王鳳麗，裘紀(jì)瑩，戴美學(xué)，陳蕾蕾，趙雙枝，辛雪，周慶新*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟南250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，濟南250100）

甜櫻桃是薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）櫻屬（Cerasus）植物，其果實外觀紅亮剔透，皮軟多汁，營養(yǎng)豐富，具有抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等功效，被譽為“生命之果”[1-2]。甜櫻桃起源于歐洲和西亞，自19世紀(jì)70年代傳入我國，最早在山東煙臺種植，緊接著在遼寧、河北、天津、北京擴展種植，20世紀(jì)80年代后甜櫻桃在我國的種植面積逐漸成倍增加，到2017年其種植面積已達20萬hm2，產(chǎn)量約為110萬t，居世界第一[3-5]。甜櫻桃品種繁多，在我國種植的甜櫻桃品種主要包括紅燈（Hongdeng）、美早（Tieton）、紅蜜（Hongmi）、先鋒（Van）、薩米脫（Summit）、布魯克斯（Brooks）等50多個品種，以及通過雜交選育和后代選育的早熟或中晚熟新品種[6-7]。在甜櫻桃種植過程中，病害是影響產(chǎn)量和品質(zhì)的主要原因，包括非侵染性病害和侵染性病害。非侵染性病害主要由凍害及缺素所致；侵染性病害主要包括病毒性病害，穿孔病、根癌病等細菌性病害，根腐病、褐腐病、青霉病、灰霉病等真菌性病害。其中，真菌性病害是主要的侵染性病害[8-10]。在種植期早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)并結(jié)合一定的農(nóng)業(yè)防治和藥劑防治措施，會大大減少櫻桃病害的發(fā)生。盡管有了種植期的防治和保護措施，但仍有不少病原菌不可避免被帶入采后儲運環(huán)節(jié)，櫻桃采后的病害問題也越來越受到研究者們的重視。由于甜櫻桃的收獲季節(jié)環(huán)境溫度偏高、空氣濕度較大，其采后腐敗和損失問題愈加嚴重。由微生物侵染引起的侵染性真菌病害是甜櫻桃采后儲運過程中腐爛衰敗的重要原因之一，往往在田園中就已覆蓋果實表面，在櫻桃采摘、運輸、銷售過程中伺機侵染，隨著時間推移進一步侵染到周圍健康果實，造成嚴重的腐爛現(xiàn)象。已報道的侵染甜櫻桃的病原真菌有鏈格孢菌屬、葡萄孢屬、青霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬等。王楚等[11]從山西地區(qū)低溫貯藏的甜櫻桃中分離出草酸青霉（Penicillium oxalicum）和葡萄孢屬（Botrytis sp.）真菌。田亞晨等[12]從山東煙臺地區(qū)的采后腐爛櫻桃中分離出燕麥赤霉菌（Gibberella avenacea）、總狀毛霉菌（Mucor racemosus）、三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）、互生鏈格孢菌（Alternaria alternata）、奧桑青霉菌（Penicillium polonicum）和煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）等6種真菌。趙遠征等[13]對遼寧省大連市大櫻桃黑斑病進行了病原菌鑒定，確定其病原菌為互生鏈格孢（Alternaria alternata），該屬病原菌可以直接侵染或通過自然孔口和傷口侵染櫻桃果實和葉，其中，果實發(fā)病尤為嚴重，在個別地區(qū)可達75%以上。

近年來，針對甜櫻桃采后保鮮技術(shù)的相關(guān)研究也不斷增多[4,9,14-17]，但基于儲運過程中病原菌的分離鑒定及其特性研究相對較少。本研究針對山東省濟南市某櫻桃種植專業(yè)合作社生產(chǎn)的甜櫻桃，在采后儲運、低溫貯藏過程中發(fā)生的病原菌進行分離鑒定，通過研究溫度、pH 值等環(huán)境因子對其生長特性的影響和致病力分析，篩選出1 株貯藏期易發(fā)生的耐低溫、致病力強的互生鏈格孢NCPS1，為甜櫻桃采后低溫儲運及防腐保鮮技術(shù)研發(fā)等提供了重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試甜櫻桃：品種為‘紅燈’，購自山東省濟南市長清區(qū)，從產(chǎn)地快速運輸?shù)綄嶒炇遥x擇顏色和大小均勻、無機械損傷的九成熟櫻桃果實預(yù)冷24 h后，放入1 ℃冷庫中貯藏，貯藏期間挑出腐爛櫻桃和裂果并進行病原菌分離。

試驗儀器：LRH-150-MS 霉菌培養(yǎng)箱（廣東省韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；ZHWY-200H恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-2D 雙人凈化工作臺（江蘇省蘇州凈化設(shè)備有限公司）；AH-2 OLYMPUS 電子顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化

選取裂果或腐爛櫻桃，采用組織分離法[18]和劃線培養(yǎng)法分離病原菌。用75%的乙醇擦拭櫻桃果實表面進行消毒，風(fēng)干后取病害組織與健康組織交界處約2 mm×2 mm大小果皮，在0.05%次氯酸鈣溶液中浸泡10 min，用無菌濾紙浸干，將其接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基上，每個病癥3 皿，于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，2 d后取菌絲邊緣轉(zhuǎn)接，直至分離出純培養(yǎng)物。對于腐爛成團的病害櫻桃果實，直接采用劃線培養(yǎng)法進行分離純化。純培養(yǎng)物斜面（NCPS1～NCPS6）于4 ℃冰箱中保藏，備用。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

從菌落邊緣取菌塊分別接種到PDA 和麥芽汁瓊脂（malt extract agar,MEA）培養(yǎng)基上，觀察菌落生長形態(tài)。分別取在PDA平皿上培養(yǎng)7 d的病原菌菌絲和孢子，在電子顯微鏡下進行觀察，記錄顯微形態(tài)，進行鑒定[19]。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

取病原菌菌塊轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基上，于120 r/min、28 ℃搖床上培養(yǎng)3 d，挑取部分菌絲塊送至江蘇金唯智測序中心，測定其基因間隔區(qū)ITS1/ITS4序列，并進行分子生物學(xué)分類鑒定。

1.2.4 病原菌的進化樹構(gòu)建

將病原菌序列與GenBank 中的已知序列進行同源性比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定病原菌種類。

1.2.5 病原菌的生物學(xué)特征檢測

生長速率：以7 d 內(nèi)在PDA 培養(yǎng)基上菌落直徑大小表示。于PDA平皿中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，28 ℃培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法[20]測量菌落直徑，每個處理設(shè)置3個平行實驗。

培養(yǎng)溫度：于PDA 平皿中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，分別置于0、2、4、6、8、15、20、25、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每個處理設(shè)置3個平行實驗。

培養(yǎng)pH：于PDA平皿中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，PDA 培養(yǎng)基的pH 值設(shè)定為2、4、6、8、10，每個處理設(shè)置3個平行實驗。

1.2.6 病原菌的致病力分析

參照文獻[21-22]的方法：將健康的櫻桃果實用75%乙醇擦拭消毒，并用無菌水清洗后，自然風(fēng)干。在櫻桃果實赤道中央打取深3 mm、直徑3 mm的小孔。取直徑3 mm 左右的病原菌菌餅，接種到櫻桃孔口處，將接種的櫻桃放入保鮮盒中，28 ℃培養(yǎng)3 d 后觀察發(fā)病情況。每個處理20 個果實，試驗重復(fù)3 次。病斑測量采用十字交叉法，病斑直徑/mm=測量直徑/mm－3 mm。

致病力分級標(biāo)準(zhǔn)參考吳建圓等的方法[23]：強致病力，病情指數(shù)≥60.0；中等致病力，30.0≤病情指數(shù)＜60.0；弱致病力，病情指數(shù)＜30.0。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件進行相關(guān)性分析，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃采后病原菌的分離純化及菌落形態(tài)

從采后腐爛櫻桃中分離到6 株病原真菌（NCPS1～NCPS6），28 ℃條件下分別在PDA 和MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落形態(tài)如圖1所示。3～7 d后，6 株病原菌在2 種培養(yǎng)基上生長旺盛，其中NCPS1、NCPS3 在PDA 培養(yǎng)基上菌落平展，呈棉絮狀，生長速度快，背面灰褐色，菌絲體埋生或表生（圖1A1、A3），在MEA 培養(yǎng)基上菌落呈均勻白色（圖1B1、B3）；NCPS2在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰白色（圖1A2），在MEA 培養(yǎng)基上菌落呈白色（圖1B2）；NCPS4在PDA培養(yǎng)基上菌落為黃綠色，有白色邊緣（圖1A4），在MEA 培養(yǎng)基上菌落為淺橘黃色，有白色邊緣（圖1B4）；NCPS5在PDA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基上菌落為橄欖綠色，絨毛狀，平鋪（圖1A5、B5）；NCPS6在PDA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基上菌落為灰白色，散生，絨毛狀，菌絲體部分表生，有明顯菌絲束（圖1A6、B6）。

2.2 甜櫻桃采后病原菌的顯微形態(tài)

圖1 病原菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of pathogens

采用電子顯微鏡觀察6株分離病原真菌的顯微形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。NCPS1、NCPS2的菌絲呈淡褐色，表面光滑，有隔膜，菌絲寬2～4 μm（圖2A1～A2）。NCPS1分生孢子梗端生或側(cè)生，圓柱形，2～7個隔膜，直或彎曲（圖2B1）；NCPS2分生孢子單生或鏈生，倒棒形，褐色，光滑，3～7個橫隔膜，1～4個縱隔膜，1～2 個斜隔膜，孢身（12～42）μm×（7～13）μm，具短喙，生于分生孢子的端部，喙及假喙（5～16）μm×（3～4）μm（圖2B2）。NCPS3的分生孢子梗與NCPS1、NCPS2 無明顯區(qū)別，但是孢子稍大，（20～55）μm×（10～23）μm（圖2A3、B3）。NCPS4 菌絲無色，光滑，有隔膜，直徑2～3 μm，分生孢子梗直立，光滑，頂端具二輪、對稱帚狀分枝，梗上著生分生孢子鏈（圖2A4）；分生孢子為橢圓形或卵形，單胞，光滑，多為無色，直徑3～3.5 μm（圖2B4）。NCPS5菌絲無色，光滑，直徑4～9 μm（圖2A5）；分生孢子梗多側(cè)生于菌絲，偶分枝，分隔處不縊縮，直立，平滑或細疣，褐色或橄欖褐色，具孢痕，（90～300）μm×（3～8）μm，分生孢子頂生或側(cè)生，淡褐色，具分支的孢子鏈，卵形至圓筒形，平滑，1～3 個隔膜，（10～18）μm×（5～8）μm（圖2B5）。NCPS 6 菌絲無色，光滑，具隔膜，直徑1～2 μm（圖2A6）；產(chǎn)孢瓶體單生，不分枝，光滑，無色或淡褐色，（10～30）μm×（0.5～2）μm，瓶生孢子圓柱形，成鏈，光滑，無色透明，（4～7）μm×（1～2）μm（圖2B6），厚垣孢子與有性態(tài)孢子未觀察到。

2.3 櫻桃采后病原菌的基因間隔區(qū)（internal transcript space,ITS）序列分析

2.3.1 ITS 序列擴增結(jié)果

6株病原真菌通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)進行ITS序列擴增，其瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示。PCR條帶大小約550 bp，可用于后續(xù)的序列測定。

2.3.2 ITS 區(qū)rDNA 序列系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果

將6 株病原菌的ITS 序列測序結(jié)果在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行BLAST比對，篩選出與GenBank 中相似性高的序列，用MEGA 5.0軟件的最大簡約法（maximum parsimony,MP）構(gòu)建進化樹。結(jié)果如圖4所示，6株病原菌分別為互生鏈格孢（Alternaria alternata）NCPS1和NCPS2、鏈格孢（Alternaria sp.）NCPS3、擴展青霉（Penicillium expansum）NCPS4、禾 生 枝 孢（Cladosporium herbarum）NCPS5 和 土 棲 帚 枝 霉（Sarocladium terricola）NCPS6。其中鏈格孢屬有3 株，與田亞晨等[12]從煙臺地區(qū)采后甜櫻桃中分離到的病原菌含有較多的鏈格孢屬菌一致，而與姚婷等[24]報道的5 株采后櫻桃果實病原菌以及王楚等[11]報道的2株采后甜櫻桃腐爛病原菌沒有相同的菌株，說明甜櫻桃感染的病原菌具有一定的地區(qū)差異性。

圖2 病原菌的顯微形態(tài)Fig.2 Microstructure of pathogens

圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.3 PCR products detected by agarose gel electrophoresis

2.4 櫻桃采后病原菌的生物學(xué)特性

為深入了解環(huán)境因子對主要病原菌生長的影響，本研究從生長速率、生長溫度、最適生長pH值3個方面對6株病原真菌（NCPS1～NCPS6）在不同環(huán)境因子條件下生物學(xué)特性進行了分析。

菌絲生長速率以7 d內(nèi)在PDA培養(yǎng)基平板上的菌落直徑大小表示。6株病原菌在28 ℃培養(yǎng)7 d的生長速率如圖5A所示：NCPS3的生長速率最快，其次是NCPS2、NCPS1、NCPS4、NCPS5、NCPS6。pH值對病原菌生長的影響見圖5B：NCPS1～NCPS6菌株在pH 4～10 之間均可生長，最適生長pH 值為8，其中NCPS4 在pH 2 時仍可以較好地生長。培養(yǎng)溫度對病原菌生長的影響見圖5C：除NCPS4 的最適生長溫度為30 ℃外，其余5株菌的最適生長溫度均為25 ℃，當(dāng)培養(yǎng)溫度達到35 ℃時，僅NCPS1 和NCPS4 能生長；NCPS1 和NCPS2 在0～8 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長，相比其他菌株具有最強的耐寒性；NCPS3 在2～8 ℃溫度范圍可生長，具有較好的耐寒性；NCPS5在4～8 ℃溫度范圍可生長，而NCPS4和NCPS6 在0～8 ℃溫度范圍內(nèi)不能生長?？梢姡湼矜呔鷮倬闚CPS1 和NCPS2 具有較強的耐寒特性，在低溫貯藏環(huán)境中容易暴發(fā)病害。

圖4 以ITS rDNA基因序列為分子標(biāo)記的6株病原菌的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree for each fungal strain based on ITS rDNA sequence

2.5 病原菌致病力比較結(jié)果

將病原菌回接甜櫻桃3 d 后，可直觀地觀察到不同病原菌病斑直徑大小，通過對果實病斑直徑統(tǒng)計和病情指數(shù)計算，進而分析6 株病原菌的致病力差別。6株病原菌在櫻桃果實上的致病力結(jié)果如表1 和圖6 所示：NCPS1、NCPS2、NCPS3 為強致病力菌株，NCPS4、NCPS5為中等致病力菌株，NCPS6為弱致病力菌株。結(jié)合菌株生長速率（圖5）發(fā)現(xiàn)，致病力與生長速率呈明顯的正相關(guān)。這與關(guān)波等[25]從新疆石河子地區(qū)甜櫻桃上分離得到的3株菌的生長速率與致病力相關(guān)的結(jié)論一致。

3 討論與結(jié)論

本研究從采后甜櫻桃的儲運、低溫貯藏過程中分離出6株病原菌，綜合形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，分別將其鑒定為互生鏈格孢（Alternaria alternata）NCPS1和NCPS2、鏈格孢（Alternaria sp.）NCPS3、擴展青霉（Penicillium expansum）NCPS4、禾生枝孢（Cladosporium herbarum）NCPS5 和土棲帚枝 霉（Sarocladium terricola）NCPS6，其 中 禾 生 枝 孢NCPS5 和土棲帚枝霉NCPS6 在甜櫻桃上的病害尚未見報道，該菌生長速度較慢，致病力較弱。鏈格孢、擴展青霉[26]是已報道的引起甜櫻桃果實腐爛損害的病原菌，其中鏈格孢菌可引起甜櫻桃黑斑病，發(fā)病率高，危害非常嚴重[27]，這與本文中分離出的3株鏈格孢真菌較其他菌生長速率快，耐低溫，從而導(dǎo)致發(fā)病率高、致腐性強的結(jié)論一致。

甜櫻桃采后感染的病原菌大多源于從田間攜帶至儲運環(huán)節(jié)中，當(dāng)環(huán)境適于病原菌生長時，果實的腐爛迅速爆發(fā)。本研究報道的6株甜櫻桃采后病原菌中有3 株為鏈格孢屬菌，這與田亞晨等[12]從煙臺地區(qū)甜櫻桃采后分離到的病原菌中含有較多的互生鏈格孢菌的結(jié)果一致，而與姚婷等[24]和王楚等[11]報道的甜櫻桃采后腐爛病原菌沒有相同的菌株，說明不同甜櫻桃產(chǎn)地的果實致病菌具有一定的地區(qū)差異性，這可能與本地區(qū)的土壤環(huán)境及氣候有一定關(guān)系[25]。因此，在櫻桃主產(chǎn)區(qū)應(yīng)明確各自地區(qū)田間的主要致病菌，了解其發(fā)病規(guī)律，采收前采取相應(yīng)的預(yù)防措施，盡可能地減少帶菌儲運。此外，也不排除在不同的儲運環(huán)境中可能存在不同的易侵染甜櫻桃果實的致病菌。

不同種屬病原菌甚至同一種屬病原菌中不同菌株的生物學(xué)特性和致病力不完全相同。在本研究分離鑒定的6株病原菌中，互生鏈格孢NCPS1致病力最強，生長速率快，耐低溫脅迫，是甜櫻桃冷庫貯藏過程中需要重點防范的病原菌，除采取低溫措施之外，進入冷庫之前有必要采用國家規(guī)定范圍內(nèi)的可食性抑菌劑或其他措施對櫻桃進行預(yù)處理。綜上，本研究為采后甜櫻桃的冷庫貯藏及配套保鮮技術(shù)的研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

圖5 6株病原菌的生物學(xué)特性Fig.5 Biological characteristics of six pathogens

表1 甜櫻桃采后病原菌的致病力Table 1 Pathogenicity of pathogens on postharvest sweet cherry fruits

圖6 病原菌在甜櫻桃果實上的致病力分析Fig.6 Pathogenicity analysis of pathogens on sweet cherry fruits