吳文濤，董 瑩，鄧人可，薛美靜，張 靖，王 揚(yáng)

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】番茄(Solanumlycopersicon)又稱為西紅柿、番柿，屬茄科(Solanaceae)，起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)的經(jīng)濟(jì)作物。其營養(yǎng)豐富，味道獨(dú)特，逐漸成為主要的蔬菜作物被世界各國廣泛種植。另外，番茄作為一種重要的模式經(jīng)濟(jì)作物，與其他模式作物相比，除了具有基因組較小、遺傳學(xué)基礎(chǔ)雄厚等特點(diǎn)外，還具有獨(dú)特的生物學(xué)現(xiàn)象(果實(shí)的發(fā)育、成熟過程等)[1-2]。因此，對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究具有極其重要的意義。 根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是世界上分布最廣、危害最重的植物寄生線蟲，已引起廣泛的關(guān)注，也是中國最主要的農(nóng)作物病原線蟲[3-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1932年中國首次報(bào)道了南方地區(qū)番茄發(fā)生根結(jié)線蟲病，隨后全國范圍內(nèi)10余個省(區(qū))都有根結(jié)線蟲病的爆發(fā)和危害，其蔓延迅速并逐年加重，一般每年造成10 %～15 %的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重的達(dá)30 %～40 %，甚至絕產(chǎn)[6-7]。【本研究切入點(diǎn)】番茄是中國廣泛種植的蔬菜作物，但大多數(shù)番茄品種對根結(jié)線蟲均缺乏抗性。因此通過選育抗性品種加強(qiáng)對番茄根結(jié)線蟲病的防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[8]。Rutgers是國際上公認(rèn)的易感線蟲病的番茄品種，也被作為線蟲抗感性評定的標(biāo)準(zhǔn)品種[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此選擇Rutgers作為受體材料，建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，為番茄的抗根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以感病番茄品種Rutgers為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 載體、工程菌株和遺傳轉(zhuǎn)化方法

所用植物表達(dá)載體質(zhì)粒為pCAMBIA1304，質(zhì)粒上帶有植物抗性篩選標(biāo)記潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hyg;農(nóng)桿菌菌株為EHA105;采用葉盤法作為遺傳轉(zhuǎn)化方法[10]。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值5.8。

1.3.2 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+ZT 2 mg/L + IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。其中IAA和ZT要在滅菌后添加。

1.3.3 共培養(yǎng)基 愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+瓊脂8 g/L+乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)100 μmol/L 。

1.3.4 篩選培養(yǎng)基 愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，篩選農(nóng)桿菌侵染成功的愈傷組織采用的培養(yǎng)基：MS+ ZT 2 mg/L+IAA 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+Cef 600 mg/L,分別加入 Hyg的濃度為10、20、30、50 mg/L。

1.3.5 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 愈傷組織誘導(dǎo)再生芽的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+蔗糖 30 g/L+瓊脂 8 g/L+6-BA+IAA，pH5。設(shè)計(jì)6-BA的濃度為 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，IAA的濃度為0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L，兩者相互組合。滅菌后在培養(yǎng)基中加入Cef (200 mg/L) 和 Kana(50 mg/L)。

1.3.6 生根培養(yǎng)基 生根的培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基+瓊脂8 g/L+Kana 50 mg/L+IBA,設(shè)計(jì)IBA的濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L。上述各種培養(yǎng)基所用到的激素和抗生素均在滅菌后添加。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化方法

1.4.1 無菌苗的獲得 將Rutgers番茄種子先用75 %的乙醇搖晃30 S，無菌水沖洗3～4次；用5 %的NaCIO溶液搖晃20 min至種子變白，再用無菌水沖洗5～6次后將番茄種子放于滅過菌的干燥濾紙上晾干，將晾干的番茄種子置于1/2MS培養(yǎng)基上，在26 ℃光照下萌發(fā)種子。

1.4.2 最佳苗齡測定實(shí)驗(yàn) 將5、7、9和11 d的無菌苗的子葉切下，接種于MS+ ZT 2 mg/L+ IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d左右，觀察所選不同苗齡愈傷組織的生長情況，從而確定出最適合組織培養(yǎng)的番茄的苗齡[11]。

1.4.3 愈傷組織的培養(yǎng) 取9～11 d苗齡的番茄幼葉，將子葉切下，然后子葉頂端切去 1 mm，將剩余部分橫切一刀分為2塊大小相同的子葉塊，子葉葉片均勻放在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，最后放到光照培養(yǎng)間25 ℃光照培養(yǎng)。

1.4.4 農(nóng)桿菌懸浮液的準(zhǔn)備 從平板上挑取含有pCAMBIA1304載體的單菌落，接種于5 mL YM液體培養(yǎng)基(加入Rif 20 mg/L和Kana 50 mg/L)中，28 ℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。次日按照1∶50的比例接種到新鮮的YM液體培養(yǎng)基當(dāng)中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)5～6 h至OD600值為0.6～0.8。將培養(yǎng)液5000 r/min，4 ℃離心12 min，去上清后加入重懸液，重懸至OD值達(dá)到0.3左右，最后加入100 μmol/L濃度的AS(乙酰丁香酮)混勻備用。重懸液為液體培養(yǎng)基，是在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中附加20 g/L D-葡萄糖和10 g/L蔗糖，117 ℃高溫滅菌20 min(因含有葡萄糖，滅菌溫度太高葡萄糖容易碳化)。

1.4.5 愈傷組織的侵染和共培養(yǎng) 將用來做轉(zhuǎn)化的愈傷組織放到無菌三角瓶里，倒入適量重懸后加了AS的菌液，能沒過材料高3 mm左右即可，放到搖床中100 r/min，20 ℃搖晃30 min。30 min后，在超凈臺中把材料倒在滅過菌、鋪了濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中晾干，然后將浸染好的愈傷組織放在鋪放無菌濾紙的共培養(yǎng)基上，18 ℃ 暗培養(yǎng) 2 d。

1.4.6 侵染后愈傷組織的篩選 將共培養(yǎng)之后的愈傷組織接種到含有不同濃度Hyg的篩選培養(yǎng)基中，然后放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約15 d左右更換1次篩選培養(yǎng)基，共更換2次培養(yǎng)基，觀察愈傷組織的成活率。

1.4.7 番茄再生芽誘導(dǎo)篩選 將篩選得到的長出芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有不同濃度的細(xì)胞分裂素(6-BA)和生長素(IAA)的芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基上，在25 ℃光照條件下培養(yǎng)，約2周左右繼代1次，觀察出芽情況。

不定芽的誘導(dǎo)率(%) = (分化不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)) ×100[12]

1.4.8 轉(zhuǎn)基因番茄苗的生根和移栽 先將篩選得到的番茄芽放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長至2 cm左右后，再放入含有不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基中，在25 ℃光照下培養(yǎng)，觀察番茄苗的生根情況。當(dāng)轉(zhuǎn)基因番茄苗生根以后，洗去根部培養(yǎng)基后移栽到土中。

1.4.9 目的基因的PCR檢測 取長勢良好的番茄植株，采用CTAB法[13]提取轉(zhuǎn)基因番茄植株與普通植株的DNA，使用潮霉素抗性基因Hyg的特異性引物進(jìn)行PCR特異性檢測，Hyg上下游特異性引物為hyg(+):ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC, hyg(-):GGAAGTGCTTGACATTGGGGA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同苗齡對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取苗齡5、7、9和11 d番茄的子葉接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，苗齡5 d的番茄子葉接種7 d 后有 60 %子葉邊緣發(fā)黑，另外40 %的子葉明顯膨大，但并沒有愈傷組織生成(圖1A)；苗齡7 d的番茄子葉接種 7 d 后有70 %子葉明顯膨大，20 d后有少數(shù)膨大子葉分化出愈傷組織(圖1B)。苗齡9和11 d的番茄子葉在接種7 d后有90 %子葉明顯膨大，外植體顏色加深; 接種15 d后子葉切口處均產(chǎn)生大量愈傷組織，培養(yǎng)20 d左右，在愈傷組織上可見淺黃色的小突起，即為潛在的芽點(diǎn)(圖1C、D)。所以應(yīng)選取苗齡9～11 d的子葉作為最適宜的外植體。

2.2 不同濃度的Hyg對農(nóng)桿菌侵染后愈傷組織分化的影響

將與農(nóng)桿菌共侵染后的愈傷組織放入含有不同濃度Hyg的篩選培養(yǎng)基中可以發(fā)現(xiàn)，在含有10 mg/L Hyg的篩選培養(yǎng)基上愈傷組織的存活率最高，開始有芽點(diǎn)生成(圖2A)；在20 mg/L Hyg的篩選培養(yǎng)基上愈傷組織基本不能存活(圖2B)；Hyg的濃度越高，番茄愈傷組織的存活率越低，當(dāng)Hyg濃度達(dá)到50 mg/L(圖2D)。時(shí)，番茄愈傷組織幾乎全部褐變死亡。因此，Hyg的濃度大約在10 mg/L時(shí)可以有效的篩選轉(zhuǎn)基因的抗性芽。

2.3 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

含有不同濃度的6-BA和IAA的再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織的芽誘導(dǎo)率差異明顯(表1)。6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L處理番茄愈傷組織芽誘導(dǎo)率最高為55 %，6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L處理番茄愈傷組織芽誘導(dǎo)率最低為10 %。因此6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L為最理想的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

A：苗齡5 d番茄誘導(dǎo)的愈傷組織；B：苗齡7 d番茄誘導(dǎo)的愈傷組織；C：苗齡9 d番茄誘導(dǎo)的愈傷組織；D：苗齡11 d番茄誘導(dǎo)的愈傷組織A:5 days tomato seedling-induced callus; B:7 days tomato seedling-induced callus; C:9 days tomato seedling-induced callus; D:11 days tomato seedling-induced callus圖1 不同苗齡子葉誘導(dǎo)愈傷的發(fā)育情況Fig.1 Development of cotyledon-induced callus in different seedling ages

A：Hyg濃度為10 mg/L的篩選培養(yǎng)基；B：Hyg濃度為20 mg/L的篩選培養(yǎng)基；C：Hyg濃度為30 mg/L的篩選培養(yǎng)基；D：Hyg濃度為50 mg/L的篩選培養(yǎng)基A:Screening medium with a Hyg concentration of 10 mg/L; B:Screening medium with a Hyg concentration of 20 mg/L; C:Screening medium with a Hyg concentration of 30 mg/L; D:Screening medium with a Hyg concentration of 50 mg/L圖2 不同濃度Hyg下愈傷組織的篩選Fig.2 Screening of callus under different concentrations of Hyg

表1 不同濃度的6-BA和IAA的組合對番茄愈傷組織的芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA and IAA on shoot induction of tomato callus

2.4 不同濃度IBA對番茄不定芽生根的影響

對轉(zhuǎn)基因番茄不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在生根培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L IBA時(shí)，轉(zhuǎn)基因番茄苗的生根率最高、生根時(shí)間最短，根生長狀況最好。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將生根的T0植株直接移入腐殖土中，在溫室自然光照下生長,最終獲得轉(zhuǎn)基因抗性苗。圖3顯示了番茄遺傳轉(zhuǎn)化過程中的分化、生根和移栽的全過程。

2.6 目的基因的PCR分子檢測

為了證明Hyg基因已經(jīng)被整合到番茄基因組當(dāng)中，對T0代轉(zhuǎn)基因番茄做PCR檢測，檢測結(jié)果如圖4，選取的3個轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出280 bp的Hyg基因片段，而對照組的普通植株沒有檢測到Hyg基因，說明采取的試驗(yàn)方法可以獲得Rutgers番茄品種的轉(zhuǎn)基因植株。

3 討 論

針對不同苗齡對番茄愈傷組織誘導(dǎo)影響，研究表明，Rutgers番茄品種苗齡9～11 d的葉片更容易分化出愈傷組織，分化率高于90 %。而苗齡低的葉片分化率極低，究其原因是苗齡較低的葉片修復(fù)能力較差，對其切割后影響其生理代謝功能和細(xì)胞的全能性發(fā)揮。而苗齡9～11 d的葉片自身的修復(fù)能力較強(qiáng)，生理代謝更為活躍，切割后更容易分化出愈傷組織、并成芽[14]。因此愈傷組織分化時(shí)應(yīng)選擇合適苗齡的無菌苗。

表2 不同濃度IBA對番茄不定芽生根的影響Table 2 Effects of IBA on root induction of processing tomato

A：無菌苗的培養(yǎng)階段；B：子葉在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化愈傷組織階段；C：農(nóng)桿菌侵染番茄后的共培養(yǎng)階段；D：愈傷組織在篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽階段；E：生根培養(yǎng)基生根階段；F：轉(zhuǎn)基因苗生長階段A: The culture stage of the sterile seedling; B: The cotyledon inducing the differentiation callus stage on the induced callus medium; C: The co-cultivation stage after the Agrobacterium infects the tomato; D:Induction of adventitious bud stage of the callus in the screening medium; E: Rooting stage of rooting medium; F: Stage of growth of transgenic seedlings圖3 Rutgers番茄遺傳轉(zhuǎn)化的不同生長階段Fig.3 Different development stages of transgenic Rutgers

M：DNA標(biāo)樣； 1：普通番茄植株； 2～4：轉(zhuǎn)基因番茄植株M: DNA standard; 1: Common tomato plants; 2-4: Transgenic tomato plants圖4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測Fig.4 PCR detection of transgenic plants

細(xì)胞分裂素和生長素的濃度配比決定了番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系中愈傷組織的出愈率、不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽生根等各個環(huán)節(jié)。以番茄Rutgers為材料，不定芽誘導(dǎo)的最佳激素濃度配比為6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，與Carolina Cortina 等[15]研究在優(yōu)化番茄M82的再生體系時(shí)發(fā)現(xiàn)不定芽誘導(dǎo)的最佳激素濃度配比為ZT 0.5 mg/L+ IAA 0.5v、張麗華等[16]研究加工番茄BO2和BO4的誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基的最佳激素濃度配比為ZT 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L存在差異，究其原因與番茄的品種和基因型存在很大關(guān)聯(lián)[17-20]。因此針對不同品種的番茄建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，探索其誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基的激素配比是尤為重要的方向。

不同番茄品種所用的生根培養(yǎng)基也大有不同，羅素蘭等[21]在研究T79和T151番茄再生體系過程中認(rèn)為最佳的生根培養(yǎng)基為MS+IAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L，何秀霞等[22]得到的生根培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖3 %+瓊脂0.7 %+IBA 1.0 mg/L，而番茄Rutgers的生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+8 g/L瓊脂+0.1 mg/L。

4 結(jié) 論

目前報(bào)道有許多番茄的遺傳轉(zhuǎn)化方法和體系，如陳雙臣等[23]建立了Micro-Tom番茄的遺傳轉(zhuǎn)化體系、喬亞紅等[24]建立了加工番茄紅番3號的遺傳轉(zhuǎn)化體系。但未見有關(guān)Rutgers易感線蟲番茄品種遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道，而利用轉(zhuǎn)基因抗病品種解決番茄根結(jié)線蟲病又是近年來最受關(guān)注的育種策略。因此以番茄Rutgers為研究材料，首次建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系為后續(xù)番茄的抗根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。