李棟，占智豪，周心悅，李吟濤，李莉，林星宇，徐艷群,2，羅自生,2,3,4,5*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波315100；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；4.智能食品加工技術(shù)與裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，杭州310058）

蓮藕是一種在我國(guó)廣泛種植的重要水生蔬菜，富含類黃酮、核黃素、維生素C、硫胺素等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。近年來(lái)，鮮切蓮藕因其安全衛(wèi)生、食用方便、100%可食用等特點(diǎn)深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)份額逐年增加[2]。然而，由于鮮切過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械損傷，易誘發(fā)蓮藕表面發(fā)生酶促褐變，引起品質(zhì)的迅速下降，嚴(yán)重制約鮮切蓮藕的貨架期[3]。因此，尋求有效的抑制鮮切蓮藕采后褐變的處理手段成為一大新的研究熱點(diǎn)。目前，硫化氫（H2S）熏蒸[4]、二氧化氯（ClO2）處理[5]、魔芋葡甘聚糖涂膜[6]等被陸續(xù)報(bào)道能夠有效延緩鮮切蓮藕采后褐變進(jìn)程。然而，尋求更加安全高效、成本低廉、操作簡(jiǎn)便的采后處理方式仍十分迫切與需要。

高濃度二氧化碳（CO2）氣調(diào)作為一種安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的保鮮手段在果蔬采后領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。作為一種酸性氣體，高濃度CO2可降低微生物體內(nèi)的pH 值，抽提細(xì)胞膜中磷脂及疏水化合物組分，從而引起好氧細(xì)菌及絲狀真菌（俗稱“霉菌”）失活，減輕采后果蔬的腐爛[7]。同時(shí)，CO2能夠通過(guò)調(diào)節(jié)果蔬初級(jí)代謝及次級(jí)代謝，抑制果蔬采后色澤劣變，維持良好的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，提高多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，進(jìn)而維持采后品質(zhì)，提高果蔬貯藏性能[8-9]。此外，相關(guān)研究報(bào)道認(rèn)為，高濃度CO2還能夠抑制果蔬采后褐變，如：TIAN 等[10]研究表明，10%CO2結(jié)合5%氧氣（O2）氣調(diào)處理能夠降低采后櫻桃果實(shí)丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）及 過(guò) 氧 化 物 酶（peroxidase,POD）活性，有效延緩果皮褐變；朱銳等[11]利用100%CO2氣調(diào)保鮮鮮切茭白，發(fā)現(xiàn)在4 ℃貯藏期間100%CO2氣調(diào)組茭白菌落總數(shù)及褐變度顯著低于真空包裝組；而對(duì)于鮮切蓮藕，謝君等[12]報(bào)道表明，100%CO2氣調(diào)處理可以降低酚類物質(zhì)的積累，延緩酶促褐變的發(fā)生。然而，高濃度CO2調(diào)控酶促褐變的相關(guān)機(jī)制目前仍不明確。

能量代謝是植物體新陳代謝的重要環(huán)節(jié)，為其他初級(jí)及次級(jí)代謝提供能量基礎(chǔ)[13]。在采后，細(xì)胞能荷水平與果蔬成熟衰老進(jìn)程密切相關(guān)。能量虧缺容易引起細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，加速衰老進(jìn)程，引起品質(zhì)劣變[14]。大量研究表明，維持采后充足的能量供應(yīng)能夠有效減輕諸如冷害、黃化及采后腐敗等的發(fā)生[13-15]。然而，過(guò)度的能量代謝也會(huì)引起呼吸強(qiáng)度提高，呼吸基質(zhì)大量消耗，不利于果蔬采后品質(zhì)的維持，影響其貯藏特性[16]。此外，果蔬采后能量代謝也與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。線粒體呼吸鏈?zhǔn)腔钚匝醮兀╮eactive oxide species,ROS）產(chǎn)生的主要部位[17]。在呼吸鏈中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide reduced form,NADH）所呈遞的電子無(wú)法完全用于腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）合成，產(chǎn)生電子漏現(xiàn)象；漏出的電子進(jìn)一步產(chǎn)生ROS，引起細(xì)胞氧化水平上升[17]。因此，采后過(guò)高的呼吸強(qiáng)度及能量代謝水平容易造成ROS積累，引起細(xì)胞過(guò)氧化，進(jìn)而加速采后衰老進(jìn)程。同時(shí)，當(dāng)果蔬在采后遭受氧化脅迫時(shí)，呼吸代謝中的糖酵解-三羧酸循環(huán)途徑削弱，磷酸戊糖途徑增強(qiáng)[18]。盡管磷酸戊糖途徑產(chǎn)生能量的效率低于糖酵解-三羧酸循環(huán)途徑，但其產(chǎn)生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form,NADPH）能夠通過(guò)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)參與體內(nèi)ROS清除，以抵御氧化脅迫[18]。因而，維持采后合適的能荷水平對(duì)于延緩果蔬成熟衰老、提高果蔬貯藏性能具有重要意義。

本文利用20%CO2氣調(diào)貯藏鮮切蓮藕，以明確高濃度CO2氣調(diào)對(duì)采后酶促褐變的抑制效果。進(jìn)一步地，通過(guò)探究高濃度CO2氣調(diào)對(duì)能量代謝及吡啶核苷酸含量的影響，揭示高濃度CO2抑制酶促褐變的可能機(jī)制，為保鮮技術(shù)的優(yōu)化及實(shí)踐應(yīng)用提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試蓮藕購(gòu)于浙江省杭州市余杭區(qū)勾莊農(nóng)副產(chǎn)品物流中心，均為當(dāng)日新鮮采收。運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，挑選大小、色澤一致，無(wú)機(jī)械損傷的藕節(jié)，用清水洗去表面污泥后，去皮，切成厚度約為4 mm 的藕片，置于4 ℃冷庫(kù)預(yù)冷2 h，以消除新采蓮藕的“田間熱”，降低其呼吸強(qiáng)度及蒸騰速率，防止氣調(diào)箱內(nèi)水汽凝結(jié)。將預(yù)冷后的藕片隨機(jī)均分成2 組，每組120 片，分別放入已消毒的氣調(diào)箱中。第1 組（試驗(yàn)組）以30 mL/min 的速率持續(xù)通入組分為20%O2＋20%CO2＋60%N2的 預(yù) 混 氣 體，第2 組（對(duì)照組）以相同速率通入空氣。箱內(nèi)氣體組分利用氣體分析儀（MOCON Europe A/S，丹麥）進(jìn)行定時(shí)監(jiān)測(cè)。將上述樣品置于4 ℃環(huán)境下貯藏6 d，每2天進(jìn)行取樣，測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)，并利用液氮凍樣，以備后續(xù)試驗(yàn)。本試驗(yàn)進(jìn)行3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

1.2 色澤測(cè)定

利用色差儀（柯尼卡美能達(dá)CR-400，日本）測(cè)定藕片色澤。每組隨機(jī)挑選6 片藕片，每片藕片隨機(jī)選取3 個(gè)不同部位進(jìn)行測(cè)定。選取L*a*b*色度空間并記錄b*和L*值。其中：L*代表明度，L*值越大則藕片越亮，反之越暗；b*代表黃藍(lán)，b*值越大則藕片越黃，反之越藍(lán)。

1.3 褐變指數(shù)測(cè)定

參考SUN 等[4]的方法測(cè)定藕片褐變指數(shù)。取3.0 g 凍樣，加入30 mL 蒸餾水，冰浴研磨，于4 ℃、1×104g 條件下離心5 min。所得上清液在25 ℃水浴鍋內(nèi)孵育5 min后，在410 nm處測(cè)定其吸光度值。以D410nm×10表示樣品褐變指數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 MDA 含量測(cè)定

參考LI等[13]的方法測(cè)定MDA含量，略做修改。取2.0 g 凍樣，加入8 mL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，于4 ℃、1.2×104g 條件下離心10 min。取1 mL上清液，加入3 mL 35 mmol/L硫代巴比妥酸，沸水浴加熱15 min后迅速冷卻，于4 ℃、1.2×104g條件下離心10 min，分別在450、532和600 nm處測(cè)定上清液吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

式中：Vt為提取液體積，mL；Vr為反應(yīng)混合液體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)所用提取液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.5 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定

參考LI 等[13]的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。隨機(jī)選取5片藕片，用直徑10 mm打孔器取20片圓片。圓片經(jīng)去離子水漂洗后放入20 mL 去離子水中，于25 ℃條件下孵育30 min。利用電導(dǎo)儀測(cè)定溶液電導(dǎo)率（L1）。隨后，將溶液在沸水浴中加熱30 min，冷卻后再次測(cè)定溶液電導(dǎo)率（L2）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

相對(duì)電導(dǎo)率=(L1/L2)×100%.

1.6 苯丙氨酸解氨酶、PPO、POD 活性測(cè)定

取5.0 g凍樣，加入15 mL 0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液[pH 8.8，含10 mmol/L β-巰基乙醇和4 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）]，冰浴研磨，于4 ℃、1×104g 條件下離心15 min，上清液即粗酶提取液。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase,PAL）活性測(cè)定采用LI 等[19]的方法。取0.5 mL 粗酶提取液，加入1 mL 0.1 mol/L硼酸鈉緩沖液（pH 8.8，含4 mmol/L L-苯丙氨酸），于40 ℃條件下孵育1 h。向該體系中加入0.5 mL 6 mol/L 鹽酸終止反應(yīng)，并測(cè)定在333 nm 處吸光度值。每小時(shí)吸光度值增加0.001定義為一個(gè)酶活單位，U。

PPO 活性測(cè)定采用WANG 等[20]的方法。反應(yīng)體系包括0.1 mL 粗酶提取液，2 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）和1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚。反應(yīng)混合液在37 ℃條件下孵育5 min，并測(cè)定在420 nm處吸光度值。每分鐘吸光度值增加0.01 定義為一個(gè)酶活單位，U。

POD 活性測(cè)定采用WANG 等[20]的方法。取0.5 mL 粗酶提取液，加入3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.8，含40 mmol/L 愈創(chuàng)木酚）。隨后，加入0.2 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，并迅速置于30 ℃條件下孵育5 min，測(cè)定在470 nm 處吸光度值。每分鐘吸光度值增加0.01定義為一個(gè)酶活單位，U。

蛋白質(zhì)含量根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G250 染色法[21]進(jìn)行測(cè)定，使用牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 能荷測(cè)定

取3.0 g凍樣，加入5 mL 0.6 mol/L高氯酸，冰浴研磨，于4 ℃、1.2×104g條件下離心20 min。所得上清液用1 mol/L 氫氧化鉀中和至pH 6.5～6.8，并于4 ℃條件下靜置30 min。隨后，將溶液在4 ℃、1×104g 條件下離心10 min 以去除高氯酸鉀。所得上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行液相分析。ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）含量測(cè)定參照LI 等[22]的方法，略做修改。分析采用LC-2010A 液相色譜系統(tǒng)（島津公司，日本）。分析柱采用C18 反向柱[4.6 mm×250 mm；月旭科技（上海）股份有限公司]，檢測(cè)器為紫外線（UV）檢測(cè)器。所用流動(dòng)相A為0.02 mol/L磷酸二氫鉀和0.03 mol/L磷酸氫二鉀，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫程序如下：0 min，100%A；7 min，80%A，20%B；9 min，75%A，25%B；10 min，100%B。樣品進(jìn)樣體積20 μL，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。能荷（energy charge,EC）按照如下公式計(jì)算：

1.8 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、NADPH 含量測(cè)定

參考GIBON 等[23]的方法測(cè)定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD＋）、NADH、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP＋）和NADPH含量。NAD＋和NADP＋的提取方法：取0.5 g 凍樣，加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸，冰浴研磨；將勻漿在95 ℃水浴中孵育5 min后立即置于冰上冷卻；隨后，將勻漿在4 ℃、1×104g 條件下離心10 min，收集上清液并用0.1 mol/L 氫氧化鈉中和，再次在4 ℃、1×104g條件下離心10 min。所得上清液用于后續(xù)測(cè)定。NADH 和NADPH 的提取方法同上，但提取液改為0.1 mol/L氫氧化鈉，離心后上清液用0.1 mol/L鹽酸中和。

對(duì)于NAD＋和NADH 含量的測(cè)定，反應(yīng)體系包括0.05 mL 提取液和0.45 mL 0.1 mol/L 羥甲基甘氨酸（Tricine）-氫氧化鈉緩沖液[pH 8.0，含0.1 mol/L乙 醇，40 mmol/L EDTA，4.2 mmol/L 四 氮 唑 鹽（microculture tetrazolium,MTT）和2 mmol/L 吩嗪硫酸乙酯]。向混合體系中加入35 μL 100 U/mL 乙醇脫氫酶以啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃條件下孵育5 min，隨后加入0.5 mL 6 mol/L氯化鈉終止反應(yīng)。反應(yīng)后溶液在25 ℃、2×104g條件下離心5 min，將沉淀重新溶解于1 mL 96%乙醇中，并測(cè)定在570 nm處吸光度值。

對(duì)于NADP＋和NADPH 的測(cè)定，反應(yīng)體系包括0.05 mL提取液和0.45 mL 0.1 mol/L Tricine-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.0，含0.1 mol/L 6-磷酸葡萄糖，40 mmol/L EDTA，4.2 mmol/L MTT和2 mmol/L吩嗪硫酸乙酯）。向混合體系中加入35 μL 15 U/mL 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶以啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃條件下孵育5 min，隨后加入0.5 mL 6 mol/L 氯化鈉終止反應(yīng)。反應(yīng)后溶液在25 ℃、2×104g 條件下離心5 min，將沉淀重新溶解于1 mL 96%乙醇中，并測(cè)定在570 nm處吸光度值。

1.9 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶活性測(cè)定

參考LIN等[24]的方法測(cè)定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（nicotinamide adenine dinucleotide kinase,NADK）活性。取5.0 g 凍樣，加入10 mL 50 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，于4 ℃、1.2×104g 條件下離心30 min。取0.2 mL 上清液，加入0.8 mL 0.1 mol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH 8.0，含10 mmol/L氯化鎂，3 mmol/L ATP和2 mmol/L NAD＋），在37 ℃條件下水浴孵育1 h。隨后，沸水浴加熱5 min 以終止反應(yīng)，于4 ℃、8×103g 條件下離心10 min，測(cè)定上清液NADP＋含量。NADK 活性表示為每小時(shí)生成NADP＋的量。

蛋白質(zhì)含量根據(jù)考馬斯亮藍(lán)G250 染色法[21]進(jìn)行測(cè)定，使用牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并采用單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA），進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度CO2 氣調(diào)對(duì)鮮切蓮藕色澤及褐變度的影響

由圖1A 可知：對(duì)照組藕片在貯藏4 d后發(fā)生明顯褐變，貯藏6 d后褐變程度嚴(yán)重，基本失去商品價(jià)值；而20%CO2處理能夠有效抑制褐變的發(fā)生，貯藏4 d后無(wú)明顯褐變癥狀，貯藏6 d后僅出現(xiàn)輕微褐變。進(jìn)一步對(duì)藕片b*與L*值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)b*值在貯藏期間不斷增大（圖1B）。對(duì)照組藕片在貯藏6 d后b*值增加93.56%；而20%CO2處理能夠顯著延緩b*值的上升，在貯藏6 d后b*值僅為對(duì)照組的80.43%，差異顯著（P＜0.05）。L*值在貯藏期間不斷下降（圖1C）。對(duì)照組藕片在貯藏6 d 后L*值僅為初始時(shí)的87.01%；而20%CO2則能夠維持較高的L*值，在貯藏第2 和6 天時(shí)與對(duì)照間存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。褐變指數(shù)與b*值變化類似，對(duì)照組與20%CO2處理組褐變指數(shù)均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增大（圖1D）。20%CO2處理能夠抑制褐變指數(shù)的增加，在貯藏第4和6天時(shí)與對(duì)照間存在顯著差異（P＜0.05）。

圖1 高濃度CO2對(duì)鮮切蓮藕外觀、b＊值、L＊值和褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effect of elevated CO2 on exterior quality,yellow-blue(b*)value,lightness(L*)value and browning index of fresh-cut lotus root

2.2 高濃度CO2氣調(diào)對(duì)鮮切蓮藕MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率是反映細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)[13]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和20%CO2處理組中MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率均逐漸上升（圖2A～B）。對(duì)照組MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率上升較快，貯藏6 d 時(shí)分別較0 d 時(shí)增加118.93%和306.48%。20%CO2處理延緩了MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率的上升，在貯藏6 d 時(shí)分別僅為對(duì)照組的72.37%和82.98%（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 高濃度CO2 氣調(diào)對(duì)鮮切蓮藕PAL、PPO 和POD 活性的影響

PAL、PPO 和POD 是引起果蔬褐變的重要酶類[25]。對(duì)照組PAL、PPO、POD活性在貯藏期間均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖3A～C）。其中，PAL 和PPO 活性在貯藏第4 天時(shí)達(dá)到最大值，而POD 活性在第2天時(shí)達(dá)到最大值。20%CO2處理組能夠有效抑制上述3 種褐變相關(guān)酶活性。其中，20%CO2處理組PAL和PPO活性在貯藏6 d時(shí)分別為對(duì)照組的50.31%和47.37%（P＜0.05）。而POD 活性盡管在貯藏6 d 時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但在貯藏第2 和4 天時(shí)分別為對(duì)照組的76.03%和77.36%，差異顯著（P＜0.01，P＜0.05）。

2.4 高濃度CO2氣調(diào)對(duì)鮮切蓮藕能荷水平的影響

圖2 高濃度CO2對(duì)鮮切蓮藕MDA 含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of elevated CO2 on MDA content and relative electrolyte leakage of fresh-cut lotus root

鮮切蓮藕的ATP、ADP、AMP 含量及能荷水平如圖4所示。ATP水平在貯藏前2 d維持相對(duì)穩(wěn)定，隨后逐漸下降。20%CO2處理組ATP 加速下降，在貯藏6 d時(shí)ATP含量?jī)H為對(duì)照組的81.78%（P＜0.01）（圖4A）。ADP在貯藏前2 d逐漸下降，隨后上升并在4～6 d 內(nèi)維持相對(duì)穩(wěn)定。與對(duì)照相比，20%CO2處理組中ADP含量在第4天時(shí)顯著提高（P＜0.05），但在第6天時(shí)顯著降低（P＜0.05）（圖4B）。AMP含量在2～4 d 內(nèi)急劇上升，隨后緩慢上升。20%CO2處理組中AMP含量在貯藏第4和6天時(shí)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖4C）。蓮藕能荷水平從貯藏第2天后呈下降趨勢(shì)，且20%CO2處理加速能荷水平的下降，與對(duì)照組間存在顯著差異（P＜0.01）（圖4D）。

2.5 高濃度CO2 氣調(diào)對(duì)鮮切蓮藕吡啶核苷酸含量的影響

圖3 高濃度CO2對(duì)鮮切蓮藕PAL、PPO及POD活性的影響Fig.3 Effect of elevated CO2 on the activities of PAL,PPO and POD of fresh-cut lotus root

如圖5A～B 所示，對(duì)照組中NADH 含量在貯藏期間逐漸下降，而NAD＋含量則在0～2 d 和4～6 d 迅速下降。20%CO2處理組在貯藏后期加速NADH 的下降，但維持較高的NAD＋水平。貯藏6 d 時(shí)，處理組NADH 和NAD＋含量分別為對(duì)照組的50.08%和319.15%，組間差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）。NADPH 和NADP＋含量在貯藏期間均呈下降趨勢(shì)，而20%CO2處理能夠同時(shí)維持較高的NADPH和NADP＋水平（圖5C～D）。由圖5E可見：NADK活性在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；20%CO2處理提高了NADK 活性，貯藏6 d 時(shí)20%CO2處理組NADK 活性為對(duì)照組的148.60%，組間差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

酶促褐變是引起鮮切蓮藕品質(zhì)劣變，縮短其貨架期的主要因素之一。因此，尋求有效的抑制褐變的采后處理手段具有十分重要的意義。本文利用20%CO2氣調(diào)貯藏鮮切蓮藕，以探究其對(duì)酶促褐變的作用效果，并闡明可能的作用機(jī)制。在4 ℃貯藏條件下，對(duì)照組鮮切蓮藕在貯藏4 d 后表面出現(xiàn)較為明顯的褐變，貯藏6 d后褐變嚴(yán)重，基本失去商品價(jià)值。20%CO2處理能有效抑制蓮藕褐變，貯藏6 d后仍維持較好的外觀品質(zhì)。L*值與b*值是反映鮮切蓮藕色澤品質(zhì)的重要指標(biāo)。在貯藏期間，鮮切蓮藕表面亮度逐漸降低，L*值不斷減小。本研究表明：20%CO2處理能夠有效抑制L*值的下降，維持良好的表面光澤。黃藍(lán)值b*能夠有效反映鮮切蓮藕褐變情況，b*值越大，表明蓮藕表面黃色沉積越為明顯。20%CO2處理能夠有效抑制貯藏期間b*值的上升，并在第4 與6 天與對(duì)照組間達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）。褐變指數(shù)是另一反映果蔬褐變的重要指標(biāo)[12]。20%CO2處理組的褐變指數(shù)在貯藏后期顯著低于對(duì)照組，這與b*值結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明，20%CO2氣調(diào)能夠有效抑制鮮切蓮藕在貯藏期間的褐變，從而延長(zhǎng)貨架期，提高其貯藏特性。

酶促褐變是果實(shí)中的酚類物質(zhì)在有氧條件下受氧化酶氧化形成褐色或黑色物質(zhì)的生理生化過(guò)程[26]。在正常細(xì)胞中，酚類物質(zhì)與相應(yīng)氧化酶分別分布于液泡與細(xì)胞質(zhì)中，兩者的空間阻隔限制了酶促褐變的發(fā)生。而采后貯藏期間，逆境脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)逐步破壞，區(qū)室化分布消失，底物與酶相互接觸，進(jìn)而引發(fā)酶促褐變[27]。因而，膜結(jié)構(gòu)破壞是引發(fā)酶促褐變的重要因素之一。MDA 含量與相對(duì)電導(dǎo)率是反映膜結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)。MDA 是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，能夠反映膜結(jié)構(gòu)的氧化程度。而相對(duì)電導(dǎo)率則表示電解質(zhì)外滲情況，直接反映膜結(jié)構(gòu)的完整性[13]。在貯藏期間，組織的膜結(jié)構(gòu)不斷被破壞，MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升。20%CO2處理顯著抑制MDA 含量及相對(duì)電導(dǎo)率的上升，表明高濃度CO2氣調(diào)能夠維持鮮切蓮藕組織的膜結(jié)構(gòu)完整性，阻隔酶與底物相互接觸，進(jìn)而有效抑制褐變的發(fā)生。相類似的，TIAN 等[10]研究表明，高濃度CO2結(jié)合低濃度O2氣調(diào)貯藏采后櫻桃能夠延緩體內(nèi)MDA含量的增加，減輕膜脂過(guò)氧化程度，有效抑制采后褐變及果實(shí)腐敗。

圖5 高濃度CO2對(duì)鮮切蓮藕NADH、NAD＋、NADPH、NADP＋含量和NADK活性的影響Fig.5 Effect of elevated CO2 on the contents of NADH,NAD＋,NADPH,NADP＋and the activity of NADK in fresh-cut lotus root

酶促褐變是多種酶類共同作用的結(jié)果，涉及的酶類主要包括PAL、PPO、POD等[12]。PAL是酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類，為酶促褐變提供重要底物。研究表明，PAL參與采后鮮切竹筍[28]、荔枝[29]、生菜[30]等多種果蔬的褐變過(guò)程。20%CO2氣調(diào)貯藏能夠有效抑制鮮切蓮藕PAL 活性，降低褐變底物的生成。PPO 是誘發(fā)酶促褐變的直接酶類。在有氧條件下PPO直接催化酚類物質(zhì)形成醌類，隨后進(jìn)一步反應(yīng)生成褐色或黑色物質(zhì)[26]。POD 本身并不直接催化酚類物質(zhì)，但能通過(guò)利用H2O2進(jìn)一步氧化褐變產(chǎn)物以促進(jìn)褐變過(guò)程[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，20%CO2氣調(diào)組中PPO 與POD 活性均顯著低于對(duì)照組。謝君等[12]利用100%CO2處理鮮切蓮藕，發(fā)現(xiàn)PAL、PPO、POD活性也均受到顯著抑制，本文結(jié)果與此相一致。上述結(jié)果表明，20%CO2不僅能夠維持良好的酶與底物的區(qū)室化分布，而且能夠有效抑制褐變相關(guān)酶活性，降低酶促反應(yīng)速率，延緩鮮切蓮藕的采后褐變。

能量代謝是采后果蔬成熟衰老的重要影響因子[32]。采后能量匱缺或能量過(guò)剩均會(huì)引起組織代謝紊亂，加速果蔬衰老進(jìn)程[14,16]。LI 等[22]研究表明，在0 ℃環(huán)境下，20%CO2氣調(diào)貯藏采后草莓加速了果實(shí)能荷水平的下降。本研究中，20%CO2氣調(diào)處理加速了鮮切蓮藕中ATP含量的下降與AMP的積累，從而加速了能荷水平的降低。在低溫貯藏環(huán)境下，果蔬各生理生化反應(yīng)速率降低，對(duì)于能量需求也迅速降低，較低的能量供應(yīng)即可滿足植物體正常代謝所需[33-34]。因此，我們推測(cè)，能荷水平的降低不是引起鮮切蓮藕褐變與衰老的主要限制性因素。

進(jìn)一步地，本文對(duì)吡啶核苷酸含量及其代謝進(jìn)行了探究。NADH、NAD＋、NADPH 和NADP＋是能量代謝過(guò)程中的重要輔酶，參與電子傳遞過(guò)程[35]。NADH 與NAD＋主要參與糖酵解-三羧酸循環(huán)，而NADPH和NADP＋則參與磷酸戊糖途徑[36]。前期研究表明，高濃度CO2處理的草莓中NADH 水平下降是引起能荷水平降低的主要因素[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，20%CO2能夠加速NADH 水平下降并在貯藏末期（第6 天）維持較高的NAD＋水平，這與草莓中研究結(jié)果相一致。同時(shí)，NADPH 與NADP＋水平受到20%CO2處理顯著上調(diào)。NADK是催化NAD＋轉(zhuǎn)化為NADP＋的唯一酶[24]。20%CO2處理組中NADK活性顯著高于對(duì)照組，表明高濃度CO2促進(jìn)了胞內(nèi)NAD＋向NADP＋轉(zhuǎn)化，這與NAD＋和NADP＋含量變化結(jié)果一致。高濃度CO2通過(guò)降低NAD＋水平削弱了糖酵解-三羧酸循環(huán)途徑，同時(shí)提高了NADP＋水平以激活磷酸戊糖途徑，而磷酸戊糖途徑產(chǎn)生能量的效率低于糖酵解-三羧酸循環(huán)途徑，因此引起20%CO2處理組中蓮藕能荷水平的快速下降[37]。吡啶核苷酸水平不僅與能量代謝密切相關(guān)，同時(shí)也影響體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。呼吸鏈?zhǔn)荝OS 產(chǎn)生的主要部位。NADH 呈遞電子過(guò)程中由于電子滲漏也會(huì)產(chǎn)生大量ROS[17]。采后過(guò)強(qiáng)的糖酵解-三羧酸循環(huán)代謝易引起ROS 大量積累，造成細(xì)胞過(guò)氧化，加速采后衰老。而磷酸戊糖途徑則能產(chǎn)生大量NADPH，通過(guò)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)清除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體抗氧化能力[17]。因此，當(dāng)植物受到氧化脅迫時(shí)，細(xì)胞通過(guò)降低糖酵解-三羧酸循環(huán)代謝，激活磷酸戊糖途徑以提高抗氧化水平，維持體內(nèi)氧化還原平衡[37]。在本研究中，高濃度CO2作為一種非生物性脅迫能夠誘導(dǎo)糖酵解-三羧酸循環(huán)代謝的降低及磷酸戊糖途徑的激活，提高細(xì)胞抗氧化水平，進(jìn)而有效抑制酶促褐變的發(fā)生。

4 結(jié)論

高濃度CO2氣調(diào)作為一種采后保鮮手段能夠有效抑制鮮切蓮藕的褐變。20%CO2處理不僅顯著抑制MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率的上升，維持良好的酶與底物區(qū)室化分布，而且通過(guò)抑制PAL、PPO、POD等褐變相關(guān)酶活性，降低酶促反應(yīng)速率，延緩鮮切蓮藕的采后褐變發(fā)生。此外，20%CO2處理還能夠激活NADK 活性，降低細(xì)胞NADH 水平并提高NADPH水平，從而誘導(dǎo)糖酵解-三羧酸循環(huán)代謝的降低及磷酸戊糖途徑的激活，降低能量代謝的同時(shí)提高細(xì)胞抗氧化水平，進(jìn)而延緩采后衰老及酶促褐變的發(fā)生。