陳桂柳，盧靖，李嘉穎，江嘉敏，林夢哲，陳穎琪，張宏梅

(廣東工業(yè)大學 生物工程系，廣州 510006)

食源性微生物引起的疾病是全球食品安全的核心問題[1]。食源致病菌可以通過復雜的生產(chǎn)、流通、儲存等環(huán)節(jié)進入到食品中，對消費者的健康產(chǎn)生極大的威脅，當前許多科學研究者致力于探索其解決辦法[2]。生物被膜是指微生物吸附于惰性物體表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白和DNA等胞外基質(zhì)(extracellular polymeric substances，EPS)，相互粘連并將其菌落聚集纏繞其中形成的膜樣物，是微生物為適應(yīng)脅迫環(huán)境所形成有利于生存的一種特殊生長狀態(tài)[3]。以往的科學實驗研究中，人們往往關(guān)注的是游離態(tài)致病菌的特征及其控制方法。事實上，自然界中的微生物大部分以生物被膜態(tài)形式存在。相對于浮游態(tài)菌體，生物被膜菌體對熱、消毒劑以及紫外等滅菌方式產(chǎn)生很強的抗性，徹底清除該致病菌已然成為一個難點，當前還沒有研究出一種可以完全抑制或完全清除殺滅的方法，致使食品交叉污染和周期污染問題頻繁發(fā)生[4]。

近年來隨著消費者對食品加工中采用天然有效并具有安全保障的食品防腐劑的需求增加，相關(guān)人員也不斷地從各種傳統(tǒng)食品中尋找天然抗菌防腐成分以滿足食品工業(yè)的需求[5,6]。肉桂醛和龍腦是國家批準作為香味用途的食品添加劑，已有報道顯示其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等致病菌具有一定的抑制作用，但是在目前的文獻資料中，對于游離態(tài)和生物被膜態(tài)的食源致病菌的抑制作用則鮮有報道[7,8]。因此，本研究擬以天然產(chǎn)物右旋龍腦和肉桂醛為抑菌劑，分析其對游離態(tài)和生物被膜態(tài)的單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌特性，為探索天然產(chǎn)物中安全、有效的抑菌劑提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑

單核增生李斯特菌(L.monocytogenesATCC 13932)、鼠傷寒沙門氏菌 (SalmonellatyphimuriumATCC 14028)：均由廣東工業(yè)大學生物工程實驗室提供，保存于-80 ℃。

右旋龍腦：華南理工大學輕工與食品學院蘇建裕實驗室提供；肉桂醛：阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PALCAM瓊脂以及木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶劑無水乙醇殺菌效果的研究

將上述菌種各10 μL接種于TSB培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。將菌液濃度調(diào)為OD630為0.8(菌體濃度大約為9 log CFU/mL)。將活化好的兩種菌液按1∶1混合。配制無水乙醇和TSB培養(yǎng)基比例分別為1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22的混合液。以TSB培養(yǎng)基為空白對照。吸取2 mL上述溶液于試管中，混合均勻后接種單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌及其混合菌各5 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。PALCAM瓊脂和XLD瓊脂分別對單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌進行計數(shù)[9,10]。以乙醇濃度不影響菌體生長的濃度為合適乙醇濃度。

1.2.2 右旋龍腦和肉桂醛單獨以及混合添加對游離態(tài)食源致病菌的最低抑菌濃度的測定

浮游態(tài)菌體最低抑菌濃度采用改良的臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的肉湯微稀釋法測定[11]。用0.22 μm濾膜過濾右旋龍腦溶液后將其與TSB培養(yǎng)基按1∶21的體積比進行混合，使右旋龍腦溶液的終濃度為0.60，0.58，0.56，0.54 mg/mL。參照Rode等[12]的辦法，吸取不同濃度的右旋龍腦溶液200 μL于96孔板中，按1∶100的比例分別加入2 μL上述3種菌液。設(shè)定右旋龍腦濃度為0的加菌液的孔和只含右旋龍腦的TSB培養(yǎng)基的孔作為對照。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用酶標儀測定OD630值。

配制終濃度為1.60，0.80，0.40，0.20 μL/mL的肉桂醛溶液，測定OD630值。

配制終濃度為0.50 mg/mL的右旋龍腦，0.40 mg/mL的右旋龍腦。0.40 μL/mL的肉桂醛，0.30 μL/mL的肉桂醛，0.50 mg/mL的右旋龍腦和0.40 μL/mL的肉桂醛，0.40 mg/mL的右旋龍腦和0.30 μL/mL的肉桂醛，添加等量的無水乙醇做空白對照組。用PALCAM瓊脂和XLD瓊脂進行計數(shù)。

1.2.3 右旋龍腦和肉桂醛協(xié)同作用下對生物被膜態(tài)菌體最低抑菌濃度的測定

參照Azeredo等[13]的研究，在裝有2 mL TSB培養(yǎng)基的4支試管中，分別接種上述3種菌液各5 μL，其中一支試管不加任何菌液作為空白組。在37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，以形成成熟的生物被膜。

在4支試管中配制濃度為2.50 mg/mL的右旋龍腦和2.00 μL/mL的肉桂醛，2.00 mg/mL的右旋龍腦和1.60 μL/mL的肉桂醛，1.50 mg/mL的右旋龍腦和1.20 μL/mL的肉桂醛，添加等量的無水乙醇作為空白對照組。48 h后，小心移去上層菌液，避免破壞生物被膜。沿試管壁添加100 μL無菌水清洗2次。然后吸取上述藥物各200 μL添加到試管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。24 h后，小心移去上層菌液。向試管加入200 μL TSB。密封處理后放到80 Hz的數(shù)控超聲清洗器超聲15 min。吸取菌液于試管后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h后用PALCAM瓊脂和XLD瓊脂進行計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組試驗均重復3次，采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑無水乙醇殺菌效果的研究

右旋龍腦與肉桂醛都是難溶于水但溶于無水乙醇的物質(zhì)。無水乙醇本身就對微生物有殺傷菌體作用,因此需要找到既能溶解右旋龍腦和肉桂醛又能不抑制微生物生長的劑量。

表1 不同無水乙醇比例的殺菌效果Table 1 Bactericidal effect of different proportions of anhydrous ethanol

注：“+”表示平板內(nèi)有1～100個肉眼可見的菌落，“++”表示有100～200個肉眼可見的菌落，“+++”表示有200～400個肉眼可見的菌落，“++++”表示存在400 個以上肉眼可見的菌落，“-”表示沒有肉眼可見的菌落。

由表1可知，當比例為1∶20時，它們的生長受到抑制。當比例為1∶21時，右旋龍腦與肉桂醛可以在這個體系充分溶解并且菌體的生長開始不受到影響。

綜上所述，在無水乙醇與TSB的比例為1∶21時，乙醇的滅菌作用可以忽略不計，并且這時右旋龍腦與肉桂醛可以在這個體系充分溶解。

2.2 右旋龍腦對游離態(tài)菌體最低抑菌濃度的測定

表2 單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌及混合菌的OD630值Table 2 OD630 values of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

由表2可知，由不加右旋龍腦時的OD630值可知3種菌在不加右旋龍腦時都能正常生長。右旋龍腦濃度為0.54～0.60 mg/mL時，3種菌的OD630值都有明顯的減少，說明右旋龍腦對3種菌的生長均有抑制作用。李振等[14]的研究以南北五味子對沙門氏菌的MIC分別為62.5，31.3 mg/mL，說明南北五味子對沙門氏菌具有抑菌作用?？梢姡狙芯恐杏倚埬X具有更強的抑菌效果。

對于單核增生李斯特菌而言，當右旋龍腦濃度為0.56 mg/mL時，其OD630值為0.094，對于鼠傷寒沙門氏菌來說，當右旋龍腦濃度為0.58 mg/mL時，其OD630值為0.074；對于混合菌來說，當右旋龍腦濃度為0.60 mg/mL時，其OD630值為0.082，均與陰性對照接近，綜上所述，用選擇培養(yǎng)基進行驗證后確定，右旋龍腦對單核增生李斯特菌的MIPC為0.56 mg/mL，對鼠傷寒沙門氏菌的MIPC為0.58 mg/mL，對混合菌的MIPC為0.60 mg/mL。結(jié)果表明右旋龍腦對單核增生李斯特菌的抑制效果強于對鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果，還顯示當兩種菌混合培養(yǎng)時，其對右旋龍腦產(chǎn)生的抗性比單一菌培養(yǎng)產(chǎn)生的抗性要強,說明混合菌體比單一菌體具有更強的適應(yīng)性，這和已有報道一致[15]。

2.3 肉桂醛對游離態(tài)菌體最低抑菌濃度的測定

表3 單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌及混合菌的OD630值Table 3 OD630 values of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

由表3可知，當肉桂醛濃度為0.40 μL/mL時，單核增生李斯特菌的OD630是0.088，鼠傷寒沙門氏菌的OD630是0.097，混合菌的OD630是0.105，其陰性對照的OD630是0.099，三者的吸光值均與陰性對照相接近，說明在該濃度下無菌生長，肉桂醛對致病菌具有抑菌作用 。

綜上所述，用選擇培養(yǎng)基進行驗證后確定單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌與混合菌的MIPC都為0.40 μL/mL。

2.4 右旋龍腦和肉桂醛協(xié)同作用下對游離態(tài)菌體最低抑菌濃度的測定

表4 單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌以及混合菌的生長情況Table 4 Growth situation of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

注：“+”表示平板內(nèi)有1～100個肉眼可見的菌落，“++”表示有100～200個肉眼可見的菌落，“+++”表示有200～400個肉眼可見的菌落，“++++”表示存在400 個以上肉眼可見的菌落，“-”表示沒有肉眼可見的菌落。

由表4可知，在0.50 mg/mL右旋龍腦和0.40 μL/mL肉桂醛共同作用下可以完全殺死3種菌體。而0.50 mg/mL的右旋龍腦不足以完全殺死3種菌但可較好地抑制游離態(tài)菌體的生長。0.40 μL/mL的肉桂醛只能殺死單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌，對混合菌只有部分抑制作用。結(jié)果表明右旋龍腦和肉桂醛可以協(xié)同抑制游離態(tài)菌體的生長。用選擇培養(yǎng)基驗證后，確定右旋龍腦和肉桂醛協(xié)同的MIPC為0.50 mg/mL右旋龍腦和0.40 μL/mL肉桂醛。Visvalingam等[16]的研究表明肉桂醛和其他試劑協(xié)同作用，增強抑菌作用的同時還可以降低產(chǎn)生抗藥性的風險。

2.5 右旋龍腦和肉桂醛協(xié)同作用下對生物被膜態(tài)菌體最低抑菌濃度的測定

表5 單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌以及混合菌的生長情況Table 5 Growth situation of L.monocytogenes,S.typhimurium and mixed bacteria

注：“+”表示平板內(nèi)有1～100個肉眼可見的菌落，“++”表示有100～200個肉眼可見的菌落，“+++”表示有200～400個肉眼可見的菌落，“++++”表示存在400 個以上肉眼可見的菌落，“-”表示沒有肉眼可見的菌落。

由表5可知，在3倍MIPC共同作用下可以完全將單核增生李斯特菌殺滅，而鼠傷寒沙門氏菌和混合菌卻還存在少數(shù)菌。鼠傷寒沙門氏菌和混合菌要在5倍MIPC共同作用下才會被徹底殺死。說明右旋龍腦和肉桂醛可以抑制生物被膜態(tài)菌體的生長，在以往的研究中已經(jīng)顯示肉桂醛可以抑制生物被膜的形成[17]。在2.50 mg/mL右旋龍腦和2.00 μL/mL肉桂醛的環(huán)境下，生物被膜態(tài)的3種菌的生長均被完全抑制。綜上所述，經(jīng)選擇培養(yǎng)基驗證后，確定右旋龍腦和肉桂醛協(xié)同作用下的MIBC為2.50 mg/mL右旋龍腦和2.00 μL/mL肉桂醛。由結(jié)果可知，抑制生物被膜態(tài)菌體的藥物濃度遠遠高于游離態(tài)的藥物濃度，這一點在以往的實驗中也已經(jīng)得到證實[18]，同時也證明了生物被膜態(tài)菌體具有更強的藥物抗性。

3 結(jié)論

食源致病菌的污染導致的食品安全問題是人類健康的一大隱患。游離態(tài)菌體和生物被膜態(tài)菌體對各種殺菌條件的敏感度不同，生物被膜的形成增加了食品中致病菌清除的艱巨性。本研究探討了右旋龍腦、肉桂醛、右旋龍腦和肉桂醛混合添加抑制游離態(tài)和生物被膜態(tài)的單核增生李斯特菌、沙門菌及其混合菌的特性。試驗結(jié)果顯示，右旋龍腦、肉桂醛以及兩者混合添加對游離態(tài)和生物被膜態(tài)兩種生理狀態(tài)的食源致病菌都具有一定的抑制作用。而且兩者混合添加時具有協(xié)同的作用，在降低其使用濃度的同時增強了其抑菌效果。因此，即使肉桂醛和右旋龍腦都有刺激性氣味，但混合添加兩種天然食品添加劑，在協(xié)同作用下，可以降低它們對食品風味的影響。本研究對今后開展天然食品添加劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義。