楊曉燕，沈紅婭，姜 倩，高安麗，楊 志，王京昆，徐紅貴

(1.云南省藥物研究所 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650111；2.昆明貴金屬研究所，昆明 650106)

惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的重大疾病，是繼心血管疾病后的全球第二大死亡原因，每年導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過800 萬人。惡性腫瘤特點(diǎn)之一是腫瘤細(xì)胞不受控制的快速增殖，增殖需要DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此，DNA 是抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)。鉑類藥物就是一類以DNA 為作用靶點(diǎn)的無機(jī)抗癌配合物[1]，它們可破壞癌細(xì)胞DNA 結(jié)構(gòu)和功能，造成癌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到治療的目的[2]。

含鉑類藥物的聯(lián)合化療一直是治療胃癌的首選方案，但鉑類抗癌藥普遍存在肝腎毒性高，骨髓抑制毒性大，很多老年患者不能耐受，以及交叉耐用性等問題。因此，研制毒性小、對(duì)胃癌有較高療效的新型鉑類抗癌藥物仍具有重要社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。舒尼鉑(如圖1 所示)作為治療胃癌藥物舒泊的衍生物，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)[3-6]，它的研發(fā)正是以改善鉑類抗癌藥的肝腎毒性和骨髓抑制毒性為目的，從而達(dá)到提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期的最終目標(biāo)。

圖1 舒尼鉑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical formula of Suniplatin

藥品中的殘留溶劑是指在原料藥或輔料的生產(chǎn)中以及在制劑制備過程中使用、在工藝過程中未能完全去除的有機(jī)試劑[7]。人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)將殘留溶劑分為3 個(gè)類別，并明確規(guī)定了限度[8]。因此，為保障用藥安全，控制殘留溶劑十分重要。溶劑殘留檢測(cè)報(bào)道的文獻(xiàn)[9-11]較多，但試劑種類不同。本文對(duì)舒尼鉑原料藥在合成工藝中使用的乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷及1,4-二氧六環(huán)5 種有機(jī)溶劑建立分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent GC 7890B GC System，配置有FID 檢測(cè)器以及OpenLab CMS 工作站。Agilent 7694E 頂空單元。XP205 電子天平(Mettler Toledo)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：乙醇(色譜純，MERCK)；四氫呋喃(色譜純，MERCK)；乙酸乙酯(分析純，利安隆博華科技有限公司)；環(huán)己烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1,4-二氧六環(huán)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。試劑：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(色譜純，MERCK)。

供試品：舒尼鉑原料藥，由云南省藥物研究所提供。

1.2 試液配制

1) 對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確稱取(精確至0.1 mg) 500 mg 乙醇、500 mg 乙酸乙酯、72 mg 四氫呋喃、388 mg 環(huán)己烷、38 mg 1,4-二氧六環(huán)，用總量為40 mL的DMF 溶解轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用DMF 稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取10.00 mL儲(chǔ)備溶液至100 mL 量瓶中，用DMF 稀釋至刻度，搖勻，得到的溶液中5 種有機(jī)物的濃度分別為500、500、72、388 和38 μg/mL 的溶液。分取2.00 mL置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，適當(dāng)密封頂空進(jìn)樣瓶，作為色譜分析用對(duì)照品工作溶液。

2) 供試品溶液。稱取舒尼鉑原料藥200 mg (精確至0.1 mg)，加2 mL DMF 溶解在20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，適當(dāng)密封頂空進(jìn)樣瓶，作為色譜分析用供試品溶液。

1.3 色譜工作條件

色譜條件：DB-624 毛細(xì)管色譜柱(0.53 mm×30 mm；0.25 μm)，起始溫度40℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至80℃，再以20 ℃/min速率升溫至200℃，保持3 min。檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。檢測(cè)器溫度為250℃；進(jìn)樣口溫度220℃。載氣為氮?dú)?，流速? mL/min，分流比為10:1，氫氣流量為40 mL/min，空氣流量為400 mL/min，進(jìn)樣體積1mL。

頂空條件：平衡溫度140℃，定量環(huán)溫度150℃，傳輸管線溫度160℃，樣品平衡時(shí)間25 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性

對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算5 種溶劑的保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示5種溶劑保留時(shí)間及峰面積的RSD均小于5.0%，理論板數(shù)均不低于20000，分離度均大于2.0，符合定量測(cè)定要求。

2.2 專屬性

以對(duì)照品溶液和空白溶液作為測(cè)試溶液進(jìn)行色譜分析測(cè)定，所得色譜圖如圖2 所示。圖2 中15 min后為空白溶劑(DMF)峰，不干擾檢測(cè)。乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷和1,4-二氧六環(huán)等5 種有機(jī)溶劑及DMF 間最小分離度為2.31，專屬性良好。

2.3 線性范圍

分取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別加入不同體積的DMF 稀釋，配制成不同濃度的系列對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度由低到高依次進(jìn)行色譜測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。所得結(jié)果如表1 所列。根據(jù)表1 結(jié)果，線性擬合的相關(guān)系數(shù)(r)均在0.9991 以上，表明各組分溶劑在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 5 種溶劑對(duì)照混合溶液氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of the five acontrol mixture solvents

表1 5 種有機(jī)溶劑的線性關(guān)系考察結(jié)(n=9)Tab.1 Results of investigation on linear relationship of 5 organic solvents (n=9)

2.4 檢測(cè)限與定量限

逐級(jí)稀釋各組分溶液，按1.3 進(jìn)行測(cè)定，乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷、1,4-二氧六環(huán)最低檢出限(S/N≥3)及定量限(S/N≥10)如表2 所列。

表2 5 種有機(jī)溶劑的檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)Tab.2 Limits of detection and quantification for 5 organic solvents

2.5 回收率

準(zhǔn)確稱取12 份舒尼鉑原料藥樣品，分別加入高、中、低不同濃度(相當(dāng)于對(duì)照樣品工作溶液中5種有機(jī)溶劑濃度的120%、100%、80%)的混標(biāo)溶液，平行制備3 份，其中3 份為空白樣品溶液。計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果列于表3。乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷及1,4-二氧六環(huán)5 種有機(jī)溶劑平均回收率為98.68%～101.05%，RSD(n=9)為1.28%～2.07%。3 個(gè)濃度水平的平均回收率在在100%±10%范圍內(nèi)，RSD均不超過5.0%，符合定量要求。

表3 5 種有機(jī)溶劑回收率結(jié)果(n=9)Tab.3 Recovery results for 5 organic solvents (n=9) %

2.6 耐用性試驗(yàn)

以對(duì)照品溶液和供試品溶液作為測(cè)試溶液。通過改變載氣流速、起始柱溫和爐溫評(píng)價(jià)方法耐用性，結(jié)果顯示，在載氣流速(4.0±0.5 mL/min)、起始柱溫(40±5 ℃)、爐溫(140±5 ℃)發(fā)生微小改變時(shí)，供試品溶液溶劑殘留量無明顯差異，對(duì)照品溶液各組分分離度良好，各參數(shù)無顯著變化，此方法耐用性良好。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

稱取不同批次舒尼鉑原料藥各200.0 mg，分別加2 mL DMF 溶解，置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行色譜測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各組分含量，結(jié)果如表4 所列。

表4 舒尼鉑原料藥中溶劑殘留測(cè)定結(jié)果 /10-6Tab.4 Results of solvent residue determination in Suniplatin API

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版規(guī)定，四氫呋喃、環(huán)己烷及1,4-二氧六環(huán)為限制使用的二類溶劑，乙醇、乙酸乙酯為限制使用的三類溶劑，其限值列于表4。表4 結(jié)果表明，3 批樣品中均未檢出乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷、1,4-二氧六環(huán)，僅檢出乙醇，且遠(yuǎn)低于限度，各溶劑殘留量均符合規(guī)定。

3 結(jié)論

采用頂空氣相色譜法測(cè)定乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、環(huán)己烷及1,4-二氧六環(huán)5 種殘留溶劑，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。各項(xiàng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符和相關(guān)要求，方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確靈敏，可滿足舒尼鉑中5 種有機(jī)溶劑殘留量限值的檢測(cè)要求。