范盈盈，胡東強，張銳利，李曉龍，何偉忠，華震宇，李 靜，武愛波，王 成

（1.新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；3.中國科學院營養(yǎng)代謝與食品安全重點實驗室，中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所，中國科學院上海生命科學研究院，中國科學院大學，上海 200031；4.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；5.昌吉州農產品質量安全中心，新疆 昌吉 831100；6.新疆農業(yè)科學院科研管理處，新疆 烏魯木齊 830091）

紅棗（Ziziphus jujubaMill.）富含果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖，以及鉀、磷、鈣、錳、酚類、黃酮類、三萜酸、氨基酸等營養(yǎng)物質，是一種廣受國內外消費者歡迎的藥食同源的果品[1]。中國是世界上最大的紅棗生產國和消費國，而新疆紅棗年產量300多萬 t[2]，占全國的30%以上，居全國首位[3]。新疆紅棗的品種按產量分主要有駿棗、灰棗和哈密大棗，其中駿棗呈橢圓形，個大，皮薄，口感偏酸，主要種植在南疆環(huán)塔里木盆地的阿克蘇、喀什、和田等地州；灰棗個小，果肉密實，味甜，主要種植在南疆巴音郭楞蒙古自治州的若羌、庫車等地；哈密大棗呈圓形，大小介于駿棗和灰棗之間，主要種植在東疆的哈密地區(qū)。目前，紅棗產業(yè)是新疆經濟發(fā)展的重要支柱產業(yè)之一，也是最具資源優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Φ漠a業(yè)[4]。然而，自2010年以來，“黑斑病”已成為危害新疆紅棗最大的病害，造成平均產量損失超過30%，嚴重時超過50%[5-6]。

黑斑病不僅給新疆的支柱產業(yè)帶來產量損失，而且給采后果品的營養(yǎng)和品質造成了巨大影響。正常紅棗果肉的顏色在生長期是從青色到暗紅色，而黑斑病紅棗感病部位的果肉顏色則是從淡紅色到黑色。紅棗感病部位肉質堅硬、腐爛、有澀味，不同于正常紅棗的軟和甜味。許瑛等[7]發(fā)現(xiàn)，與健康棗果相比，發(fā)病‘駿棗’鮮果在硬度、質量、含水量、亮度、色差等外觀品質明顯下降；VC、蛋白質、含糖量、可滴定酸等內在品質均明顯下降。

黑斑病的主要致病菌為鏈格孢霉菌，侵染紅棗后可產生鏈格孢毒素。鏈格孢毒素具有致畸、致癌、致突變作用，主要包括騰毒素（tentoxin，TEN）、細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）、鏈格孢酚甲基醚（alternariol monomethyl ether，AME）等，其中TeA毒性最強，AOH和AME具有急性毒性且可顯示協(xié)同效應[8]。

目前，僅有國內學者對新疆棗果黑斑病有研究，主要集中在黑斑病的危害分布[9-10]、病原鑒定[11-12]、發(fā)生規(guī)律[13-14]以及防治[15-16]等方面，而紅棗感染黑斑病后的品質變化、毒素產生情況、食用安全性方面的研究則很少。本研究以南疆不同地區(qū)棗園中采集的健康紅棗和黑斑病紅棗為研究對象，通過對其內在品質指標，如糖類、氨基酸、總酸、總糖、還原糖、蛋白質、礦物質元素及主要鏈格孢毒素進行檢測分析，最終找到病害棗果變化顯著的代謝物因子，以期為全面研究黑斑病對南疆紅棗的代謝組學研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年紅棗成熟期分別在阿克蘇、喀什、和田等地區(qū)的7 個縣市棗園的不同方位隨機采集100 粒黑斑病駿棗（至少含有1 個黑斑病斑）和100 粒健康駿棗（無病斑），分別去核混勻后，加入液氮，用刀式研磨儀打碎，-20 ℃冷凍保存，用于后續(xù)棗果營養(yǎng)成分和鏈格孢毒素的含量測定，每個實驗重復3 次，結果取平均值。

果糖、葡萄糖、蔗糖標準品 美國Sigma-Aldrich試劑公司；銅、鉀、鋅、鐵、錳、鎂、鋅、鈣標準品 國家標準物質中心；17 種氨基酸混合標準溶液 德國賽卡姆公司；4 種鏈格孢毒素標準品 奧地利Romer公司；乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸（均為分析純） 北京北化精細化學品有限責任公司；茚三酮 上海三愛思公司；苯酚、鹽酸（均為分析純） 廣東光華化學有限公司；硝酸、過氧化氫（均為優(yōu)級純） 德國Merk試劑公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜級） 美國Fisher試劑公司。

1.2 儀器與設備

HM100型刀式研磨儀 北京格瑞德曼儀器設備有限公司；8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；BSA223S型電子天平 德國賽多利斯公司；Mars型微波消解儀 美國CEM公司；900F型原子吸收分光光度計美國PE公司；AFS0820型原子熒光分光光度計 北京吉天儀器有限公司；LS-5型熒光分光光度計、UPLCTQD型超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀 美國Waters公司；1260 INFINITY型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；S-433D型氨基酸分析儀 德國SYLM公司；TYE-100型真空干燥濃縮儀 東京理化器械株式會社；WX-2型真空泵臺州市楓江創(chuàng)新電機廠。

1.3 方法

棗果葡萄糖、果糖和蔗糖含量測定：參考GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定 高效液相色譜法》；還原糖含量測定：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》，采用直接滴定法；17 種氨基酸含量測定：參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸全自動分析儀測定；總酸含量測定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿中和滴定法；蛋白質含量測定：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》，采用凱氏定氮法；礦物質元素Fe、Mg、Mn、Ca含量測定：參考GB/T 5009.90—2003《食品中鐵、鎂、錳的測定》和GB/T 5009.92—2003《食品中鈣的測定》，采用原子吸收分光光度法；Cu含量測定：參考GB/T 5009.13—2003《食品中銅的測定》，采用火焰原子吸收光譜法；K含量測定：參考GB/T 5009.91—2003《食品中鉀、鈉的測定》，采用火焰發(fā)生光譜法。

鏈格孢毒素（AOH、AME、TEN、TeA）的檢測方法參考文獻[17]。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel建立數(shù)據系統(tǒng)，用SPSS軟件進行顯著性差異分析，用SIMCA-P軟件進行主成分分析和營養(yǎng)分析評價。

2 結果與分析

2.1 黑斑病對紅棗中礦物質元素的影響

圖 1 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類礦物質元素含量變化率Fig. 1 Changes in contents of mineral elements in infected jujubes as compared with healthy ones

如圖1所示，通過檢測來自7 個棗園中的健康紅棗和黑斑病棗中的7 種礦物質元素，發(fā)現(xiàn)同一個棗園黑斑病紅棗中的礦物質元素含量相比于健康紅棗中的含量分別減少了2.4%～28.7%（Ca）、3.1%～43.0%（Cu）、3.97%～12.73%（Fe）、1.1%～21.9%（K）、2.4%～27.3%（Mg）、1.5%～38.2%（Mn）、7.9%～66.9%（Zn），而且通過配對樣本t檢驗分析，黑斑病紅棗和健康紅棗中這7 種礦物質在95%的置信區(qū)間內變化顯著（P值為0.017～0.046，均小于0.05）。其中，K、Ca、Mg為紅棗中含量較高的礦物質元素（＞100 mg/kg）[18]，其在黑斑病棗中的流失情況低于Zn、Mn、Cu等微量元素（＜10 mg/kg）。

2.2 黑斑病對紅棗中氨基酸含量的影響

圖 2 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類氨基酸含量變化率Fig. 2 Changes in contents of amino acids in infected jujubes as compared with healthy ones

如圖2所示，通過檢測健康紅棗和黑斑病紅棗中17 種氨基酸的含量發(fā)現(xiàn)，相比于健康紅棗，黑斑病棗中的脯氨酸和天冬氨酸含量顯著降低（配對檢驗P值為0.003～0.008，小于0.05），谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸含量顯著升高（配對檢驗P值為0.001～0.033，小于0.05），胱氨酸含量降低不顯著（配對檢驗P值為0.322，大于0.05），亮氨酸、絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸含量升高但不顯著（配對檢驗P值為0.092～0.304，大于0.05）。其中苦味氨基酸（Leu、Lys、Arg、Val、His、Phe、Iie、Tyr）含量均升高含量，而含量最高的氨基酸（Pro）為甜味氨基酸，其在病棗中的含量顯著降低，這與紅棗在發(fā)病過程中果肉變質發(fā)苦有很大關系[19]。

2.3 黑斑病對紅棗中其他營養(yǎng)成分含量的影響

如圖3所示，同一個棗園黑斑病紅棗中的其他營養(yǎng)成分含量相比于健康紅棗中的含量分別減少7.4%～38.9%（總糖）、4.6%～51.4%（還原糖）、8.8%～35.7%（果糖）、47.5%～100%（蔗糖）、5.6%～47.5%（水溶性蛋白質）、3.1%～46.6%（總酸），然而葡萄糖含量升高了10.0%～81.8%，根據配對檢驗結果（P值為0.004～0.034，小于0.05）發(fā)現(xiàn)這7 項營養(yǎng)指標均為顯著性變化。這是由于駿棗感染病害后，呼吸作用增強，增加了貯藏物質的糖消耗，尤其是二元糖——蔗糖的消耗（在部分黑斑病棗中未檢測到蔗糖），因而可能造成葡萄糖含量升高、總糖含量降低[20]。

圖 3 病棗樣品相比與健康紅棗中不同種類營養(yǎng)成分含量變化率Fig. 3 Changes in contents of nutritional components in infected jujubes as compared with healthy ones

2.4 黑斑病對紅棗中鏈格孢毒素含量的影響

表 1 不同棗園中健康紅棗和黑斑病棗樣品中鏈格孢毒素的含量Table 1 Contents of Alternaria toxins in infected and healthy jujubes from different orchardsmg/kg

從表1可以看出，TeA在所有樣品中均檢出，而且檢出含量隨著黑斑病感染程度而變化：健康棗（0.161 2～3.839 7 mg/kg）＜病棗（3.105 0～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在大部分的健康紅棗中都未檢出或者低于LOQ，病棗中的檢出含量范圍分別為0.019 6～0.102 7 mg/kg、＜LOQ～1.551 7 mg/kg和＜LOQ～0.029 1 mg/kg。健康棗在運輸、保存、處理過程中可能受到病棗污染，因此有少量鏈格孢毒素檢出。何麗等[21]在不同病級發(fā)病棗果中也均檢出TeA、AME和AOH，其中TeA檢出含量最高，可達3 102.27 mg/kg。

2.5 黑斑病對紅棗中營養(yǎng)成分的整體影響

同一棗園中的健康紅棗和黑斑病棗的營養(yǎng)品質具有一定的差異性，利用測定的營養(yǎng)品質參數(shù)，嘗試構建判別模型，判別紅棗是否已感染黑斑病。將測定的來自7 個不同棗園中的健康紅棗和黑斑病棗的31 個營養(yǎng)指標和4 個鏈格孢毒素構成為14×35的數(shù)據矩陣。利用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法[22-23]，挖掘差異特征信息，提取特征因子，構建紅棗感病判別模型。如圖4a所示，7 個健康紅棗和7 個黑斑病棗在前2 個潛變量空間的投影可以明顯區(qū)分。如圖4b所示，AOH、ASP、TeA對第1個潛變量具有較大貢獻，而蛋白質、Mg、Ser對第2潛變量具有較大貢獻。如圖4c所示，AOH、Asp、Met、TeA、Lys等是紅棗PLS-DA發(fā)病判別模型最主要的特征變量（VIP值＞1）。

圖 4 基于PLS-DA的健康紅棗和黑斑病棗的判別模型Fig. 4 PLS-DA based identification model for infected versus healthy jujubes

3 討論與結論

由于駿棗皮薄、肉質疏松，并且矮化密植、惡劣天氣等因素，特別容易受到鏈格孢霉菌侵染，從而易得黑斑病[24]。白劍宇等[25]以3 種不同栽培模式的不同黑斑病發(fā)病程度的駿棗為研究對象，檢測10 種主要營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)總糖、還原糖、蔗糖、黃酮、VC、Ca、P、Fe、Zn等營養(yǎng)成分的含量與棗黑斑病危害級別呈負相關。許瑛等[7]對不同黑斑病發(fā)病程度的駿棗和灰棗進行外觀及內在品質指標測定，發(fā)現(xiàn)2 種病棗中的VC、蛋白質、含糖量、可滴定酸等含量均明顯下降，而且在2 種病棗中均檢測到TeA、AME和AOH這3 種鏈格孢毒素。本課題組[26]曾對3 種紅棗（哈密大棗、和田駿棗和若羌灰棗）接種黑斑病病原菌——鏈格孢菌（Alternaria alternata）和細極鏈格孢菌（A. tenuissima），用超高效液相色譜-離子阱軌道-高分辨質譜進行代謝物篩查，發(fā)現(xiàn)感染了病原菌的棗果中有4 種皂苷、3 種有機酸、3 種生物堿含量顯著下降，鏈格孢毒素TeA和AOH顯著升高。

本研究采集的紅棗主要來自阿克蘇、和田兩地兵團的7 個連隊棗園的矮化密植的駿棗。經過檢測健康紅棗和黑斑病棗中的7 種礦物質元素、17 種氨基酸、3 種糖類、總酸、總糖、蛋白質、還原糖等31 項指標發(fā)現(xiàn)：1）病棗中所檢測的7 種礦物質元素含量顯著下降，說明果實在病變過程中礦物質元素均有不同程度的流失[27]，且K、Ca、Mg等紅棗中含量較高的礦物質元素在黑斑病棗中的流失情況低于Zn、Mn、Cu等微量元素。相關文獻報道[28]棗果中的Ca含量與裂果密切相關，而裂果也是紅棗黑斑病的誘因之一。2）相比于健康紅棗，黑斑病棗中的一些苦味氨基酸含量（Val、Iie、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg）均升高，甜味氨基酸含量（Pro）顯著降低，這與紅棗在發(fā)病過程中果肉變質發(fā)苦有關。3）紅棗感染黑斑病后，果糖、葡萄糖、蔗糖、還原糖、總糖、總酸、水溶性蛋白質等明顯降低，這是由于駿棗感染病害后，呼吸作用增強，增加了貯藏物質的糖消耗，因而糖含量降低。4）毒性最強的TeA在所有的樣品中均檢出，且含量最高，其在健康棗中檢出含量（0.161 2～3.839 7 mg/kg）顯著低于黑斑病棗（3.105～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在所有的健康紅棗中都未檢出或者低于定量限，在病棗中的檢出量較低。5）通過主成分分析發(fā)現(xiàn)AOH、Asp、Met、TeA和Lys為主要判別健康紅棗和病棗的區(qū)分因子。由此可以猜測黑斑病中鏈格孢毒素AOH和TeA的生物合成[29-30]可能與氨基酸Asp、Met和Lys有關。

綜上所述，新疆紅棗感染黑斑病后，多種營養(yǎng)成分發(fā)生顯著變化，并主要產生有毒代謝產物——鏈格孢毒素，其中健康紅棗和黑斑病棗的5 個主要區(qū)分因子中，AOH和TeA為有毒代謝產物，Asp、Met和Lys為主要營養(yǎng)成分，推測這5 個因子可能存在一定的代謝關系，具體代謝途徑還有待于后期的實驗驗證。本研究結果可為闡釋新疆紅棗黑斑病變過程中鏈格孢毒素的產生機理提供理論依據。