徐俊峰 董艷蓉徐婉君 方建紅 李莎莎 平依林 王曉燕

浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

齲齒主要由鏈球菌屬引起，而變形鏈球菌已被公認(rèn)為是最主要的致齲菌。目前，齲病的治療方法均存在或多或少的局限性，而天然植物來源的抗菌劑來替代或豐富現(xiàn)有的化學(xué)性抗菌漱口水的研究正越來越受到關(guān)注，中藥對(duì)口腔致病菌的抑菌研究也成為熱點(diǎn)之一[1]。中藥烏梅為薔薇科植物梅的干燥近成熟果實(shí)，也是藥食同源的一味中藥?！侗静菥V目》中記載：“下氣，除熱煩滿，安心，止肢體痛，偏枯不仁，死肌，去青黑痣，蝕惡肉（《本經(jīng)》）。去痹，利筋脈，止下痢，好唾口干（《別錄》）?！爆F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，烏梅具有抗菌、保護(hù)肝功能、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗過敏等作用[2]。本研究以烏梅肉水提取液為研究對(duì)象，研究其對(duì)口腔變形鏈球菌的抑制作用，為今后進(jìn)一步開發(fā)烏梅口腔抗菌藥物提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料：烏梅(Fructus mume，批次：180315)購自亳州磊碩生物科技有限公司，經(jīng)本院中藥房鑒定為正品。變形鏈球菌（Streptococcus mutans,MS.）(ATCC700610)菌株購自于美國ATCC。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、脫水牛心浸粉、脫水小牛腦浸粉、葡萄糖、NaCl、MTT、二甲亞砜、T型涂布棒、90mm玻璃培養(yǎng)皿等。

1.2 儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱(滄州豪威機(jī)電有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，高壓蒸汽滅菌鍋［浙江新豐(中友)有限公司］，生化培養(yǎng)箱SPX-150A/B（杭州綠博儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)Alpha1900（上海譜元儀器有限公司）。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 烏梅提取液的制備：將烏梅去核，室溫干燥，加200ml蒸餾水煮沸2h,提取液過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸發(fā)制備成1g/ml溶液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫们皳u勻，并稀釋到相應(yīng)濃度使用。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)：變形鏈球菌菌株經(jīng)復(fù)蘇后接種于馬血瓊脂（HBA）培養(yǎng)基，在厭氧箱37℃下培養(yǎng)48h，收集細(xì)菌并在牛腦心浸液（BHI）制成濃度為107～108CFU/ml的菌懸液備用。

1.3.3 抗菌活性的研究：將20μl菌懸液接種于HBA培養(yǎng)皿，涂布均勻。用20μl不同濃度的烏梅提取液浸潤直徑6mm紙片，將其呈同心圓分布均勻放置于HBA培養(yǎng)皿，與培養(yǎng)基完全接觸；同時(shí)用10μl的0.2%（w/v）洗必泰作為陽性對(duì)照。HBA培養(yǎng)皿在37℃厭氧箱培養(yǎng)48h，肉眼觀察有無抑菌圈，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的直徑，計(jì)算平均抑菌圈直徑。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定：將烏梅提取液和液體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)倍稀釋，質(zhì)量濃度分別為1000mg/ml、500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.6mg/ml。各試管加入菌懸液50μl，37℃厭氧培養(yǎng)48h，取出肉眼觀察，無肉眼可見菌生長試管對(duì)應(yīng)的加入烏梅提取液最低濃度即為MIC。MBC是根據(jù)MIC的測(cè)定結(jié)果，選取MIC、2×MIC和4×MIC對(duì)應(yīng)濃度樣品的菌液20μl，點(diǎn)植于HBA培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)48h后觀察，不生長菌落對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為MBC。

1.3.5 烏梅提取液對(duì)完整牙體細(xì)菌生物膜的影響：離體完整前磨牙清潔、高溫高壓滅菌后備用。在試管內(nèi)以1%蔗糖調(diào)節(jié)BHI菌液濃度到106CFU/ml，將牙體置于試管內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)48h，待牙體細(xì)菌生物膜形成后，用無菌PBS洗滌2次以去除游離細(xì)菌。以不同濃度烏梅提取液（500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml）分別加入含3ml BHI培養(yǎng)基的試管，靜止作用5min，以0.2%洗必泰和BHI分別為陽性和陰性對(duì)照。然后去除管內(nèi)液體并用PBS溶液洗滌2次。用含MTT的BHI溶液2ml浸泡，37℃培養(yǎng)4h，加入DMSO溶解，將每種溶液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中并在光譜儀中于490nm讀取吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抑菌活性的研究：見表1。

表1 烏梅提取液對(duì)變形鏈球菌的抑菌圈直徑(±s，mm)

表1 烏梅提取液對(duì)變形鏈球菌的抑菌圈直徑(±s，mm)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05。

抑菌直徑0 14.24±0.2*11.87±0.3*9.68±0.1*9.21±0.3*組別陰性對(duì)照組試驗(yàn)組1（1000mg/ml）試驗(yàn)組2（500mg/ml）試驗(yàn)組3（250mg/ml）陽性對(duì)照組（0.2%洗必泰）

2.2 MIC及MBC：見表2。

表2 烏梅提取液對(duì)變形鏈球菌的MIC及MBC

2.3 對(duì)完整牙體細(xì)菌生物膜的影響：見表3。

表3 烏梅提取液對(duì)變形鏈球菌牙體細(xì)菌生物膜形成的影響(±s)

表3 烏梅提取液對(duì)變形鏈球菌牙體細(xì)菌生物膜形成的影響(±s)

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別陰性對(duì)照組試驗(yàn)組1（500mg/ml）試驗(yàn)組2（250mg/ml）試驗(yàn)組3（125mg/ml）陽性對(duì)照組（0.2%洗必泰）OD值2.378±0.354 1.352±0.272*1.499±0.315*1.689±0.457*1.288±0.331*

3 討論

早期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)烏梅果肉的主要成分為有機(jī)酸、萜類、甾醇、氨基類、糖類、揮發(fā)性成分、脂類、黃酮類、生物堿、微量元素等。烏梅是一種安全性高的藥食同源藥材，其藥理作用廣泛[3]。已有研究證實(shí)烏梅及其炮制品烏梅肉、烏梅炭對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌有不同程度的抑菌作用[4]。更深入的研究表明針對(duì)于李斯特菌來說，烏梅提取液通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜系統(tǒng)和阻滯DNA的合成抑制其生長繁殖[5]。同時(shí)，烏梅提取液對(duì)嗜酸乳桿菌、牙齦鏈球菌、變形鏈球菌、念珠菌等15種口腔致病菌都有抑制作用[6]。國內(nèi)也有學(xué)者通過薄層色譜-生物自顯影技術(shù)以及高效液相色譜法對(duì)其主要抑菌成分進(jìn)行分析，初步確定烏梅醇提物中起主要抑菌作用的是有機(jī)酸類，而其中含量最高的是檸檬酸。因此，推測(cè)檸檬酸是烏梅中主要的抑菌活性物質(zhì)之一，但是否還有其他成分發(fā)揮抑菌活性有待進(jìn)一步深入研究[7]。

變形鏈球菌被公認(rèn)為是最主要的致齲菌，由該類病原體形成的牙菌斑生物膜與齲病的發(fā)生有密切的關(guān)系。與浮游菌相比，菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌的毒力、耐藥性和抵抗宿主免疫防御的能力更強(qiáng)[8]。本研究檢測(cè)了烏梅水提取液對(duì)變形鏈球菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)該菌的MIC為50mg/ml，MBC為100mg/ml。研究還比較了烏梅水提取液對(duì)變形鏈球菌在完整牙體形成細(xì)菌生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)在烏梅水提取液的干擾下，變形鏈球菌在牙體組織形成細(xì)菌生物膜的能力被極大地削弱。這表明烏梅水提取液在治療口腔變形鏈球菌及防治齲齒方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

本試驗(yàn)僅對(duì)烏梅水提取液進(jìn)行抑菌活性分析，尚未開展其他溶劑萃取相的抑菌活性分析，其活性成分有待進(jìn)一步分析鑒定。本研究可為烏梅在口腔疾病防治中的綜合利用提供數(shù)據(jù)支持。