響蛋白峰的尖銳程度,5 mol/L尿素會使蛋白峰的遷移時間增加,也會導(dǎo)致蛋白峰峰形展寬。經(jīng)優(yōu)化,選擇尿素濃度為4 mol/L。

2.3 樣品的前處理條件

由于本方法專注于β-CN的分離和定量,而β-CN不含半胱氨酸,不會與其他乳蛋白生成二硫鍵,所以本方法的樣品前處理中無需使用還原劑對樣品進行還原,直接用去離子水配制到指定濃度,并與樣品稀釋液混合即可。

2.4 β-CN標準品中各變異體的分離和鑒定

CN屬于疏水性大分子,在水中以膠束方式聚集,懸浮于水中。在本方法中,各β-CN的不同變異體在高濃度尿素和酸性條件下從CN膠束中游離出來,在電場和含HPMC的分離緩沖液中表現(xiàn)出不同的遷移速率。圖1是β-CN標準品分離的電泳圖。圖2是除β-CN外其他牛奶蛋白標準品混合物的電泳圖,其中α-CN包含αS1-CN和αS1-CN[17,18](圖2中的峰6和7)。比較圖1和圖2,兩張圖顯示β-CN的出峰時間區(qū)段與其他牛奶蛋白不重合。不僅β-CN與其他乳蛋白成功分離,3種主要β-CN變異體之間(B、A1和A2)也得到了基線分離。

圖 1 CZE方法分析β-CN標準品的電泳圖Fig. 1 Electropherogram of β-CN standard by capillary zone electrophoresis (CZE) CE conditions: background electrolyte (BGE), citric acid and phosphate buffer (50 mmol/L Na2HPO4+140 mmol/L citric acid+0.2% (mass fraction)HPMC+4 mol/L urea); capillary, fused silica capillary (30/40 (effective/total length), 50 μm i.d.); injection, pressure 3.5 kPa, 10 s; voltage, 20 kV; capillary temperature, 38 ℃; sample storage temperature, 25 ℃; detection, UV at 214 nm. Peaks: 1. B β-CN; 2. A1 β-CN; 3. A2 β-CN.

由于各種β-CN變異體的標準品很難獲得。我們根據(jù)以下兩種方法對B、A1和A2變異體進行鑒定。(1)根據(jù)各變異體所含氨基酸的帶電情況推測理論出峰順序。5種主要β-CN氨基酸序列差別列于表1。根據(jù)各個變異體所包含的堿性氨基酸的分析,在pH 2.7的條件下,各變異體帶正電荷由多到少的順序依次為B=C>A1>A2=I。由于各個變異體的體積基本一致,因此在根據(jù)電荷/體積分離的CZE模式下,其遷移順序主要取決于各個變異體的帶電荷情況,其理論出峰順序應(yīng)為:B (C接近B)、A1、A2 (I接近A2)。其中變異體B和C、A2和I的遷移會非常接近,難以分離。但C和I變異體的含量較低,因此,推斷圖1中的峰1、2和3分別為B、A1和A2β-CN變異體。由于I與A2在產(chǎn)生BCM-7的意義上都類屬于A2型,且一般含量很低,在樣品中即使I和A2沒能分離,將I定量于A2中也是可以接受的。而B和C的共遷移不影響A2β-CN和總β-CN的定量。(2)與整蛋白LC-HRMS中各個峰面積對比來進一步確認對各個變異體峰的鑒定。由于整蛋白LC-HRMS可以準確測定各個變異體的相對分子質(zhì)量并對其進行相對定量,因此我們將CE和整蛋白LC-HRMS方法分析β-CN各變異體的相對峰面積結(jié)果進行比較(見表2)。結(jié)果表明,按照理論推斷的出峰順序鑒定出來的各變異體的校準峰面積,與整蛋白LC-HRMS對應(yīng)的各變異體校準峰面積一致。進一步確定了β-CN各變異體的遷移時間順序為B、A1和A2。

圖 2 CZE方法分析除β-CN外其他主要牛奶蛋白標準品混合物的電泳圖Fig. 2 Electropherogram of main milk protein standards except of β-CN CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. β- lactoglobulin; 2. bovine serum albumin; 3. α-lactalbumin; 4. lactoferrin; 5. IgG; 6. αS1-CN; 7. αS2-CN.

圖 3 CZE方法分析(a) A2巴氏奶和(b)普通(A1/A2)巴氏奶的電泳圖Fig. 3 Electropherograms of (a) A2 pasteurized milk and (b) A1/A2 pasteurized milk by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. B β-CN; 4. A1 β-CN; 5. A2 β-CN.

表 1 5種主要β-CN變異體中氨基酸序列的差別

Data from https://www.uniprot.org/uniprot/; the different amino acid was highlighted as italic.

表 2 CE和LC-HRMS方法分析β-CN標準品中B、A1和A2變異體的校準峰面積

2.5 A2巴氏奶和普通巴氏奶的CE分析

圖3a是典型的A2巴氏奶的電泳圖。β-CN變異體峰根據(jù)β-CN標準品得以鑒定,在B(峰3)與A2β-CN(峰5)之間有多個低含量的峰。根據(jù)之前的研究[14,17,18],在B與A2β-CN之間無β-CN外的其他蛋白峰,因此這些低含量的峰應(yīng)為其他β-CN變異體的峰。由于本方法僅測定A2β-CN和總β-CN的含量,無需單獨對這些變異體峰進行分別鑒定及定量,將其峰面積一起計算到總β-CN即可。比較圖3中A2巴氏奶和普通巴氏奶,可以明確地看出兩款巴氏奶樣品中β-CN各變異體分布的區(qū)別和A2β-CN含量(峰5)的區(qū)別。經(jīng)對不同生產(chǎn)廠家、不同批次的3份A2巴氏奶進行測定,3份樣品中A2β-CN占總β-CN的峰面積百分比均大于92%。

2.6 對發(fā)生美拉德反應(yīng)的β-CN變異體的定量

在高溫噴粉制成奶粉或?qū)σ簯B(tài)奶進行超高溫殺菌的過程中,乳制品中的蛋白與乳糖會發(fā)生反應(yīng)。一個蛋白可能結(jié)合一個、兩個或多個乳糖,生成不同的糖化產(chǎn)物,這類反應(yīng)叫作美拉德反應(yīng)。這些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有與蛋白變異體不同的電荷/體積比,比蛋白變異體略晚出峰,形成蛋白變異體和其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的多峰組。該現(xiàn)象在毛細管凝膠電泳分析乳制品中也有出現(xiàn)[20]。圖4中的a是經(jīng)噴粉工藝得到的A2全脂奶粉樣品的CE圖;b是A2巴氏奶的CE圖。該圖比較了同是A2奶源,沒有美拉德反應(yīng)(巴氏奶,b)與發(fā)生了美拉德反應(yīng)(奶粉,a)的乳制品的出峰差別。

表 3 日內(nèi)和日間精密度

*g/L for milk; g/100 g for milk powder. RSD(r): intraday RSD; RSD(I): interday.

圖 4 CZE方法分析(a) A2全脂奶粉和(b) A2巴氏奶的電泳圖Fig. 4 Electropherograms of (a) A2 whole milk powder and (b) A2 pasteurized milk by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. A2 β-CN; 4. A2 β-CN with one lactose; 5. A2 β-CN with two lactose.

圖 5 CZE方法分析(a)普通(A1/A2)脫脂奶粉和(b) A2全脂奶粉的電泳圖Fig. 5 Electropherograms of (a) A1/A2 skim milk powder and (b) A2 whole milk powder by CZE CE conditions were the same as those in Fig. 1. Peaks: 1. αS1-CN; 2. αS2-CN; 3. A2 β-CN; 4. A2 β-CN with one lactose; 5. A2 β-CN with two lactose; 6. B β-CN; 7. A1 β-CN.

在經(jīng)過熱噴粉制得的奶粉或經(jīng)過熱加工的液態(tài)奶中,雖然蛋白與乳糖發(fā)生了美拉德反應(yīng),形成了蛋白及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的多峰組,但該方法依然能夠?qū)ⅵ?CN的主要變異體峰組實現(xiàn)基線分離,如圖5中普通(A1/A2)脫脂奶粉所示。對于此類乳制品,使用A2β-CN變異體及其各個美拉德反應(yīng)產(chǎn)物峰的峰面積之和來計算A2β-CN的含量。

2.7 方法驗證

2.7.1線性范圍、檢出限和定量限

用β-CN標準品配制6個濃度水平的標準溶液,制作總β-CN校準峰面積與濃度的線性曲線。根據(jù)1.7節(jié)方法計算出A2β-CN的濃度,制作A2β-CN校準峰面積與濃度的線性曲線?？偊?CN和A2β-CN在0.3～12.1 g/L和0.2～7.7 g/L內(nèi),線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995,LOD分別為0.1 g/L和0.067 g/L,LOQ分別為0.3 g/L和0.2 g/L。

2.7.2方法的日內(nèi)和日間重現(xiàn)性驗證

采用A2巴氏奶、普通(A1/A2)巴氏奶、A2全脂奶粉和普通(A1/A2)脫脂奶粉樣品進行了重現(xiàn)性測試,結(jié)果見表3。驗證數(shù)據(jù)顯示:A2β-CN和總β-CN的日內(nèi)精密度RSD (r)分別為2.4%～4.7%和2.6%～4.8%;日間精密度RSD (I)分別為4.0%～6.3%和3.9%～6.7%。

2.7.3回收率

A1脫脂奶粉中不含A2β-CN,并且其他物質(zhì)和蛋白含量與A2奶相似,適于做A2加標回收率測定的本底。因此,以一份從愛爾蘭得到的A1脫脂奶粉的水溶液作為本底(A1β-CN終含量約為0.99 g/L),分別加入兩個濃度水平(A2β-CN終含量分別為1.52 g/L和0.76 g/L)的A2巴氏奶和A2全脂奶粉,測定A2和總β-CN的添加回收率,用以評價本方法的準確度。其中A2和總β-CN的理論值和加入A1脫脂奶粉后的計算值均通過校準曲線求得。結(jié)果表明,A2巴氏奶中A2β-CN和總β-CN的回收率分別97.1%～106.4%和98.7%～94.6%; A2全脂奶粉中A2β-CN和總β-CN的回收率分別94.4%～101.7%和90.7%～85.5%。數(shù)據(jù)為3個平行測定的平均值。

2.8 液態(tài)奶和奶粉中A2 β-CN和總β-CN的測定

根據(jù)文獻報道,牛奶中CN的含量占總蛋白質(zhì)含量的80%,而總β-CN約占CN含量的36%[2],因此可根據(jù)乳制品中的蛋白質(zhì)標簽值計算出其中總β-CN的含量(計算值,見表4)。表4中還列出了CZE方法所測得的12個乳制品樣品(液態(tài)奶和奶粉)中總β-CN含量、A2β-CN含量和A2β-CN占比的結(jié)果。將測得的總β-CN含量值與理論計算值進行了比較,獲得了一致的結(jié)果。被測的A2乳品中,A2β-CN在總β-CN的占比均大于93.9%;而普通乳品(含A1和A2)中,A2β-CN在總β-CN的占比在58.1%～68.8%之間。A2乳品和普通乳品中A2的含量有明顯的差異。

表 4 液態(tài)奶和奶粉樣品中總β-CN、A2 β-CN的含量以及A2 β-CN的占比

* g/L for milk; g/100 g for milk powder. UHT: ultra high temperature.

3 結(jié)論

本文經(jīng)過對毛細管區(qū)帶電泳分離中緩沖液種類、緩沖液pH、分離溫度和添加劑等條件的優(yōu)化,建立了分離各種β-CN變異體的方法,并利用此方法考察了液態(tài)奶和奶粉中A2β-CN和總β-CN的含量,計算了A2β-CN在總β-CN中的含量比例。對于UHT奶和奶粉,雖然在高溫殺菌或高溫噴粉過程中有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成,但該方法仍可有效地將A2β-CN及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物從其他的β-CN中分離出來并定量。該方法可根據(jù)A2β-CN占總β-CN的含量,有效識別液態(tài)奶和奶粉究竟是以A2β-CN為主,還是A1、A2混合型制品。方法以足夠的精密度和準確度用于對乳制品中(液態(tài)奶和奶粉)的A2β-CN和總β-CN進行分析,是乳制品中A2β-CN和總β-CN含量測定的有效方法。

致謝 我們非常感謝美國Hilmar Ingredients的吳超博士就β-CN的美拉德反應(yīng)在該方法中可能的表現(xiàn)與我們所做的討論和給予的幫助!感謝惠氏蘇州工廠質(zhì)控實驗室在實驗過程中提供儀器和試劑的支持。