趙艷芳，康緒明，寧勁松，翟毓秀，尚德榮,*，丁海燕，盛曉風

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，山東 青島 266071）

蝦蛄（Oratosquilla oratoria），俗名琵琶蝦、皮皮蝦，隸屬甲殼綱、口足目、蝦蛄科，主要生活在近海淺灘、泥質(zhì)海底的巢穴之中，全國各地沿海均有分布，也是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品之一。隨著海洋捕撈魚類資源的嚴重衰退，蝦蛄已成為一些海域漁獲量最高的種類之一[1-3]。蝦蛄風味獨特，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、磷、微量元素以及人體必需的氨基酸。蝦蛄提取物對人鼻咽癌細胞、人肝癌細胞具有一定的抑制作用，可作為一類新型、天然的抗腫瘤藥物[4-7]。近年來隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，蝦蛄已成為深受人們喜愛的佳肴。

沿海水域重金屬污染直接影響水產(chǎn)品中重金屬的含量。鎘是一種生物體非必需的有毒重金屬，被美國毒物管理委員會列為第6位危害人體健康的有毒物質(zhì)。對國內(nèi)外沿海水域經(jīng)濟水產(chǎn)品的重金屬污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)貝類、甲殼類中重金屬的含量遠高于魚類[8-10]。對蝦蛄的質(zhì)量安全研究發(fā)現(xiàn)，蝦蛄可食組織中鎘的含量較高，超標非常嚴重[11-12]。鎘等有害元素成為影響蝦蛄食用安全的關鍵因素，近幾年，諸多有關蝦蛄“鎘污染”的新聞、媒體負面報道也給消費者與生產(chǎn)者帶來不良的經(jīng)濟和社會影響。砷是一種有毒有害的非金屬元素，廣泛存在于自然界中。海產(chǎn)品中含有大量不同形態(tài)的砷[13-14]，人們在食用含砷的海產(chǎn)品時，砷在人體內(nèi)易發(fā)生富集對人體的生命健康造成一定威脅。世界衛(wèi)生組織和美國環(huán)保局將砷定級為“已知的人類致癌物質(zhì)”[15]。由于水生生物對鎘、砷等有害元素的強富集性，使得原本提供豐富優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的水產(chǎn)品成為有毒有害元素進入人體的橋梁。

鎘、砷的毒性與它的化學形態(tài)有關，因此，對蝦蛄中鎘、砷的檢測與食用安全評估不能僅以有害元素的總量作為評價標準。蝦蛄可食組織主要包括性腺和肌肉，尤其是性成熟時期的蝦蛄產(chǎn)品更受消費者青睞，但截至目前針對可食組織中鎘、砷的分布特征及其形態(tài)研究較少，因此，本研究擬運用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）技術以及高效液相色譜-ICP-MS（high performance liquid chromatography-ICP-MS，HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術分析測定蝦蛄可食組織中鎘、砷的分布特征及其形態(tài)，以期為蝦蛄中鎘、砷的食用安全評估提供一定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

性成熟的海捕野生蝦蛄于2018年5月隨機采集于山東青島沿海主要碼頭（2 份雄性，3 份雌性）和遼寧大連水產(chǎn)品批發(fā)市場（4 份雄性，2 份雌性），每份樣品約1 000 g。

草酸、無水氫氧化鋰、無水乙酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉（均為優(yōu)級純） 國藥集團化學試劑有限公司；濃硝酸（優(yōu)級純） 上海泰坦科技股份有限公司。

砷酸根標準溶液（As（III），GBW 08666）、亞砷酸根標準溶液（As（V），GBW 08667）、砷甜菜堿標準溶液（AsB，GBW 08670）、一甲基砷標準溶液（monomethylarsonic acid，MMA，GBW 08668）、二甲基砷標準溶液（dimethylarsinic acid，DMA，GBW 08669）、無機鎘離子標準溶液（Cd2＋，GBW 08612）國家標準物質(zhì)中心。

1.2 儀器與設備

Elan DRC II ICP-MS儀、HPLC-ICP-MS聯(lián)用儀 美國Perkin Elmer公司；Mars 6密閉微波消解儀 美國CEM公司；MS3旋渦混勻儀 德國IKA公司；Neofuge 15臺式高速離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

蝦蛄樣品去殼和頭后，取出可食用組織，包括性腺（雌和雄）和肌肉，分別勻漿后待用。

1.3.2 蝦蛄可食組織中無機態(tài)鎘離子的測定

蝦蛄可食組織中無機鎘的測定采用HPLC-ICP-MS方法[16]，液相色譜分離選用Dionex IonPac CS5A（4 mm×250 mm）陽離子交換色譜柱及保護柱CG5A（4 mm×50 mm）；流動相組成為50 mmol/L草酸、95 mmol/L氫氧化鋰（pH 4.8）溶液，使用前經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾并超聲脫氣15 min。稱取1.000 g蝦蛄可食組織置于50 mL塑料刻度離心管中，加入15 mL浸提液，浸提液組成為10 mmol/L Tris緩沖溶液與0.1 mol/L NaCl混合液（pH 7.5），均質(zhì)機混勻后，超聲提取40 min，8 000 r/min離心10 min，取出上清液用0.45 μm的水系微孔濾膜過濾，移入進樣瓶中，上機測定無機鎘離子的值。

1.3.3 蝦蛄可食組織中砷的形態(tài)分析

參考GB/T 23372—2009《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[17]，采用HPLCICP-MS聯(lián)用技術。液相色譜柱為陰離子保護柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm）和陰離子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4 mm）；流動相：A相組成為10 mmol/L無水乙酸鈉、3 mmol/L硝酸鉀、2 mmol/L磷酸二氫鈉，0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、4%氫氧化鈉調(diào)pH 10.7溶液，B相組成為無水乙醇，A-B（9∶1，V/V）。取蝦蛄可食組織約1.000 g，加入15 mL超純水，渦旋混勻后，超聲提取40 min，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，吸取上清液過0.45 μm濾膜，濾液注入HPLC-ICP-MS聯(lián)用儀對AsB、As（III）、As（V）、MMA和DMA不同形態(tài)的砷進行定性和定量分析。

1.3.4 蝦蛄可食組織中總鎘和總砷含量檢測

樣品中總鎘和總砷的含量采用ICP-MS測定。準確稱取1.000 g樣品于微波消解罐中，加入8 mL濃HNO3浸泡24 h后，采用微波消解儀進行消解和趕酸，程序見表1。冷卻至室溫后，用超純水定容至25 mL，混勻備測，同時做空白實驗。

表 1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedures

采用ICP-MS測定消化液中總鎘和總砷的含量，測定過程中在線加入10 ng/mL103Rh為內(nèi)標元素用于校正儀器響應信號的變化。ICP-MS儀器條件：射頻功率1 500 W、射頻電壓1.20 V、等離子體氣流量15 L/min、載氣流量0.92 L/min、重復3 次。以待測元素質(zhì)量濃度為橫坐標，待測元素與103Rh響應信號值的比值為縱坐標，繪制標準曲線。選擇生物成分分析標準物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024為質(zhì)控樣品保證鎘和砷檢測的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果用 ±s表示，采用SPSS 13.0進行相關性分析，P＜0.05，差異顯著，采用Sigma Plot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦蛄可食組織中總鎘及無機鎘的分布特征

表 2 質(zhì)控標準物質(zhì)中總鎘含量（n=3）Table 2 Total cadmium concentration in certified reference materials (n= 3)

表 3 蝦蛄可食組織中總鎘和無機鎘的含量（n=3）Table 3 Contents of total cadmium and inorganic Cd2+ in the edible tissues of O. oratoria (n= 3)

采用本實驗方法測定質(zhì)控標準物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024中鎘的含量見表2，2 種標準物質(zhì)的實測值均在標準值范圍內(nèi)，且相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均較低，說明本方法測定樣品中鎘的含量準確度高、精密度好。

分別對雌、雄蝦蛄肌肉與性腺組織中的總鎘含量進行分析可見，蝦蛄可食組織中總鎘的含量較高，且性腺中總鎘的含量遠高于肌肉組織（表3）。樣品性腺中鎘最高含量為44.2 mg/kg，約為肌肉組織的10 倍。肌肉組織中鎘的最低含量為1.62 mg/kg，遠超出現(xiàn)行國家標準限量值（0.5 mg/kg）的范圍。另外，研究表明總鎘含量與蝦蛄的雌雄性別無明顯相關關系。

圖 1 HPLC-ICP-MS分析蝦蛄可食組織中無機鎘離子譜圖Fig. 1 Chromatograms of Cd2+ in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

從圖1可見，性腺中無機鎘離子含量遠高于肌肉組織。對所有樣品中無機鎘離子含量進行測定發(fā)現(xiàn)（表3），大部分樣品無機離子態(tài)鎘占總鎘百分比的20%以下，相關性分析發(fā)現(xiàn)所有組織中無機鎘含量與總鎘含量之間呈顯著正相關關系（P＜0.001），即總鎘含量越高的樣品或組織中其無機鎘含量也較高。所有肌肉組織中無機鎘含量均遠低于1.0 mg/kg，11 份樣品中，有7 份樣品肌肉組織中無機鎘含量低于0.50 mg/kg，而性腺中無機鎘含量較高，均超出1.0 mg/kg。

2.2 蝦蛄不同組織中總砷及砷形態(tài)的含量分布特征

表 4 質(zhì)控標準物質(zhì)中總砷含量（n=3）Table 4 Total arsenic concentration in certified reference materials (n= 3)

質(zhì)控標準物質(zhì)大蝦GBW1050和扇貝GBW10024中總砷的含量分析見表4，標準物質(zhì)的實測值在標準值范圍內(nèi)，且RSD較低，說明本研究采用的ICP-MS法測定水產(chǎn)品中總砷的含量準確度高、精密度好，適合于蝦蛄中總砷的測定。

對蝦蛄不同組織中總砷及4 種主要有毒砷形態(tài)的含量分析見表5。蝦蛄中總砷含量較高，且性腺中總砷含量普遍高于肌肉組織，但與雌雄性別無明顯相關關系。

表 5 蝦蛄可食組織中總砷和4 種主要砷形態(tài)含量（n=3）Table 5 Concentrations of total arsenic and four arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria (n= 3) mg/kg

圖 2 HPLC-ICP-MS砷形態(tài)分析譜圖Fig. 2 Chromatograms of different arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術可以很好地分離蝦蛄組織中As的5 種不同形態(tài)（圖2）。對蝦蛄不同組織中砷形態(tài)進行分析可見，所有蝦蛄樣品中均檢出As（III）和As（V），其中肌肉組織中無機砷的含量最高，為0.46 mg/kg，性腺中無機砷的含量最高，為1.04 mg/kg。相關性分析得出所有樣品各可食組織中無機砷的含量與總砷之間無顯著相關關系（P＞0.05）。肌肉組織中無機砷占總砷百分比非常低，范圍為1.71%～6.14%。除無機砷外，還從部分樣品中檢出少量的MMA和DMA。有機砷形態(tài)AsB是蝦蛄所有可食組織中的主要砷形態(tài)，其占總砷的75.0%～95.7%，平均值為88.1%。

3 討 論

水生生物極易富集環(huán)境中的鎘，如貝類可富集105～106倍，且鎘可沿食物鏈轉(zhuǎn)移蓄積[18]，本研究結(jié)果表明蝦蛄對鎘具有較強的富集能力。蝦蛄中鎘的含量較高已有報道[12]，但針對可食組織中鎘的分布特征鮮見報道。本研究通過分析可食組織中鎘的分布特征，發(fā)現(xiàn)肌肉組織中鎘的含量遠低于可食的性腺組織，但是按照現(xiàn)行GB 2762—2017《食品中污染物限量》中針對甲殼類中鎘的限量要求為0.5 mg/kg，在本實驗中采集的蝦蛄樣品肌肉組織中鎘的超標率為100%。鎘離子進入生物體內(nèi)可以與蛋白質(zhì)、有機酸等結(jié)合成比較穩(wěn)定的有機鎘形態(tài)存在，只有少部分的鎘在體內(nèi)以無機離子態(tài)存在[19]。研究表明與蛋白結(jié)合的鎘（即有機態(tài)鎘）對細胞毒性明顯低于無機離子態(tài)的鎘[20]，因此若簡單地僅分析鎘的總含量，并以其離子態(tài)的毒性效應作為評價標準會高估其毒害效應。課題組在前期運用體積排阻色譜-HPLC-ICP-MS分析了蝦蛄肌肉組織中鎘的有機形態(tài)主要以鎘-金屬硫蛋白形態(tài)存在[21]，本研究在此基礎上，進一步采用HPLCICP-MS技術分析可食肌肉組織與性腺組織中無機離子態(tài)鎘的含量，該方法采用中性鹽緩沖體系為浸提液，能夠最大可能保持蝦蛄組織中鎘的原始形態(tài)不變，通過陽離子交換色譜柱的吸附洗脫完成對無機離子態(tài)鎘的分離和測定[16]，分析結(jié)果表明肌肉組織與性腺組織中無機離子態(tài)鎘的含量較低，且無機離子態(tài)鎘占總鎘的質(zhì)量百分數(shù)較低，進一步表明鎘主要以有機形態(tài)存在于蝦蛄可食組織中。

本研究表明按照GB 2762—2017《食品中污染物限量》中甲殼類重金屬鎘的限量要求，蝦蛄可食組織中鎘的超標情況比較嚴重。截止目前，關于甲殼類中重金屬鎘的安全限量值，不同國家有自己不同的標準，如歐盟限定甲殼類動物鎘限量值為0.5 mg/kg，美國限定甲殼類中鎘限量值為3.0 mg/kg，韓國限量值為2.0 mg/kg[22]，由此可見，我國的標準限量值相對比較嚴格。針對蝦蛄這種具有高富集鎘特性的甲殼類品種，開展鎘的標準限量再評價，制定一個更為科學合理的標準限量值更具意義。本研究結(jié)果證明了蝦蛄可食組織中毒性最高的無機離子態(tài)鎘含量較低，下一步的重點工作應在鎘形態(tài)分析的研究基礎上，聚焦鎘的生物利用率即探究蝦蛄中鎘的內(nèi)暴露劑量（被機體攝入后經(jīng)過消化、吸收而達到組織產(chǎn)生毒性作用的劑量），因為基于污染物內(nèi)暴露劑量進行的膳食暴露評估結(jié)果制定的限量標準值才更科學、更合理[23]。

魚類、甲殼類和貝類等水產(chǎn)品是人類膳食優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來源之一，同時也是人體攝入砷的一種重要來源，研究表明人們?nèi)粘ｏ嬍持屑s90%的砷來自于水產(chǎn)品[24]。本研究發(fā)現(xiàn)蝦蛄可食組織中總砷含量較高，肌肉組織與性腺中總砷的含量分別與已報道的具有較強砷富集能力的三疣梭子蟹肌肉與性腺中的含量相近[25]，說明蝦蛄對砷具有較高的富集能力。砷的形態(tài)分析表明蝦蛄可食組織中含有多種不同形態(tài)的砷。國際癌癥研究中心確認無機砷及其化合物為I級致癌物質(zhì)，MMA和DMA被歸為潛在的致癌物質(zhì)[26]。As（III）是毒性最強的砷化合物，進入人體后，能與人體內(nèi)帶巰基的酶蛋白結(jié)合，干擾細胞的生物功能、結(jié)構(gòu)和正常代謝，產(chǎn)生毒性效應，As（V）主要是取代磷酸，競爭磷酸化偶聯(lián)而產(chǎn)生毒性，DMA和MMA在酶的作用下會脫去甲基形成自由基，促使脂質(zhì)氧化，損害膜細胞[27]。蝦蛄可食組織中無機砷的檢出率較高，在所采集的樣品中，肌肉組織中無機砷的檢出率為100%，但是其含量均未超出國家標準GB 2762—2017中無機砷的限量要求（0.5 mg/kg），且無機砷占總砷的百分含量非常低。雖然有一個樣品的性腺組織中無機砷的含量超出了限量要求，但是由于性腺占可食部分的質(zhì)量百分比非常低，因此對蝦蛄可食組織的無機砷風險影響極低。另外，在可食組織中也檢出了低量的DMA和MMA，且其分布沒有明顯的雌雄差異和組織差異。雖然蝦蛄可食組織中存在一定量的無機砷、DMA和MMA，但是通過圖2也可見，大分子的有機砷化合物（AsB）是蝦蛄可食組織中主要的砷形態(tài)。DMA是海洋生物中最主要的甲基砷化合物，而MMA含量較少，AsB是海洋生物中最主要的水溶性砷形態(tài)[28]。研究表明AsB化學性質(zhì)穩(wěn)定、無毒。在人體和其他哺乳動物中未發(fā)生轉(zhuǎn)化便被排泄出體外，體外細胞實驗證明AsB不能使哺乳動物細胞發(fā)生誘導突變，無細胞毒性、免疫毒性和生殖毒性，常被視為無毒的有機砷形態(tài)[29]，因此考察蝦蛄中砷含量危害時，應該考慮砷存在形態(tài)問題。