胡家勇，張 嫚，皮江一，彭青枝，馮 灝，周陶鴻,

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；3.湖北本質(zhì)檢測認(rèn)證有限公司，湖北 武漢 430000）

保健食品以其毒副作用小、安全性高、服用方便等特點而備受消費者青睞。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，我國保健品市場獲得了空前的發(fā)展。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，一些不法分子及廠家利用人們對健康的心理需求，在各類保健品中非法添加化學(xué)藥品[1-2]，如在保健酒中加入西地那非類藥物[3-4]。西地那非以其商業(yè)名稱Viagra廣為人知，在中國俗名“偉哥”，若消費者在長期不知情條件下攝入此藥物，會對自身健康造成嚴(yán)重的危害[5]。

西地那非、他達(dá)拉非等屬壯陽類藥物，由美國輝瑞制藥公司研發(fā)，本應(yīng)屬于臨床處方藥，卻被不良酒商扣上了“藍(lán)帽子”，這類藥物具有一定副作用，具體表現(xiàn)為面部潮紅、鼻塞、頭暈頭痛和視覺異常等癥狀，如果消費者長期飲用這類“保健酒”，可導(dǎo)致其內(nèi)分泌失調(diào)和心血管功能紊亂，引起頭痛、昏厥、狂躁甚至呼吸功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對身體有隱疾的人，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死亡[6]。

目前對于保健食品中西地那非類藥物的實驗室檢測方法主要有高效液相色譜法[7-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]、薄層色譜法[13]等，此外，酶聯(lián)免疫法[14]、紅外光譜[15-16]及離子遷移譜法[17]等都被嘗試用于保健食品中西地那非類藥物測定。色譜法在檢測的靈敏度、選擇性和高通量方面優(yōu)勢顯著，但是色譜法檢測比較費時，且前處理方法較為繁瑣。目前法檢方法[18]檢測保健食品中西地那非類藥物存在出峰晚、檢測周期長等缺陷，且實驗耗材較為昂貴。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)作為一種新型的快速檢測技術(shù)，具有靈敏度高、熒光背景低、不受水干擾等優(yōu)點，其檢測是基于在合適頻率的入射光照射下，當(dāng)分子與納米大小的金和銀結(jié)構(gòu)相結(jié)合時，會發(fā)生表面增強(qiáng)拉曼散射，拉曼信號會強(qiáng)烈增強(qiáng)[19-20]。近年來，隨著SERS技術(shù)的發(fā)展，拉曼光譜在食品安全方面的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，如Pan Yun等[21]利用SERS法測定植物油中叔丁基對苯二酚，Gukowsky等[22]利用SERS快速鑒別人工色素和天然色素，Yang Libin等[23]利用SERS檢測牛奶中雙酚A的殘留，此外，SERS在有害小分子物質(zhì)、食源性致病菌、外源性有害物質(zhì)等方面的快速檢測也展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[24-25]，同時拉曼光譜在保健食品中非法添加那非類藥物鑒定檢測方面也有一定的應(yīng)用，如Mao Danzhuo等[26]利用SERS技術(shù)篩選保健品中西地那非和他達(dá)那非；劉元瑞等[27]利用薄層原位表面-SERS技術(shù)實現(xiàn)中成藥和保健品中西地那非的定性檢測；王紅梅等[28]利用SERS技術(shù)定性檢測保健品中那非類藥物；吳國萍等[29]考察不同配比納米金與不同助劑的增強(qiáng)效果，然后利用最優(yōu)增強(qiáng)試劑及助劑實現(xiàn)保健品中西地那非類藥物的定性檢測。這些報道主要利用SERS技術(shù)實現(xiàn)那非類藥物的定性檢測，針對定量檢測鮮有研究。

本研究建立一種基于SERS技術(shù)快速定性定量檢測保健食品中西地那非類非法添加物的方法，以期為保健食品中非法添加物西地那非的檢測提供新的備選方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金納米溶膠 北京倍肯恒業(yè)科技發(fā)展股份有限公司；乙酸乙酯、硫酸、氯化鈉、三聚氰胺 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；西地那非鹽酸鹽 中國藥品生物制品研究所。

inVia顯微共聚焦拉曼光譜儀 英國Renishaw公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取西地那非鹽酸鹽0.1 g（精確至0.000 1 g），用10 mL乙腈溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為100 mg/L。準(zhǔn)確吸取西地那非鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用0.3 mol/L的硫酸溶液將其稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列中間液，臨用時配制。分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液（50 mg/L三聚氰胺溶液）充分混勻，得到質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（因為待測液也需與內(nèi)標(biāo)1∶1體積混合，所以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度默認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度）。依次向檢測瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測。以西地那非質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，西地那非特征峰1 234 cm-1與三聚氰胺特征峰707 cm-1的峰高比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 定性檢測

固體：檢測膠囊類樣品時，需將膠囊殼與內(nèi)容物同時取樣研磨，其他固體樣品直接搗碎研磨[30]。稱取研磨均勻的樣品1 g于15 mL離心管中，向離心管中加入4 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集上層有機(jī)相并用乙酸乙酯定容至5 mL，此為提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL離心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集下層溶液并用水定容至5 mL，此為提取液B，依次向檢測瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL提取液B、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測。

液體：吸取1 mL試樣于15 mL離心管中，向離心管中加入4 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集上層有機(jī)相并定容至5 mL，上層有機(jī)相為提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL離心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振蕩渦旋5 min后3 000 r/min離心5 min，收集下層溶液并定容至5 mL，下層溶液為提取液B。依次向檢測瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL提取液B、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測。

1.2.2.2 定量檢測

與1.2.2.1節(jié)同法處理得到提取液B，取1 mL提取液B與1 mL內(nèi)標(biāo)溶液充分混勻，此為待測液。依次向檢測瓶中加入500 μL納米金溶膠、100 μL待測液、100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻后上機(jī)檢測。

1.2.3 拉曼光譜儀測定條件

曝光時間5 s，激光功率25 mW，掃描次數(shù)1 次，物鏡倍數(shù)50，激光波長785 nm，光柵1 200 L/mm，掃描范圍650～1 700 cm-1。

1.2.4 進(jìn)樣方式

本實驗采用顯微共聚焦拉曼光譜儀，顯微鏡聚焦程度對儀器的檢測結(jié)果影響很大，為避免每次檢測時的反復(fù)聚焦，同時也為了確保實驗條件的統(tǒng)一以及定量的準(zhǔn)確，本實驗設(shè)計如圖1所示的進(jìn)樣裝置，此裝置可確保顯微鏡聚焦程度的一致性和實驗結(jié)果的重復(fù)性。拉桿注射器緩慢抽吸進(jìn)樣，待樣品灌滿測試管（毛細(xì)管）后開始檢測，檢測完成后用去離子水沖洗管路，管路清洗完畢后進(jìn)行下一個樣品的檢測，避免殘留干擾。

圖 1 進(jìn)樣裝置圖Fig. 1 Drawing of injection device

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析以及線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢測結(jié)果

圖 2 西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS圖Fig. 2 SERS spectrum of sidenafil standard solution

從圖2可以看出，西地那非SERS特征峰為1 234、1 525、1 579 cm-1（一階光譜峰中心位置重復(fù)性≤3 cm-1），與王玉等[31]的研究結(jié)果一致，空白試劑SERS特征峰位置為1 047 cm-1，與西地那非特征峰沒有干擾。

將待測樣品按相應(yīng)的前處理方式進(jìn)行處理后上機(jī)檢測，根據(jù)譜圖（1 234±3）、（1 525±3）cm-1和（1 580±3）cm-1處特征拉曼光譜，對保健食品中的西地那非進(jìn)行評估：若同時存在上述特征峰，則可判定樣品中含有西地那非。

西地那非標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖中，1 579 cm-1為苯環(huán)、氮雜環(huán)的C＝C與C＝N伸縮振動歸屬，1 525、1 234 cm-1處的強(qiáng)峰為芳香化合物中＝C—H振動峰。西地那非分子結(jié)構(gòu)中含有芳烴、雜環(huán)，分子結(jié)構(gòu)具有易于被增強(qiáng)的特點，因此SERS技術(shù)適用于西地那非的檢測。

2.2 定量檢測結(jié)果

2.2.1 選擇內(nèi)標(biāo)法的必要性

表 1 西地那非檢測結(jié)果Table 1 Peak data showed the internal standard method to be necessary to quantify sidenafil

由表1可以看出，不同質(zhì)量濃度的西地那非特征譜峰峰位置均一致，但峰強(qiáng)與質(zhì)量濃度、峰面積與質(zhì)量濃度均呈非線性關(guān)系，因此無法直接進(jìn)行定量檢測。為了實現(xiàn)準(zhǔn)確定量，本實驗考慮加入一種拉曼光譜信號強(qiáng)且與西地那非互無干擾的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)法實現(xiàn)定量。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

圖 3 三聚氰胺與西地那非SERS圖Fig. 3 SERS spectra of melamine and sildenafil

由圖3可以看出，三聚氰胺的特征峰為707、1 091 cm-1，西地那非的特征峰為1 234、1 526、1 581 cm-1，實驗中所用拉曼光譜儀穩(wěn)定性較好，一階光譜峰中心位置重復(fù)性不高于3 cm-1，因此三聚氰胺與西地那非的SERS峰無重疊，即三聚氰胺與西地那非之間無相互干擾；此外本實驗研究保健食品中西地那非的定量檢測，研究對象的消費人群為成年男士，故此類產(chǎn)品無需非法添加三聚氰胺，因此可認(rèn)為本實驗的研究對象不含有三聚氰胺；再者三聚氰胺具有拉曼光譜信號強(qiáng)、特征峰少、峰形好等優(yōu)點，故本實驗選取三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行保健食品中非法添加物西地那非的定量檢測。西地那非在實際樣品中的添加水平大多在數(shù)百mg/kg，為確保定量的線性范圍，通過控制單變量的方式進(jìn)行多次實驗，最終確定內(nèi)標(biāo)三聚氰胺質(zhì)量濃度為50 mg/L較為合適。

2.2.3 SERS法定量檢測的可行性

本實驗選擇加入三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)，因三聚氰胺特征峰707 cm-1峰強(qiáng)較強(qiáng)，且不會受不同質(zhì)量濃度西地那非信號峰的干擾，其峰高計算準(zhǔn)確性相對更高，故選此峰作為西地那非定量參照峰；西地那非有1 234、1 525、1 581 cm-1三個特征峰，因1 525、1 581 cm-1兩個峰存在一定的重疊，不利于計算峰高，此外，1 581 cm-1峰強(qiáng)太強(qiáng)，當(dāng)西地那非質(zhì)量濃度過高時，峰高比計算偏差大，綜合考慮選取西地那非特征峰1 234 cm-1作為定量特征峰。以西地那非質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，西地那非SERS特征峰1 234 cm-1與三聚氰胺SERS特征峰707 cm-1的峰高比（I1234/I707）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合，考慮到實際摻假樣品中西地那非類添加量達(dá)10～1 000 mg/kg，因此設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25、50 mg/L，由圖4和表2可以看出，在0～50 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系y=0.064 3x-0.051 1，R2＝0.996 9，由此可以說明SERS法定量檢測保健食品中非法添加物西地那非可行。

圖 4 西地那非定量SERS圖Fig. 4 SERS spectra obtained from quantitative determination of sildenafil

表 2 西地那非定量檢測結(jié)果Table 2 Results obtained from quantitative detection of sildenafil

2.2.4 加標(biāo)樣品的定量檢測結(jié)果

圖 5 固體樣品加標(biāo)SERS圖Fig. 5 SERS spectra of spiked solid samples

圖 6 液體樣品加標(biāo)SERS圖Fig. 6 SERS spectra of spiked liquid samples

取一定量的某品牌藥丸類保健品（經(jīng)法檢方法[18]檢驗不含西地那非類藥物）搗碎研磨，精密稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品適量加入其中攪拌均勻，作為固體加標(biāo)樣品A，稱取3 份固體加標(biāo)樣品A，每份1.00 g，編號為A-1、A-2、A-3。吸取一定量某品牌保健酒（經(jīng)法檢方法[18]檢驗不含西地那非藥物），添加一定量已知質(zhì)量濃度的西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為液體加標(biāo)樣品B，吸取3 份液體加標(biāo)樣品B，每份1.00 mL，編號為B-1、B-2、B-3。將固體加標(biāo)樣品A及液體加標(biāo)樣品B按待測溶液的制備與測定同法操作，加標(biāo)樣品SERS見圖5、6。計算西地那非加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示，固體加標(biāo)樣品方法的回收率為85.6%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.14%，液體加標(biāo)樣品的方法回收率為98.7%～105.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.25%，加標(biāo)樣品的測試結(jié)果表明SERS法可滿足保健食品中西地那非含量的定量檢測要求。

表 3 樣品中西地那非的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of spiked samples

2.3 方法的檢測限結(jié)果

2.3.1 定性檢測限

圖 7 定性檢測限SERS圖Fig. 7 SERS spectra showing LOD

由圖7可以看出，空白僅有試劑的SERS峰出現(xiàn)，0.05、0.1、0.2 mg/L均出現(xiàn)了西地那非SERS特征光譜圖，由此說明SERS法檢測西地那非不存在假陽性，另外其定性檢測限為0.05 mg/L。

2.3.2 定量檢測限

圖 8 定量檢測限SERS圖Fig. 8 SERS spectra showing LOQ

由圖8可以看出，0、1、2.5 mg/L質(zhì)量濃度均無西地那非SERS特征光譜峰的出現(xiàn)，原因可能是內(nèi)標(biāo)三聚氰胺的質(zhì)量濃度很高，在與低質(zhì)量濃度的西地那非競爭結(jié)合納米金時其優(yōu)勢明顯，導(dǎo)致低質(zhì)量濃度西地那非增強(qiáng)效果微弱，其特征SERS無法呈現(xiàn)，5 mg/L質(zhì)量濃度出現(xiàn)了西地那非拉曼表面增強(qiáng)特征光譜圖，定量檢測結(jié)果為4.6 mg/L。由以上結(jié)果可以看出，西地那非的定量檢測限為5 mg/L，可滿足大部分樣品的定量檢測，對于一些低含量樣品的檢測，可考慮采用氮吹的方式對提取液進(jìn)行濃縮。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

2.4.1 定性檢測結(jié)果

本實驗選取經(jīng)法檢方法[18]篩選出的陽性樣本5 個，其中3 個為固體藥丸，2 個為保健酒，編號為Y-1、Y-2、Y-3、J-1、J-2。根據(jù)本研究的定性檢測方法進(jìn)行上機(jī)檢測。由圖9可以看出，5 個樣品皆出現(xiàn)了西地那非SERS特征峰，因此可以定性判定其為西地那非陽性樣品，定性結(jié)果準(zhǔn)確。

圖 9 實際樣品定性檢測結(jié)果Fig. 9 Qualitative detection of sildenafil in actual sample

2.4.2 定量檢測結(jié)果

本實驗選取經(jīng)法檢方法[18]篩選出的陽性樣本與陰性樣本各5 個批次，隨機(jī)編號為1#～10#，按照本實驗的樣品前處理方法對10 批次樣品進(jìn)行前處理，根據(jù)本研究的定量檢測方法進(jìn)行上機(jī)檢測。由表4可以看出，SERS法定量檢測西地那非與高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果基本一致。

表 4 實際樣品中西地那非測定Table 4 Contents of sildenafil in actual samples determined by the developed method and HPLC

因SERS法具有定性準(zhǔn)確率高、定量檢測周期短等優(yōu)點，可以對大批量的樣品先進(jìn)行定性初篩，對于初篩的陽性樣本再進(jìn)行定量檢測，這樣可大大提高檢測效率。

2.5 實際樣品干擾分析

熒光是拉曼光譜測定的最大干擾，強(qiáng)熒光物質(zhì)信號強(qiáng)，它可能掩蔽了目標(biāo)物質(zhì)的拉曼信號。保健品成分復(fù)雜，直接對保健品進(jìn)行拉曼光譜測定時可能因為保健品中存在強(qiáng)熒光物質(zhì)導(dǎo)致目標(biāo)物的拉曼信號無法呈現(xiàn)，因此樣品的前處理很關(guān)鍵。本研究采用二次萃取方式進(jìn)行西地那非的分離提取，樣品的萃取分離可以消除絕大部分干擾成分。除了強(qiáng)熒光物質(zhì)的干擾外，其他成分的干擾相對比較小，因為西地那非的特征峰有多個，而干擾物質(zhì)同時存在西地那非的特征峰可能性很低。

3 結(jié) 論

本實驗基于SERS技術(shù)，建立了保健食品中西地那非的定性定量檢測方法。以西地那非SERS特征光譜峰實現(xiàn)定性檢測，內(nèi)標(biāo)法實現(xiàn)定量檢測。

SERS法定性檢測保健食品中西地那非結(jié)果顯示，此法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測耗時少等優(yōu)點，可用于大量樣品的定性篩查。另外，SERS法定量測定保健食品中西地那非含量的方法學(xué)驗證結(jié)果顯示：該方法檢測限為5 mg/L，線性回歸方程為y＝0.064 3x-0.051 1，R2＝0.996 9，固體試樣加標(biāo)回收率為85.6%～92.6%，液體試樣加標(biāo)回收率為103.2%～108.7%。此結(jié)果表明，SERS法定量檢測保健食品中西地那非可行。

利用SERS法與高效液相色譜-質(zhì)譜法同時對實際樣品中西地那非進(jìn)行定性定量檢測，結(jié)果佐證了SERS法定性、定量檢測保健食品中西地那非類物質(zhì)的可靠性。建立SERS法定性定量檢測保健食品中西地那非，以期為保健食品中西地那非的檢測提供新的備選方法。