路玲，方藝達，李莉，徐艷群,2，羅自生,2,3,4,5*

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州310058；2.浙江大學寧波研究院，浙江 寧波315100；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點實驗室，杭州310058；4.智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，杭州310058；5.浙江大學馥莉食品研究院，杭州310058）

西蘭花（Brassica oleracea L.var.botrytis L.），又稱青花菜，營養(yǎng)成分豐富，富含維生素C和蛋白質(zhì)以及多酚、黃酮類等抗氧化活性物質(zhì)，被譽為“蔬菜皇冠”。西蘭花中的硫代葡萄糖苷、蘿卜硫素等活性物質(zhì)具有預防癌癥、降血脂和增強免疫力的功效[1-2]。西蘭花屬于呼吸躍變型果實，采后西蘭花在常溫下呼吸作用旺盛，易發(fā)生組織褐變、病原菌及附生微生物生長繁殖，引發(fā)霜霉病、黑腐病、軟腐病、灰腐病等[3]。這些病變造成西蘭花褪綠黃化、營養(yǎng)成分流失，降低其食用及商業(yè)價值[4]，導致西蘭花貨架期縮短。因此，如何延長采后西蘭花貨架期成為國內(nèi)外的研究熱點。

目前，國內(nèi)外鮮切西蘭花保鮮技術(shù)主要有氣調(diào)包裝、微波處理、乙醇處理、短波紫外線（UV-C）處理、殺菌劑處理和涂膜等，其中涂膜保鮮由于操作簡單、安全性較高，受到越來越多的關(guān)注。林本芳等[5]的研究表明，冷藏結(jié)合1 200 mg/L 納他霉素處理對西蘭花的成熟衰老有較好的抑制作用。肉桂精油因含有肉桂醛可起到抗菌、抗氧化的作用。黃文部等[6]研究了肉桂、牛至、茴香3種精油對鮮切西蘭花貯藏品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，肉桂精油對鮮切西蘭花的保鮮效果最好。王磊明等[7]研究表明，1.2%的殼聚糖和肉桂精油復合制成的保鮮涂膜對藍莓保鮮效果顯著。而蕓苔素內(nèi)酯不僅是一種無毒無害的天然植物激素，適當濃度的外源蕓苔素內(nèi)酯處理還能有效緩解生物、非生物脅迫對植物造成的氧化損傷，延長果蔬貨架期。喬永祥等[8]研究了5、15 μmol/L 24-油菜素內(nèi)酯對鮮切生菜褐變的影響，結(jié)果表明，蕓苔素內(nèi)酯可有效抑制鮮切生菜的褐變。但在常溫條件下，肉桂精油易揮發(fā)，蕓苔素內(nèi)酯在中性環(huán)境中也易水解[9]，保鮮效果有限；因此，本研究以新鮮西蘭花為試驗材料，使用包埋有肉桂精油和蕓苔素內(nèi)酯的水包油包水（water/oil/water,W/O/W）雙重保鮮乳液對采后西蘭花進行涂膜保鮮。W/O/W型乳液保鮮劑由內(nèi)水相、油相和外水相3部分組成，其中：內(nèi)水相中包埋有植物激素蕓苔素內(nèi)酯、明膠、氯化鈉和抗壞血酸，油相中包含橄欖油和肉桂精油，外水相中包含乳清蛋白和果膠。W/O/W雙重保鮮乳液具有獨特的“兩膜三相”的多隔室結(jié)構(gòu)[10]，可有效緩釋包埋在其中的抗菌物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑。本研究旨在為西蘭花的貯藏保鮮提供新的理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料為西蘭花，購自浙江省杭州市三墩鎮(zhèn)第三農(nóng)貿(mào)市場。

試驗試劑：肉桂精油（純度為100%），購自廣州高島化妝品有限公司；蕓苔素內(nèi)酯，購自合肥博美生物科技有限責任公司；乳清蛋白、果膠、橄欖油、氯化鈉、抗壞血酸、明膠、吐溫－80（聚山梨酯－80）等，購自上海國藥集團化學試劑有限公司；葉綠素酶試劑盒、脫鎂螯合酶試劑盒，購自齊一生物科技（上海）有限公司。

試驗儀器：恒溫培養(yǎng)箱，購自浙江省寧波塞福實驗儀器有限公司；恒溫水浴鍋，購自上海亞榮生化儀器廠；METTLER TOLEDO XS105 分析天平，購自瑞士Mettler Toledo 公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機，購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；MULTISKAN MK3 型酶標儀，購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；1100系列高效液相色譜儀（配光電二極管陣列檢測器），購自美國安捷倫公司；超聲波細胞粉碎機，購自浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司；美能達CR-400 色差儀，購自日本KONICA 公司；DDS-320 電導率儀（山東省青島明博環(huán)?？萍加邢薰荆?。

1.2 試驗方法

1.2.1 W/O/W 雙重保鮮乳液的配制

取20 mg 蕓苔素內(nèi)酯，溶于一定量乙醇中并定容到100 mL，配制成200 mg/L 的蕓苔素內(nèi)酯母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。取20 mL 蕓苔素內(nèi)酯母液，稀釋至50 mL，加入0.5 g 明膠、50 mg NaCl、5 mg抗壞血酸，加熱溶解，為一水相；在30 mL橄欖油（油相）中加入0.5 g疏水性表面活性劑，并加入精油，混合后加熱，用磁力攪拌器攪拌15 min；通過水相分散到油相中制備水包油（water/oil,W/O）乳狀液，初始的W/O乳液使用磁力攪拌器攪拌2 min，然后超聲4 min（工作時間3 s，休息時間3 s）。制備的W/O乳狀液在4 ℃冰箱中保存30 min；取10 mL W/O乳液在室溫（25±2）℃條件下添加到30 mL 二水相[由4%的乳清蛋白+阿拉伯膠（質(zhì)量比為1∶3、1∶1、3∶1）或乳清蛋白+果膠（質(zhì)量比為1∶3、1∶1、3∶1）組成]中，并加入0.3 g親水性表面活性劑、3 mg抗壞血酸和30 mg NaCl，使用磁力攪拌器攪拌，10 min后超聲2 min（工作時間3 s，休息時間3 s），即得到W/O/W雙重保鮮乳液。

1.2.2 肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液的配制

肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液是由肉桂精油、表面活性劑吐溫－80及蕓苔素內(nèi)酯混合而成的乳濁液，各物質(zhì)的質(zhì)量濃度與W/O/W型乳液保鮮劑一致。

1.2.3 樣品前處理

挑選無病蟲害，成熟度、大小基本一致的西蘭花作為試驗材料，使用鋒利、潔凈的不銹鋼刀切割，切分成直徑為3～4 cm 的花蕾簇，以不易引起植株損傷。隨機選取鮮切西蘭花樣本，備用。試驗設(shè)置對照組（以清水為保鮮劑）、雙重乳液組（以制備的W/O/W復合乳液為保鮮劑）和乳液組（以肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液為保鮮劑）。分別用不同處理組的保鮮劑浸泡西蘭花樣本10 s 后撈出，自然風干；以5～6個西蘭花的花蕾簇為一組分裝入自封袋（正反面各扎10 個孔）中，每組10 袋，共3 組，排列于塑料托盤中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中貯藏。

1.2.4 品質(zhì)指標測定

通過美能達CR-400 色差儀測量明度（L*）和黃藍（b*）值。每組選取3 個西蘭花花簇，在每個花簇上隨機選擇10個不同的區(qū)域進行測量。

相對電導率的測定采用浸泡法，使用DDS-320電導率儀。

丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量測定：稱取1 g 西蘭花樣品，加5 mL 100 g/L 三氯乙酸研磨，勻漿后，于4 ℃、1.2×104g 條件下離心10 min，收集上清液，低溫保存，備用。取2 mL上清液（對照空白管中加入2 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮沸20 min，冷卻后再次離心，上清液分別在450、532和600 nm處測定吸光度值，重復3次。

葉綠素含量測定：將來自每個托盤的5 g 冷凍樣品在液氮中研磨，在黑暗中加入10 mL 80%冷卻丙酮，提取30 min。于4 ℃、1.2×104g 條件下離心10 min，收集上清液；重復該過程直至殘余物變白。最后，使用80%丙酮將體積補足至25 mL，并通過酶標儀測量在663 和645 nm 處的吸光度值。總?cè)~綠素含量=20.29 D663nm+8.05 D645nm。

總酚、總黃酮含量測定：稱取2.0 g西蘭花，加入少許預冷的1%鹽酸-甲醇溶液，在冰浴條件下研磨勻漿后，轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中。用1%鹽酸-甲醇溶液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)移到試管中，定容至刻度，混勻。于4 ℃冰箱中避光提取20 min，其間搖動數(shù)次，收集濾液，待用。以1%鹽酸-甲醇溶液做空白參比調(diào)零，取濾液，分別于波長280、325、600和530 nm處測定其吸光度值，重復3次。以每克新鮮果蔬組織在波長280 nm 處的吸光度值表示總酚含量。在波長325 nm處的吸光度值表示總黃酮物質(zhì)含量。用不同濃度的沒食子酸制作標準曲線，計算總酚物質(zhì)含量。用不同濃度的蘆丁制作標準曲線，計算總黃酮含量。

菌落總數(shù)計算參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[11]；維生素C含量測定參照文獻[12]，稍做修改。

硫代葡萄糖苷含量測定采用分光光度法。繪制葡萄糖標準溶液。稱取2 份西蘭花各0.5 g，分別置于2 支25 mL 刻度試管中，各加0.1 g 氟化鈉。其中一支試管中加入沸水20 mL，立即加熱至沸騰并保持10 min。另一支試管中加入37 ℃蒸餾水20 mL，置于37 ℃水浴中保溫酶解1 h，完成水解后加熱至沸騰并保持10 min。在2 支試管中分別加入6滴中性醋酸鉛，以沉淀其中的蛋白質(zhì)和色素類物質(zhì)；加入適量硫酸鈉溶液消除過量的醋酸鉛；最后加入蒸餾水定容至25 mL，用濾紙過濾，得濾液于試管中。各取0.5 mL 濾液，向其中加入0.5 mL 蒸餾水，3 mL 3，5-二硝基水楊酸溶液，混勻，于沸水浴中保溫10 min后取出，冷卻至室溫后定容至10 mL，于530 nm處測吸光度值。計算公式為：

式中：m1為滅酶管從標準曲線上查得的相應葡萄糖量，mg；m2為酶解管從標準曲線上查得的相應葡萄糖量，mg；m 為樣品質(zhì)量，g；2.207 是硫代葡萄糖轉(zhuǎn)化為硫代葡萄糖苷的系數(shù)；436.5是硫代葡萄糖苷相對分子質(zhì)量，g/mol。

葉綠素酶、脫鎂螯合酶活性根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3 次。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中基本品質(zhì)指標變化的影響

L*、b*分別表示西蘭花的明度和黃藍色調(diào)，L*值越大表明西蘭花越傾向于白色，b*值越大表明西蘭花表面黃色沉積越為明顯。如圖1A～B所示，不同保鮮劑處理的西蘭花L*、b*值均隨著貯藏時間的延長呈逐漸上升的趨勢。其中：W/O/W雙重乳液涂膜處理顯著延緩了西蘭花L*值的升高，貯藏期間L*值僅為39.58～48.12，而對照組和肉桂精油/蕓苔素乳液組則分別高達52.55 和57.64。W/O/W 雙重乳液涂膜處理的西蘭花b*值升高最慢，說明雙重乳液顯著延緩了西蘭花在貯藏過程中的黃化；肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液涂膜處理的西蘭花在前4 d也顯著延緩了西蘭花的黃化，但精油和蕓苔素內(nèi)酯隨時間而揮發(fā)，無法保持長時間的保鮮作用，因此，在貯藏的最后2 d，西蘭花b*值迅速升高。上述試驗結(jié)果表明，W/O/W 雙重乳液可以很好地發(fā)揮緩釋作用，延長涂膜的有效保鮮時間。

相對電導率和丙二醛（MDA）都可以反映細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。從圖1C 可以看出：經(jīng)W/O/W 雙重乳液處理的西蘭花樣品的相對電導率低于對照組和乳液組；貯藏第5天時，對照組、雙重乳液組、乳液組的相對電導率分別為14.84%、12.77%、14.35%，說明W/O/W 雙重保鮮乳液可以減輕西蘭花在貯藏過程中細胞膜的損傷程度。由圖1D 可見：MDA 含量為4～14 μmol/mL，各處理組西蘭花MDA含量均逐漸上升，表明隨貯藏時間延長西蘭花成熟并逐漸腐爛[13]。W/O/W雙重乳液處理能夠延緩MDA含量的上升，與對照組差異顯著（P＜0.05），表明其能夠延緩西蘭花的腐爛。

圖1 在25 ℃貯藏過程中西蘭花L*、b*、相對電導率和MDA含量的變化情況Fig.1 Changes of L*,b*,relative electronic conductivity and MDA content of broccoli during storage at 25 ℃

2.2 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中葉綠素及其相關(guān)酶活性變化的影響

葉綠素含量高低可反映西蘭花的新鮮程度。由圖2可知：貯藏期內(nèi)W/O/W雙重乳液組葉綠素含量下降最少；第5天時，葉綠素含量、葉綠素酶活性、脫鎂螯合酶活性均為W/O/W雙重保鮮乳液處理組＞肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯處理組＞對照組，且W/O/W雙重保鮮乳液處理組與其他2 組間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中抗氧化活性變化的影響

總酚、總黃酮是西蘭花中重要的抗氧化物質(zhì)，是判斷西蘭花品質(zhì)的重要指標。由圖3 可知，西蘭花在貯藏過程中總酚、總黃酮含量及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除率呈下降趨勢。對于酚類物質(zhì)，從第2 天開始肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液處理組和對照組西蘭花的總酚含量迅速下降，而W/O/W 雙重保鮮乳液處理組總酚含量下降較為緩慢；對于總黃酮而言，W/O/W 雙重保鮮乳液處理可以顯著延緩其含量的下降（P＜0.05）；對于抗氧化活性，用DPPH 自由基清除率來表示，西蘭花在貯藏過程中DPPH 自由基清除率呈下降趨勢，從貯藏第2 天開始W/O/W 雙重保鮮乳液處理組的下降趨勢顯著減緩（P＜0.05）。

2.4 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中菌落總數(shù)變化的影響

菌落總數(shù)表示貯藏過程中微生物生長繁殖情況，直接反映了果蔬的品質(zhì)，是評價果實質(zhì)量優(yōu)劣的一項重要指標。本研究中，W/O/W 雙重保鮮乳液所包埋的肉桂精油中含有的肉桂醛可以抑制或殺死生長在西蘭花中的微生物[14]。從圖4 中可以看出，W/O/W 雙重保鮮乳液處理的西蘭花菌落總數(shù)顯著低于其他2 個處理組（P＜0.05）。表明雙重乳液的緩釋效果能夠有效抑制西蘭花中微生物的生長。裴志勝等[15]利用羅望子膠與阿拉伯膠包埋高良姜精油制備微膠囊，以用于金鯧魚魚糜的保鮮，結(jié)果有效降低了菌落總數(shù)；本研究結(jié)果與此一致。

2.5 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中維生素C 含量變化的影響

維生素C是西蘭花中重要的營養(yǎng)成分。圖5表明，W/O/W 雙重保鮮乳液和肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液均可以在一定程度上延緩西蘭花中維生素C含量的降低，對其起到保護作用。這可能是由于肉桂精油中的肉桂醛具有還原性，可以在一定程度上防止維生素C被氧化，其中W/O/W雙重保鮮乳液效果較好，該結(jié)果與殼聚糖精油復合涂膜對鮮切山藥的保鮮效果類似[16]。

2.6 W/O/W 雙重保鮮乳液對西蘭花在貯藏中硫代葡萄糖苷含量變化的影響

圖2 在25 ℃貯藏過程中西蘭花葉綠素含量、葉綠素酶和脫鎂螯合酶活性的變化Fig.2 Changes of chlorophyll content,chlorophyllase and MDCase activities of broccoli during storage at 25 ℃

圖3 在25 ℃貯藏過程中西蘭花總酚、總黃酮含量及DPPH自由基清除活性的變化Fig.3 Changes of total phenol,total flavonoid contents and DPPH radical scavenging rate of broccoli during storage at 25 ℃

圖4 在25 ℃貯藏過程中西蘭花菌落總數(shù)的變化Fig.4 Changes of total colony counts of broccoli during storage at 25 ℃

硫代葡萄糖苷是一種具有抗腫瘤功效的植物化學物質(zhì)，其含量的減少意味著西蘭花品質(zhì)的降低。從圖6 中可以看出：貯藏初期西蘭花中硫代葡萄糖苷含量為21.29 μmol/g，貯藏過程中樣品的硫代葡萄糖苷含量持續(xù)下降；從第2 天開始，W/O/W 雙重保鮮乳液組可顯著減緩其下降速度（P＜0.05）；到貯藏第5天時，對照組和肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液組樣品的硫代葡萄糖苷已下降至1.68 μmol/g，而W/O/W雙重乳液組含量為3.14 μmol/g。

圖5 在25 ℃貯藏過程中西蘭花維生素C含量的變化Fig.5 Changes of vitamin C content of broccoli during storage at 25 ℃

3 討論與結(jié)論

西蘭花所含營養(yǎng)成分豐富，但貨架期短，易褐變發(fā)霉，降低食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值。常規(guī)的涂膜保鮮一般是將乙醇、殺菌劑等稀釋后直接涂布在西蘭花表面，但由于一些有效物質(zhì)易揮發(fā)或在常溫下不穩(wěn)定，導致涂膜物質(zhì)揮發(fā)，保鮮效果的維持時間較短。本研究以西蘭花為試驗對象，探究雙重乳液包埋肉桂精油和蕓苔素內(nèi)酯對西蘭花貯藏過程中質(zhì)量品質(zhì)變化的影響，并且闡明可能的作用機制。

圖6 在25 ℃貯藏過程中西蘭花硫代葡萄糖苷含量的變化Fig.6 Changes of glucosinolate content of broccoli during storage at 25 ℃

研究結(jié)果顯示，W/O/W雙重保鮮乳液可以顯著延緩明度（L*）和黃藍（b*）值的上升，抑制西蘭花的黃化褐變。相對電導率大小可以反映西蘭花抗逆性和細胞膜受損傷程度[17]，細胞膜損傷會導致細胞內(nèi)電解質(zhì)流出從而提高電導率。相對電導率和丙二醛是反映西蘭花細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的重要指標，而膜結(jié)構(gòu)的破壞也會引發(fā)酶促褐變。相比于對照組和肉桂精油/蕓苔素內(nèi)酯乳液組，W/O/W 雙重保鮮乳液可以抑制相對電導率、丙二醛含量的上升，維持西蘭花細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，減少其損傷和氧化，也延緩了褐變的發(fā)生。

葉綠素降解導致西蘭花花球褪綠變黃，是植物衰老的明顯標志[18-19]。葉綠素酶和脫鎂螯合酶是參與葉綠素降解途徑的2 個關(guān)鍵酶。W/O/W 雙重保鮮乳液延緩了西蘭花中葉綠素含量和葉綠素酶、脫鎂螯合酶活力的降低?？梢?，W/O/W雙重保鮮乳液能更有效阻止葉綠素的分解，延緩葉綠素酶和脫鎂螯合酶活性的降低，保鮮效果最好。

西蘭花是具有高抗氧化活性的蔬菜，其酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)含量豐富。酚類物質(zhì)是植物次級代謝的產(chǎn)物，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌等生理活性[20-21]。W/O/W 雙重保鮮乳液能夠顯著減緩西蘭花酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量的下降，從而維持較高的抗氧化活性。維生素C 具有抗氧化、抗衰老的作用，在西蘭花中含量較高。硫代葡萄糖苷可以通過人結(jié)腸微生物群中的內(nèi)源性黑芥子酶或硫代葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化為高效生物活性物質(zhì)蘿卜硫素[22]。研究結(jié)果顯示，W/O/W 雙重保鮮乳液可以延緩總酚、總黃酮、維生素C、硫代葡萄糖苷和DPPH 自由基清除率的降低，保持西蘭花的抗氧化活性和營養(yǎng)價值。WU 等[23]研究了羧甲基殼聚糖涂層和蕓苔素內(nèi)酯對在41 ℃和90%～95%相對濕度下儲存24 d的綠蘆筍的感官品質(zhì)和理化特性的綜合影響，結(jié)果表明，其可以在貯藏期間維持較高的總酚、維生素C 含量和DPPH 自由基清除活性。此外，W/O/W 雙重保鮮乳液還可以減少微生物的生長繁殖，保持西蘭花品質(zhì)。雙重乳液的“兩隔三室”結(jié)構(gòu)可以有效緩釋包埋在其中的肉桂精油和蕓苔素內(nèi)酯，使其在整個貯藏過程中均勻釋放，發(fā)揮長效保鮮作用。

綜上所述，W/O/W雙重保鮮乳液能夠較好地維持西蘭花的品質(zhì)，延長其貨架期，適用于西蘭花的貯藏保鮮。