彭家軍,崔立兵，馬 昆

(內(nèi)蒙古蘭太實業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 阿拉善 750333)

內(nèi)蒙古蘭太實業(yè)股份有限公司(以下簡稱“蘭太公司”)擁有200多平方千米的內(nèi)陸鹽湖(吉蘭泰鹽湖)，具有豐富的鹵水資源。該地干旱少雨，全年光照時間長，晝夜溫差大，特別適合9-cis營養(yǎng)物質(zhì)的積累，經(jīng)以色列威茲曼研究所檢測，吉蘭泰鹽藻中9-cis營養(yǎng)物質(zhì)和全反式β-胡蘿卜素達到了1 ∶1比例的黃金配比。具有培養(yǎng)杜氏藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素得天獨厚的自然條件。

目前，鹽度為影響鹽藻生長和β-胡蘿卜素積累的主要環(huán)境因子之一。鹽度和營養(yǎng)鹽是鹽藻室外大規(guī)模培養(yǎng)中僅有的兩個可控因子。明確鹽藻對不同鹽度的吸收規(guī)律和鹽藻生長的兩階段(生物量合成階段和β-胡蘿卜素積累階段)對氮鹽種類和濃度的不同要求對建立鹽藻β-胡蘿卜素高產(chǎn)控制模式有直接的指導意義。

對鹽藻資源的開發(fā)主要是利用其細胞內(nèi)的β-胡蘿卜素和甘油。天然β-胡蘿卜素呈9-順式、15-順式與全反式混合構(gòu)型，不僅能轉(zhuǎn)化為維生素A，而且具有淬滅體內(nèi)自由基、防止衰老以及癌變、防治心腦血管疾病、青光眼、白內(nèi)障并增強人體免疫力等功效，因而具有廣闊的應用前景。自然界中β-胡蘿卜素分布很廣，但一般含量極微。單細胞綠藻鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)在人工控制和脅迫條件下，能大量積累β-胡蘿卜素(占干重的10%～14%)，被公認為是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的理想天然資源。美國、澳大利亞、以色列、日本、西班牙、加拿大等國較早就開展了杜氏藻的基礎(chǔ)理論研究并投入生產(chǎn)和工業(yè)化養(yǎng)殖。我國的杜氏藻研究和大規(guī)模養(yǎng)殖始于20世紀80年代，養(yǎng)殖業(yè)主要分布在內(nèi)蒙、天津和甘肅等地。

文章研究了鹽度對杜氏藻生長、色素積累的影響，以期為優(yōu)化杜氏藻生產(chǎn)工藝、提高杜氏藻及其β-胡蘿卜素產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種。鹽生杜氏藻Dunaliellasalina來自中國海洋大學海洋生命學院分離的內(nèi)蒙古“北京2#”種，原種來自以色列。

1.2 培養(yǎng)條件

(1)培養(yǎng)液。來自蘭太公司生產(chǎn)基地的飽和鹵水與蒸餾水配制的不同濃度培養(yǎng)液。一次性添加KH2PO40.1 mmol/L, 檸檬酸鐵0.01 mmol/L, NaHCO32 mmol/L。

(2)鹽度和氮源。第一組 NaNO30.8 mmol/L，鹽度(飽和鹵水體積/培養(yǎng)液總體積)：30%、40%、50%、60%、70%。

第二組 CO(NH2)20.4 mmol/L，鹽度(飽和鹵水體積/培養(yǎng)液總體積)：30%、40%、50%、60%、70%(依次對應瓶號1#～5#)。

(3)溫度—空調(diào)控溫22 ℃±1 ℃。

(4)光照—日光燈源光照，光/暗為14 h/10 h。

(5)其它用250 mL三角燒瓶培養(yǎng)，藻液體積150 mL。取對數(shù)生長期藻種接種。接種密度15×104cell/mL。每天搖瓶6次。試驗設(shè)五個水平樣，重復兩次。

1.3 測定指標和測定方法

(1)細胞計數(shù)。血球計數(shù)板法計數(shù)，每個樣計3次，取其平均數(shù)，每天計數(shù)一次。

(2)β-胡蘿卜素的測定[4]。5 mL藻液→90%丙酮萃取→上清液→定容50 mL→721分光光度計測OD450值。

β-胡蘿卜素含量(mg/L)=(定容體積×10×OD450)×1 000÷(2 500×取樣體積)。體積單位均為毫升(mL)。

(3)葉綠素(a、b)的測定[4]。5 mL藻液(加入1 g NaCl)→90%丙酮萃取→上清液→定容50 mL→721分光光度計分別測OD663、OD645值。

葉綠素含量(mg/L)=(8.02×OD663+20.21×OD645)×定容體積÷取樣體積。

2 結(jié)果

2.1 鹽度及氮源對杜氏藻生長的影響(表1、圖1、表2、圖2)

表1 NaNO3作為氮源,不同鹽度培養(yǎng)液杜氏藻細胞密度Tab.1 Cell density of Dunalliella Salina in different salinity culture medium with NaNO3 as nitrogen source ×104 cell·mL-1

圖1 NaNO3作為氮源鹽度對鹽藻的影響Fig.1 Effect of salinity of NaNO3 as nitrogen source on Dunaliella Salina

圖1所示，在實驗范圍內(nèi)，以NaNO3作為氮源，30%鹽度對杜氏藻生長最合適。細胞最大密度為44.8×104cell/mL，其40%組最大密度為36.5×104cell/mL，50%組最大密度為34.1×104cell/mL，60%組細胞密度最大密度為30.7×104cell/mL，70%組細胞密度總體水平仍是最低的。圖1所示杜氏藻最高密度44.8×104cell/mL出現(xiàn)在30%鹽度，70%對杜氏藻生長有抑制作用。

圖2所示在實驗范圍內(nèi)，以CO(NH2)2作為氮源，30%鹽度對杜氏藻生長最合適。細胞最大密度為47.5×104cell/mL，其40%組最大密度為46.0×104cell/mL，50%組最大密度為35.8×104cell/mL，60%組細胞密度最大密度為30.2×104cell/mL，70%組細胞密度23.7×104cell/mL總體水平仍是最低的。圖2所示對杜氏藻最高密度47.5×104cell/mL出現(xiàn)在30%鹽度，70%對杜氏藻生長有抑制作用。

表2 CO(NH2)2作為氮源,不同鹽度培養(yǎng)液杜氏藻細胞密度Tab.2 CO(NH2)2 as nitrogen source, cell density of Dunaliella Salina in different salinity culture medium ×104 cell·mL-1

圖2 CO(NH2)2作為氮源鹽度對鹽藻的影響Fig.2 Effect of salinity of CO(NH2)2 as nitrogen source on Dunaliella salina

2.2 鹽度對杜氏藻β-胡蘿卜素積累的影響

圖3顯示了10 d實驗結(jié)束時不同鹽度及兩種氮源對杜氏藻的β-胡蘿卜素含量的影響?？梢钥闯?，鹽度50%對杜氏藻來說，有最大的β-胡蘿卜素含量(10.8 mg/L)，70%鹽度組有最低的β-胡蘿卜素含量(4.0 mg/L)，說明鹽度對β-胡蘿卜素積累有促進作用。另外容易看出，鹽度50%積累β-胡蘿卜素的能力高于60%，說明高鹽度不適合β-胡蘿卜素含量的積累。圖3顯示尿素和硝酸鈉兩種氮源對鹽藻生長沒有明顯差異，但對鹽藻積累β-胡蘿卜素，尿素相對于硝酸鈉效果好。

圖3 第11 d胡蘿卜素含量柱形圖Fig.3 Column chart of carotene content on the 11th day

2.3 鹽度對杜氏藻葉綠素a合成的影響

圖4顯示了共10 d葉綠素a硝酸鈉和尿素合成達高峰時對杜氏藻藻液葉綠素a的濃度?？梢钥闯?，對硝酸鈉來說，最大葉綠素a含量12.2 mg/L出現(xiàn)在30%組中，70%組有最低的葉綠素a含量(4.60 mg/L)；對尿素來說，最大葉綠素a含量10.8 mg/L出現(xiàn)在50%組中，40%組有最低的葉綠素a含量(4.6 mg/L)；說明鹽度對葉綠素a合成有促進作用。

圖4 第11 d葉綠素含量柱形圖Fig.4 Column chart of chlorophyll content on the 11th day

3 討論

鹽生杜氏藻(DunaliellaSalina)是唯一能在高濃度鹵水中生長的具有可觀經(jīng)濟價值的藻類生物，其在特殊環(huán)境下天然胡蘿卜素轉(zhuǎn)化富集量可以達到生物總量的10%以上。鹽藻養(yǎng)殖是醫(yī)療、保健、化妝、高檔餌料等領(lǐng)域獲取純天然胡蘿卜素的主要手段。應用現(xiàn)代先進工藝方法從鹽藻中提取蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、食用色素、不飽和脂肪酸等天然有效成分在生物化工和大健康領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

從細胞增長率、葉綠素及胡蘿卜素增長率雖鹽度變化曲線看出：鹽藻養(yǎng)殖鹽度為30%(9 °Be′)和40%(12 °Be′)培養(yǎng)液中鹽藻生長速率較快。高鹽度(15 °Be′以上)對鹽藻細胞分裂有明顯抑制作用。但高鹽度有利于鹽藻積累β-胡蘿卜素。因此，室外大規(guī)模養(yǎng)殖鹽藻最適宜鹽度范圍40%～50%(12 °Be′～15 °Be′)。但養(yǎng)殖周期不能過長(10 d以上)，因為此鹽度范圍內(nèi)其他藻類和原生動物有可能適應而泛濫。

尿素和硝酸鈉兩種氮源對鹽藻生長沒有明顯差異，但對鹽藻積累β-胡蘿卜素，尿素相對于硝酸鈉效果好。

實驗過程中筆者認為出現(xiàn)以下幾個問題：鹽藻生長速率總體較緩慢；β-胡蘿卜素積累較低(一般情況下10 mg/L～13 mg/L)；葉綠素含量大部分高于β-胡蘿卜素含量，原因可能是氮濃度高而光強低。杜氏藻生長的兩階段對光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子要求顯著不同。研究表明，杜氏藻生長和β-胡蘿卜素積累階段對鹽度的要求明顯不同。即先用較低的鹽度和光照及較高的氮鹽條件使藻增殖至較理想的密度，再提高鹽度和光照、降低pH值脅迫β-胡蘿卜素的積累。

另外，有研究表明：鹽度的改變還可能影響到鹽藻藻體中HCO3轉(zhuǎn)化為CO2碳酸酐酶(CA)的活性，在適合鹽度的范圍內(nèi)，體內(nèi)表面碳酸酐酶的活性較強；鹽度的變化導致膜脂肪酸種類及含量變化，影響膜的透性，改變其生理狀況。