葛海燕， 張振宇， 茅麗玲， 紀(jì) 昉， 朱 哲， 高 瑋， 付正偉

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胃腸肛腸外科，上海 200120； 2. 浙江省平湖市第二人民醫(yī)院，浙江 平湖 314200； 3. 上海市嘉定區(qū)南翔鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 201802)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而且大多數(shù)胃癌患者在首次診斷時(shí)就屬于進(jìn)展期胃癌，這些患者雖然接受了根治性手術(shù)和化療等綜合治療，但仍然存在較高的腫瘤復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致這些患者的預(yù)后差，5年生存率低。如何盡早發(fā)現(xiàn)胃癌，預(yù)判腫瘤病理分期，對提高胃癌患者的遠(yuǎn)期生存率有重要意義。

腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells， CTCs)近年來受到普遍關(guān)注[1]。由于CTCs可能具有生物學(xué)活性和轉(zhuǎn)移潛能，近年來對于CTCs與臨床腫瘤病理之間的相關(guān)性問題，引起了廣泛的重視。一些研究者認(rèn)為，通過檢測腫瘤患者外周血中CTCs的數(shù)量，可以為判斷腫瘤的臨床病理分期和預(yù)后提供客觀的依據(jù)[2]。本研究檢測了92例胃癌患者術(shù)前、術(shù)后1周的外周血中CTCs的變化，并且將CTCs檢測結(jié)果與其腫瘤病理分期進(jìn)行相關(guān)性分析，探討胃癌患者外周血中CTCs與腫瘤病理分期之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

將同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院自2015年6月—2018年12月收治的胃癌患者納入本研究。納入標(biāo)準(zhǔn)： (1) 年齡不限；(2) 經(jīng)胃鏡檢查和活組織病理學(xué)檢查明確診斷為胃癌；(3) 患者入組前未接受任何化學(xué)藥物、放射、免疫制劑、中醫(yī)中藥等治療。以胃部良性疾病(慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃息肉)患者作為對照組?；颊吆炇鹬橥鈺?，研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核同意[(2016)研審第(056)號]。

1.2 CTCs檢測

分別于手術(shù)前1天、術(shù)后第7天清晨抽取肘正中靜脈血5mL，用EDTA抗凝管收集保存；裂解紅細(xì)胞后，使用微流控芯片進(jìn)行液體處理和CTCs捕獲，利用anti-CD45抗體熒光染色白細(xì)胞，DAPI染色細(xì)胞核，CEP8(8號染色體探針)熒光原位雜交(FISH)染色體呈現(xiàn)異倍體(2倍以上)細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)目標(biāo)細(xì)胞。

1.3 CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]

(1) 光鏡下有完整的細(xì)胞核，細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形；(2) 熒光下細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整，CD45(抗白細(xì)胞表面抗原)陰性；(3) 細(xì)胞核DAPI核染色陽性,細(xì)胞核直徑大于8μm，并且核形狀不規(guī)則；(4) CEP8>兩個(gè)信號點(diǎn)；(5) 同一個(gè)標(biāo)本中符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞≥2個(gè)視為CTCs陽性。

1.4 胃癌患者資料收集

記錄胃癌患者手術(shù)后的病理檢查資料，包括腫瘤細(xì)胞的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、神經(jīng)侵犯、脈管浸潤、TNM分期等信息，并進(jìn)行胃癌患者CTCs與腫瘤浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、TNM分期等相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

列入本研究的胃癌患者共92例(男性56例，女性36例)，年齡分別為32～82歲，平均年齡(65.3±12.6)歲。手術(shù)前1天從患者外周血中檢出CTCs陽性58例，陽性率63%。CTCs陽性的鑒別標(biāo)準(zhǔn)為DAP1染色(+)、CEP8染色(+)、CD45染色(-)，見圖1。

圖1 CTCs陽性的鑒別標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 The criteria for identifying positive CTCs主機(jī)： Leica DM3000；軟件版本： Leica Application Suite Version 4.9.0；放大倍數(shù)×400；A： DAPI標(biāo)記陽性細(xì)胞；B： CEP8標(biāo)記陽性細(xì)胞；C： CD45陰性細(xì)胞；D： 將三者疊加的效果圖，具備DAP1(+)CEP8(+)CD45(-)特征的細(xì)胞為CTCs

2.2 胃癌患者外周血CTCs與臨床病理之間的相關(guān)性

92例胃癌患者手術(shù)前的外周血CTCs檢測結(jié)果以及與性別、年齡、腫瘤浸潤深度、TNM分期、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯等主要臨床病理資料的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，胃癌患者外周血中CTCs的陽性率與他們的年齡、性別沒有相關(guān)性(P>0.05)，但是，胃癌患者CTCs的陽性率與腫瘤浸潤深度、TNM分期、神經(jīng)與脈管侵犯的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在腫瘤的浸潤深度和TNM分期方面，不同組別之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著腫瘤侵犯深度的加深，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率也隨之增加，患者中具有脈管侵犯的CTCs陽性率顯著高于沒有脈管侵犯者(P<0.05)。

表1 CTCs陽性率與患者的性別、年齡，腫瘤的 T分期、TNM分期及神經(jīng)、脈管侵犯的相關(guān)性

2.3 腫瘤不同浸潤程度對CTCs的影響

將腫瘤組織不同浸潤深度的病例進(jìn)行分組，將腫瘤分期為T1、T2分為一組，腫瘤分期為T3、T4分為一組。從表2可以看到浸潤程度深的患者，CTCs陽性率顯著高于浸潤深度淺的患者(P<0.05)。

表2 胃癌患者不同T分期與CTCs陽性率的比較

2.4 手術(shù)前后胃癌患者CTCs陽性率的變化

86例患者在術(shù)后1周進(jìn)行了CTCs檢測，占93.5%，其余患者由于提前出院、標(biāo)本保存等因素，未能檢測。手術(shù)前CTCs陽性的58例胃癌患者術(shù)后1周的檢測結(jié)果： CTCs數(shù)量減少或者歸零者35例，占60.3%；CTCs數(shù)量無變化者15例，占25.9%；CTCs數(shù)量增加者8例，占13.8%。這些結(jié)果表明，胃癌根治術(shù)后短期內(nèi)就能夠有效減少患者的CTCs負(fù)荷，獲益人群達(dá)到60%左右。但是還有近26%的患者CTCs并沒有減少，甚至少部分患者(占13.8%)術(shù)后CTCs反而升高。分析這部分患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs沒有減少甚至是增加者，主要是TNM分期較晚(Ⅲ、Ⅳ期)患者，伴有血管內(nèi)癌栓、周圍組織癌結(jié)節(jié)和腹膜癌結(jié)節(jié)形成等晚期現(xiàn)象，見表3。

表3 58例胃癌患者術(shù)后CTCs變化與臨床病理的關(guān)系

3 討 論

實(shí)體癌的微轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性特征的重要表現(xiàn)之一，與腫瘤的臨床病理分期、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、預(yù)后具有十分緊密的關(guān)系[3-4]。

CTCs檢測是近年來興起的一項(xiàng)臨床新技術(shù)，通過對外周血中CTCs的分離富集以及對CTCs的檢測等步驟，直接檢測外周循環(huán)血液中腫瘤細(xì)胞的存在與否[5]。因此，文獻(xiàn)報(bào)道在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等等多種實(shí)體瘤患者的外周血中都能檢測到CTCs，并且CTCs的惡性度與原發(fā)腫瘤細(xì)胞大致相同[6-8]。一些研究表明，CTCs的存在與腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性，CTCs數(shù)量越多，患者面臨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷越重，未來發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性就越大[9-10]。外周血中的異倍體細(xì)胞被認(rèn)為是CTCs的標(biāo)志之一[2]。

從本研究結(jié)果可以看出，胃癌患者的外周血中確實(shí)能夠檢測到CTCs，陽性率為63%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相同。田曉坤等[10]報(bào)道在41例胃癌患者外周血中，有29例CTCs檢測結(jié)果為陽性，陽性率為70.7%。本研究結(jié)果還表明，胃癌患者外周血中CTCs的陽性率與臨床腫瘤病理分期具有相關(guān)性，分期越晚，CTCs陽性率越高，而早期患者的CTCs陽性率很低。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌患者外周血中CTCs陽性率與腫瘤的分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性[9]。因此，對于胃癌患者外周血中CTCs陽性率與臨床腫瘤病理的聯(lián)系，值得在更大范圍，納入更多病例進(jìn)一步深入研究。

對于胃癌根治性手術(shù)后CTCs的變化，目前文獻(xiàn)仍然報(bào)道很少。本次初步觀察結(jié)果表明，多數(shù)患者在行胃癌根治性手術(shù)后，CTCs轉(zhuǎn)陰或者減少(60.5%)，反映隨著原發(fā)腫瘤的切除，外周血中CTCs也隨之減少或消失，表明了手術(shù)的根治性與徹底性。但是，仍有總數(shù)近25.9%的患者CTCs沒有明顯變化，13.8%的患者CTCs數(shù)量還有所增加，并且與其TNM分期晚(Ⅲ、Ⅳ)密切相關(guān)。這些現(xiàn)象提示： (1) 對于病理分期晚的胃癌患者，單純的手術(shù)切除并不能消除所有的CTCs，需要聯(lián)合術(shù)后化療等綜合治療措施，以完善治療方案；(2) 對于胃癌根治術(shù)后CTCs仍然陽性的患者，觀察術(shù)后1周還是不夠的，需要增加術(shù)后2、4周等節(jié)點(diǎn)的檢測，以便能夠更加全面地了解手術(shù)后CTCs的變化規(guī)律；(3) 目 前的CTCs檢測技術(shù)還不能完全反映外周血中腫瘤細(xì)胞的狀況，由于CTCs的數(shù)量極少，不可能在外周血中形成均勻分布，隨機(jī)的單次采血檢測，就大大增加了捕捉CTCs的難度和偶然性。因此，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為即使CTCs檢測陰性，也并不能代表外周血中沒有CTCs。今后可以考慮聯(lián)合應(yīng)用microRNAs檢測等技術(shù)[11]，進(jìn)一步豐富外周血中腫瘤信號的檢測。

志謝在本研究實(shí)施過程中，得到寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司的技術(shù)支持，在此深表謝意！