董志淵，李林玉，馬維思，楊 斌，王 馨，嚴(yán)世武，楊麗英

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所, 云南 昆明 650205)

【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬附生植物，產(chǎn)于中國(guó)浙江、安徽、云南、廣西、四川等地，生于海拔1600 m山地半陰濕的巖石上[1]。鐵皮石斛以莖入藥，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2]。鐵皮石斛等石斛屬植物的種子在果實(shí)成熟時(shí)仍處于原胚階段，沒(méi)有胚根、胚軸、胚芽和子葉的分化，在自然條件下，需要共生菌提供營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)萌發(fā)，但萌發(fā)率較低[3-5]。采用無(wú)菌萌發(fā)技術(shù)，播種石斛種子在滅菌的培養(yǎng)基上，可顯著提高種子的萌發(fā)率[6]。種子無(wú)菌萌發(fā)及離體繁殖已成為鐵皮石斛種苗規(guī)模化生產(chǎn)的主要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，鐵皮石斛種子無(wú)菌萌發(fā)，主要采用固體培養(yǎng)基[7]。史俊和趙榮[8]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速120 r/min 的振蕩液體培養(yǎng)，可促進(jìn)鐵皮石斛種子的無(wú)菌萌發(fā)和原球莖的生長(zhǎng)，解決了固體培養(yǎng)存在的播種量小、繼代轉(zhuǎn)接工作量大等問(wèn)題。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛種子在靜置的液體培養(yǎng)液中也能萌發(fā)形成原球莖。但關(guān)于液體靜置培養(yǎng)對(duì)原球莖發(fā)育及其離體植株生長(zhǎng)的影響尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用液體培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)鐵皮石斛種子，研究不同基本培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)、原球莖發(fā)育的影響以及來(lái)自不同液體培養(yǎng)基的原球莖及其體積大小對(duì)鐵皮石斛離體植株生長(zhǎng)的影響，為優(yōu)化鐵皮石斛液體培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)蒴果產(chǎn)自浙江省樂(lè)清市，果莢飽滿(mǎn)，顏色為黃綠色，未開(kāi)裂，外表無(wú)病斑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液體靜置培養(yǎng) 蒴果沖洗干凈后，超凈工作臺(tái)上70 %乙醇浸泡30 s，4.0 %次氯酸鈉溶液浸泡消毒20 min，無(wú)菌水沖洗3次，切除蒴果兩端，從中間切開(kāi)蒴果，分為2份，分別將種子撒入50 mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基分別為1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花寶1號(hào)、1/2花寶2號(hào)等5種基本培養(yǎng)基，均加入NAA 0.5 mg/L、水解酪蛋白1 g/L、蔗糖30 g/L。培養(yǎng)基pH值5.8～6.2。培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度4800 lx，光照時(shí)間10 h/d。

培養(yǎng)過(guò)程中，每10 d觀察鐵皮石斛種子萌發(fā)生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)40 d，顯微測(cè)量種子萌發(fā)形成原球莖的直徑。每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)量約300個(gè)原球莖的直徑。以直徑長(zhǎng)度每200 μm 為單位，將原球莖劃分為6組。按如下公式統(tǒng)計(jì)原球莖直徑分布情況。

某一組的原球莖比例 (%)= (該組原球莖數(shù)目 ÷ 測(cè)量原球莖數(shù)目)× 100

1.2.2 原球莖分選和培養(yǎng) 采用滅菌的30目(篩孔600 μm)、40目(篩孔425 μm)的金屬篩，將1/2B5、1/2N6、1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的原球莖依次過(guò)篩分級(jí)，并懸浮于無(wú)菌蒸餾水中，分別吸取原球莖懸浮液，轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基。每瓶固體培養(yǎng)基約400個(gè)圓球莖。固體培養(yǎng)基配方均為1/2MS + 水解酪蛋白1 g/L + NAA 0.5 mg/L + 活性炭2 g/L。培養(yǎng)90 d后，觀察不同處理(液體培養(yǎng)基、原球莖大小)，離體植株的形態(tài)特征。按如下公式統(tǒng)計(jì)不同形態(tài)類(lèi)型的比例。

某一形態(tài)類(lèi)型的比例 (%)= (該形態(tài)類(lèi)型數(shù)目 ÷ 離體植株數(shù)目)× 100

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

鐵皮石斛種子液體靜置培養(yǎng)過(guò)程中，基本培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)影響明顯。1/2B5和1/2N6培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)10 d，明顯膨大，顏色持續(xù)變綠；培養(yǎng)20 d時(shí)，肉眼觀察到原球莖的形成；培養(yǎng)40 d時(shí)，大部分種子發(fā)育形成原球莖(圖1)。1/2MS培養(yǎng)基中，種子發(fā)育進(jìn)程明顯慢于1/2 B5和1/2 N6培養(yǎng)基，但培養(yǎng)40 d也可形成原球莖。1/2花寶1號(hào)培養(yǎng)基和1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基，部分種子不能正常萌發(fā)，而發(fā)育形成的原球莖顏色普遍呈黃白色，出現(xiàn)原球莖畸形的情況。

測(cè)量原球莖直徑，1/2B5、1/2N6、1/2MS、1/2花寶1號(hào)和1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基，種子發(fā)育形成原球莖的直徑依次是438.56、577.89、401.03、348.58和336.56 μm，1/2N6培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖直徑最大，而1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基的原球莖直徑最小。方差分析結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基的原球莖直徑差異極顯著(P= 0.00 < 0.01)，1/2N6培養(yǎng)基的原球莖直徑顯著大于1/2MS、1/2花寶1號(hào)、1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基。

分析不同培養(yǎng)基原球莖直徑分布情況，結(jié)果表明，1/2B5培養(yǎng)基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為91.24 %(圖2)；1/2N6培養(yǎng)基中，原球莖直徑主要在400～800 μm，所占比例為81.30 %(圖3)；1/2MS培養(yǎng)基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為95.90 %(圖4)；1/2花寶1號(hào)培養(yǎng)基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為99.20 %(圖5)；1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基中，原球莖直徑主要在200～600 μm，所占比例為98.84 %(圖6)。

2.2 離體植株的形態(tài)特征

將1/2B5、1/2N6、1/2MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d產(chǎn)生的原球莖，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上(圖7-1)。培養(yǎng)90 d，原球莖發(fā)育形成離體植株(圖7-2)。依據(jù)形態(tài)特征可分為3種類(lèi)型：發(fā)育形成1～3片葉片和1～3個(gè)根，具單芽的正常植株(圖7-3)；具2個(gè)以上芽的多芽植株(圖7-4、圖7-5、圖7-6)；原球莖愈傷組織化，未形成植株(圖7-7、圖7-8)。統(tǒng)計(jì)不同形態(tài)類(lèi)型的比例，結(jié)果表明，來(lái)自1/2N6培養(yǎng)基的原球莖，發(fā)育形成正常單芽植株比例較高，1/2B5培養(yǎng)基的原球莖發(fā)育形成多芽植株比例較高，1/2MS培養(yǎng)基的愈傷組織比例較高；直徑大于30目的原球莖發(fā)育形成正常單芽植株比例普遍高于40目的原球莖，相應(yīng)地多芽植株、愈傷組織比例較低(表1)。

圖1 液體靜置培養(yǎng)獲得的原球莖Fig.1 Protocorms derived from static liquid culture

圖2 1/2 B5培養(yǎng)基的原球莖直徑分布情況Fig.2 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2B5 medium

圖3 1/2 N6培養(yǎng)基的原球莖直徑分布情況Fig.3 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2N6 medium

圖4 1/2 MS培養(yǎng)基的原球莖直徑分布情況Fig.4 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2MS medium

圖5 1/2花寶1號(hào)培養(yǎng)基的原球莖直徑分布情況Fig.5 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.1 medium

圖6 1/2花寶2號(hào)培養(yǎng)基的原球莖直徑分布情況Fig.6 Diameter distribution of protocorms cultured in 1/2Hyponex No.2 medium

方差分析結(jié)果表明，液體基本培養(yǎng)基對(duì)正常的單芽植株比例影響不顯著(P= 0.35 >P0.05)，而原球莖大小對(duì)單芽植株比例有極顯著影響(P=0.00

1: 轉(zhuǎn)接在固體培養(yǎng)基上的原球莖；2: 原球莖發(fā)育形成離體植株；3: 單芽植株；4～6: 多芽植株； 7～8: 愈傷組織.1: Protocorms on solid medium; 2: Plantlets deriving from protocorms; 3: Single bud; 4-6: Multiple bud; 7-8: Callus deriving from protocorm圖7 原球莖離體培養(yǎng)形成的植株形態(tài)特征Fig.7 Morphology of plantlets derived from protocorms in vitro

3 討 論

植物細(xì)胞或組織液體培養(yǎng)一般采用振蕩培養(yǎng)的方式[9-11]。液體振蕩培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖重量極顯著高于固體培養(yǎng)[12]。采用液體靜置培養(yǎng)方式，鐵皮石斛種子能萌發(fā)形成原球莖，且轉(zhuǎn)接在固體培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)發(fā)育為離體植株。液體靜置培養(yǎng)簡(jiǎn)化了石斛液體培養(yǎng)條件，有望加快液體培養(yǎng)在石斛人工繁育生產(chǎn)中的應(yīng)用。

表1 原球莖發(fā)育形成的植株類(lèi)型Table 1 Mythological types of plantlets derived from protocorms

4 結(jié) 論

鐵皮石斛種子液體靜置培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基是影響原球莖發(fā)育的重要因素，1/2N6是較適宜的培養(yǎng)基；來(lái)自不同液體培養(yǎng)基的原球莖及其大小顯著影響離體植株的生長(zhǎng)，大于30目的原球莖發(fā)育形成正常單芽植株比例較高。