張?麟，陳?衡

正負(fù)電荷改性乙肝病毒樣顆粒的構(gòu)建及性能評價

張?麟，陳?衡

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)可在體外自組裝成二十面體的病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，但是其較低的自組裝效率及穩(wěn)定性制約其應(yīng)用．通過蛋白質(zhì)改造修飾，在野生型HBc(wtHBc)的免疫顯性區(qū)(major immunodominant region，MIR)分別插入帶電多肽序列RRRRRRRR和DDDDDDDD，以通過荷電基團(tuán)及靜電相互作用的引入提高VLPs穩(wěn)定性．經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)，成功獲得攜帶額外電荷的HBc突變體(mHBc)，包括攜帶額外正電荷的m＋HBc和負(fù)電荷的m-HBc．結(jié)果表明，mHBc的二級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋，與wtHBc一致．m＋HBc和m-HBc等比例混合可在體外實現(xiàn)自組裝，所得mHBc VLPs粒徑為(30.44±2.23)nm，與野生型一致．該自組裝過程及組裝體穩(wěn)定性受離子強(qiáng)度和pH值影響．使用尺寸排阻色譜、原子力顯微鏡、動態(tài)光散射等方法表征和分析VLPs在不同緩沖液中的穩(wěn)定性差異．發(fā)現(xiàn)wtHBc VLPs可穩(wěn)定存在于0.3～0.7mol/L NaCl溶液中，鹽濃度過高或過低均會使其穩(wěn)定性降低．pH響應(yīng)性實驗表明，wtHBc VLPs的最佳組裝及穩(wěn)定pH值為7.4，偏離此pH值使其穩(wěn)定性降低．在低于pH＝5.5的環(huán)境下，其相對穩(wěn)定性明顯降低，只達(dá)到pH＝7.4的64.2%．而mHBc VLPs的穩(wěn)定性差異隨pH值變化不大，在pH測試范圍5.5～9.5的相對穩(wěn)定性均高于88.3%．以上研究結(jié)果表明，正、負(fù)電荷基團(tuán)的引入可提高HBc VLPs對pH值變化的耐受性，拓寬穩(wěn)定pH值區(qū)間，增強(qiáng)VLPs的穩(wěn)定性，利于其實際應(yīng)用．

乙肝病毒核心蛋白；電荷；病毒樣顆粒；納米結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)修飾

乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，具有部分雙鏈和環(huán)狀DNA基因?組[1]．HBV有3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)[2]．HBc是HBV的核衣殼蛋白，具有183個氨基酸殘基(aa)，相對分子質(zhì)量為21000[3]．Yu等[4]通過對野生型HBc(aa 1～183)序列的研究，發(fā)現(xiàn)其序列主要可分為兩部分：N-末端自組裝域(SA，aa 1～150)和C-末端聚精氨酸域(CTD，aa 151～183)．SA主要執(zhí)行自組裝功能，且其二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋構(gòu)成．CTD是一段無規(guī)則序列，對HBc的組裝無影響[5-6]．180個或240個HBc單體可在體外分別自組裝為＝3或＝4兩種形式的二十面體對稱VLPs，粒徑分別為30nm、34nm[7]．Ceres等[8]已證明HBc VLPs的組裝是HBc疏水結(jié)構(gòu)域包埋的過程．在體外組裝過程中，HBc單體之間的疏水相互作用可以通過控制鹽濃度來調(diào)節(jié)．此外，鈉鹽已被視為HBc VLPs組裝的優(yōu)異誘導(dǎo)劑[9-10]．HBs是具有226個aa的糖基化蛋白質(zhì)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，可在腔膜上形成22nm的VLPs[11]．目前，研究人員已經(jīng)從常見的表達(dá)系統(tǒng)中合成并分離出HBV VLPs[12]．Lu等[13]使用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功合成并分離出HBc VLPs．由于表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌的毒性，幾乎不用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HBs VLPs．

HBc VLPs已在疫苗研制[14]、疾病診斷[15]、藥物輸送[16]和材料科學(xué)[17]等方面廣泛應(yīng)用．例如，VLPs疫苗可有效地預(yù)防HBV感染，且其安全性已獲得證明[18]．此外，由于具有良好的生物相容性和均一結(jié)構(gòu)，HBc VLPs也可作為一種理想的納米級載體[19].然而，以液相形式存在的HBc VLPs在改性、裝配、儲存和轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)的低組裝性和低穩(wěn)定性限制其應(yīng)用[20]．Schumacher等[21]通過在截斷的HBc(aa 1～150)的C-末端引入不同長度的聚組氨酸多肽，成功提高HBc VLPs對物理和化學(xué)應(yīng)力的耐受性．Lu等[13]研究在HBc單體和二聚體之間引入額外二硫鍵對HBc VLPs整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)成功組裝的HBc VLPs具有緊密的二硫鍵網(wǎng)絡(luò)，其組裝和穩(wěn)定性明顯提升，并且可以抵抗某些還原環(huán)境，如低于10mmol/L的谷胱甘肽(GSH)．Newman等[22]通過對HBc富含精氨酸的C末端進(jìn)行不同程度的截斷，建立體外解組裝和再組裝系統(tǒng)，研究“電荷平衡假?說”[23]對HBV衣殼穩(wěn)定性的影響．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚陰離子有助于減少由富含精氨酸的CTD域在近距離接觸時產(chǎn)生的亞基間電荷排斥，從而加強(qiáng)HBV衣殼的組裝和完整性．

因此，本文擬通過電荷引入調(diào)控HBc自組裝性能．在HBc的MIR區(qū)域中的Pro79和Ala80之間分別插入帶電多肽RRRRRRRR和DDDDDDDD，構(gòu)建兩種突變型HBc(mHBc)，包括m＋HBc和m-HBc，以在m＋HBc單體和m-HBc單體間引入額外靜電相互作用促進(jìn)其穩(wěn)定．進(jìn)而，通過圓二色性光譜(CD)、尺寸排阻色譜(SEC)、原子力顯微鏡(AFM)和動態(tài)光散射(DLS)等系統(tǒng)分析HBc的結(jié)構(gòu)、組裝性能和穩(wěn)定性．

1?材料和方法

1.1?實驗材料

編碼亞型adyw(1)人類乙型肝炎核心抗原的基因序列來自于UniProt(登錄號：P03147)，并在C-末端149位氨基酸進(jìn)行截斷(wtHBc(aa 1～149)，以下簡稱wtHBc)．含有wtHBc、m＋HBc和m-HBc(以下總稱HBc)的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(＋)-wtHBc、pET-28a(＋)-m＋HBc和pET-28a(＋)-m-HBc由生工生物工程(上海)股份有限公司構(gòu)建并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)．1mL HisTrapTMHP親和色譜柱購自于北京中原公司．Sepharose 6Fast Flow、Sephadex G-25介質(zhì)以及藍(lán)色葡聚糖2000均購自于GE Healthcare(Uppsala，Sweden)．微生物培養(yǎng)所用的胰蛋白胨、酵母提取物為英國Oxoid公司產(chǎn)品．蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)Blue Plus Protein Maker(14000～100000)、限制酶Sal I和Sac I購于北京全式金生物技術(shù)有限公司．Trans2K Plus Ⅱ DNA marker購自于鼎國生物科技有限公司(天津)．其他化學(xué)試劑除特殊說明外均為分析純．

1.2?HBc VLPs的構(gòu)建

mHBc的設(shè)計機(jī)理如圖1所示．其中，帶電多肽RRRRRRRR或DDDDDDDD按圖1(a)所示方式插入至wtHBc序列中，獲得m＋HBc及m－HBc突變體．m＋HBc與m－HBc通過α-螺旋束之間的相互作用形成mHBc二聚體．進(jìn)而120個mHBc二聚體組裝形成mHBc VLPs，且?guī)щ娀鶊F(tuán)分布于其外表面(見圖1(b))．

圖1?HBc VLPs設(shè)計機(jī)理示意

1.3?目的基因的雙酶切驗證

將從生工生物工程(上海)股份有限公司購得的3種重組質(zhì)粒使用限制酶Sal I和Sac I按照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)1h．酶切產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測．

1.4?HBc的培養(yǎng)

HBc由大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)．首先，將接種有靶標(biāo)大腸桿菌的LB固體培養(yǎng)基于37℃過夜培養(yǎng)．接著挑取單菌落接種于25mL LB液體培養(yǎng)基中，并在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中溫育12h(170r/min，37℃)．然后以1∶1000的體積比轉(zhuǎn)移至LB擴(kuò)大培養(yǎng)基，37℃溫育5h后，加入1mmol/L異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)10h．最后，于4500r/min、4℃離心30min收集菌體．收集的菌體使用平衡緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH＝7.4，0.5mol/L NaCl，40mmol/L咪唑)重懸，于冰浴中超聲破碎．細(xì)胞破碎液于12000r/min、4℃離心20min，收集上清液．上述所有培養(yǎng)基均含有50μg/mL卡那霉素．

1.5?HBc的純化

通過鎳離子親和色譜和尺寸排阻色譜純化HBc VLPs．色譜操作均于?KTA Start(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)儀器上進(jìn)行，檢測波長為280nm．使用1mL HisTrapTMHP親和色譜柱，洗脫緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH＝7.4，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑)選擇性純化HBc VLPs．向純化獲得的mHBc樣品中加入終濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，打開二硫鍵．使用填充有Sephadex G-25介質(zhì)的XK 16/26色譜柱，運行緩沖液Ⅰ(10mmol/L Tris-HCl，pH＝7.4，0.5mol/L NaCl)和運行緩沖液Ⅱ(10mmol/L Tris-HCl，pH＝7.4，0.5mol/L NaCl，2mmol/L DTT)分別除去純化后wtHBc和mHBc樣品中的咪唑．

1.6?HBc VLPs的組裝與純化

將除咪唑后的m＋HBc與m-HBc等摩爾比混合，與wtHBc樣品分別加入14000的透析袋中，于運行緩沖液Ⅰ中透析(4℃)，每8h置換一次緩沖液，共透析24h．之后將透析反應(yīng)物加載到裝有Sepharose 6Fast Flow介質(zhì)的SEC凝膠柱上，使用運行緩沖液Ⅰ洗脫并收集VLPs樣品．最后將收集到的VLPs樣品使用3000截留分子量的再生纖維素膜超濾濃縮，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.7?SDS-PAGE檢測

使用還原性SDS-PAGE分析目的蛋白質(zhì)．將純化得到的蛋白樣品與2×SDS loading buffer (100mmol/L Tris，pH＝6.8，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚藍(lán)，100mmol/L DTT)以相同比例混合后煮沸5～10min，然后于12000r/min離心1～2min．吸取上清液點樣到5％濃縮膠的點樣孔中，運行電流為10mA．當(dāng)loading buffer剛好移動至12％分離膠邊緣時，將電流調(diào)為25mA．當(dāng)loading buffer移動到合適位置時終止電泳操作．電泳膠經(jīng)染色和脫色處理后，使用分子成像儀(Vilber Lourmat，UK)拍攝照片.上述所有操作均按照操作手冊進(jìn)行．Blue Plus Protein Marker用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的標(biāo)定．

1.8?圓二色性光譜分析

使用JASCO J-180圓二色性光譜分析HBc的二級結(jié)構(gòu)．使用填充有Sephadex G-25介質(zhì)的XK 16/26色譜柱將3種蛋白樣品置換到20mmol/L PB(pH＝7.0)緩沖液中，并配制為相同的質(zhì)量濃度(0.07mg/mL). CD光譜在25℃以50nm/min的速度連續(xù)掃描，掃描波長范圍為250～190nm．測試中每種樣品重復(fù)3次，樣品緩沖液作為參照扣除背景干擾.

1.9?尺寸排阻色譜

使用填充有Sepharose 6Fast Flow介質(zhì)的SEC色譜柱表征HBc VLPs，藍(lán)色葡聚糖2000用于分子質(zhì)量標(biāo)定．其步驟如下：使用透析法將VLPs樣品配制在運行緩沖液Ⅰ中，并加載到色譜柱上．樣品加載后，使用運行緩沖液Ⅰ洗脫VLPs．對于純化的VLPs在不同鹽濃度及pH值緩沖液中穩(wěn)定性差異的表征，VLPs最初在運行緩沖液Ⅰ中配制，加載到色譜柱上后，使用不同的緩沖液作為流動相，洗脫HBc VLPs．

1.10?動態(tài)光散射

使用納米粒度電位分析儀Zetasizer Nano ZS檢測在第1.5節(jié)中獲得的HBc VLPs的粒徑．收集系統(tǒng)軟件ZetaSizer測出的強(qiáng)度和粒徑參數(shù)，用origin軟件做圖并分析數(shù)據(jù)．

1.11?原子力顯微鏡

VLPs樣品形貌經(jīng)原子力顯微鏡(本元納米儀器有限公司，北京)分析．采用輕敲模式和探頭S1145．于室溫下將樣品滴加覆蓋在光滑的云母片表面，使其被動吸附，然后用去離子水緩慢沖洗．采集樣品的AFM圖像，并使用Imager圖像軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計評價．

2?結(jié)果與討論

2.1?目的基因的雙酶切驗證

雙酶切結(jié)果顯示，HBc在400～500bp之間有較為清晰的條帶，且在5000～6000bp之間有明亮條帶(見圖2)．因為本文使用的是149位截斷的wtHBc，加上由于酶切位點以及帶電氨基酸基團(tuán)的引入帶來的堿基增加，wtHBc和mHBc的理論大小分別為460bp和480bp．pET-28a(＋)質(zhì)粒大小為5369bp.因此，上述條帶表明3種重組質(zhì)粒均已成功構(gòu)建．

1—pET-28a(+)-m-HBc；2—pET-28a(+)-m+HBc；3—pET-28a(+)-wtHBc

2.2?HBc VLPs的表達(dá)純化

2.2.1?親和色譜純化

HBc經(jīng)Ni2＋親和色譜純化，洗脫峰規(guī)整(見圖3)，表明HBc成功表達(dá)純化．圖中紫外吸收值上升，達(dá)到平臺，表明吸附達(dá)到平衡．樣品吸附完畢后，用平衡緩沖液沖洗，使紫外吸收值降至基線，表明此時親和色譜柱中，除吸附的樣品外，其他雜蛋白已經(jīng)全部沖洗干凈．通入洗脫液，洗脫吸附于色譜柱的蛋白樣品，出現(xiàn)洗脫峰．圖中洗脫峰位置的偏移是進(jìn)樣量不同導(dǎo)致，對洗脫峰及其表示的純化結(jié)果無影響．與wtHBc相比，隨著進(jìn)樣體積的增加，m-HBc的洗脫峰面積同樣增加．m＋HBc的洗脫峰面積略小于wtHBc的洗脫峰面積，表明由于聚精氨酸多肽的引入，m＋HBc得率降低．可能原因是，聚精氨酸多肽的引入使得m＋HBc的等電點增大(pI＝8.56)，接近操作使用的Tris-HCl緩沖液的pH值，故m＋HBc易在細(xì)胞破碎(冰浴)操作中形成包涵體，從而使得純化上清液中m＋HBc含量降低．

圖3?HBc的親和色譜純化圖譜

2.2.2?尺寸排阻色譜純化

使用填充Sephadex G-25介質(zhì)的XK 16/26色譜柱除去HBc樣品中的咪唑，結(jié)果如圖4所示．HBc樣品出峰于10～16mL，先于咪唑(30～40mL)．且由于咪唑的相對分子質(zhì)量接近鹽離子的相對分子質(zhì)量，咪唑峰的位置與電導(dǎo)峰(20～30mL)的位置更為接近．表明HBc樣品與咪唑成功分離．此外，mHBc樣品的咪唑峰明顯，這是由于加入到mHBc純化之后樣品中的DTT所致．DTT的加入有助于打開m＋HBc二聚體和m-HBc二聚體的二硫鍵，從而促成mHBc二聚體(由一分子m＋HBc與一分子m-HBc組成)的正確形成．由于wtHBc二聚體是由兩分子同源wtHBc單體組成，二硫鍵的存在對于wtHBc沒有影響，因此無需加入DTT．

圖4?HBc除去咪唑的純化圖譜

2.3?HBc VLPs的表征

2.3.1?還原性SDS-PAGE

全長HBc(aa 1～183)相對分子質(zhì)量為21000.質(zhì)粒pET-28a(＋)進(jìn)行重組表達(dá)時額外引入His標(biāo)簽、T7Tag標(biāo)簽以及酶切位點等堿基序列，所以獲得 wtHBc、m＋HBc和m-HBc的理論相對分子質(zhì)量分別為20800、22100和21800．純化后HBc樣品的還原性SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖5所示．在破碎全菌液、破碎上清液以及純化樣品的電泳條帶中均可見位于14000～25000的目的HBc條帶．純化之后HBc樣品的雜條帶明顯減少，表明親和色譜純化效果較好，HBc純度較高．此外，通過比較破碎全菌液和破碎上清液的HBc條帶，發(fā)現(xiàn)上清液中wtHBc的含量略低于全菌液，表明本文使用pET-28a(＋)質(zhì)粒表達(dá)HBc時，可同時表達(dá)出可溶性HBc以及包涵體．

1—wtHBc細(xì)胞破碎液；2—wtHBc細(xì)胞上清液；3—純化后的wtHBc；m＋—m＋HBc；m-—m-HBc

2.3.2?HBc二級結(jié)構(gòu)分析

利用圓二色性光譜分析帶電多肽的插入對HBc二級結(jié)構(gòu)的影響，如圖6所示．wtHBc的圓二色性圖譜在209nm和222nm處有屬于-螺旋的特征負(fù)峰，與文獻(xiàn)[2]報道的晶體衍射結(jié)構(gòu)一致．mHBc與wtHBc具有相同的-螺旋特征負(fù)峰．根據(jù)CD圖譜，利用Beta Structure Selection方法(http：//bestsel. elte.hu/)計算HBc二級結(jié)構(gòu)的含量．得出wtHBc、?m＋HBc和m-HBc中a-螺旋的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.3%、23.1%和9.0%，β-折疊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.9%、31.0%和35.2%．可見突變后螺旋含量有所變化，但β-折疊并無明顯影響．且突變結(jié)構(gòu)依然富含螺旋結(jié)構(gòu)，而由于HBc VLPs的組裝主要受HBc單體間α-螺旋相互作用影響[2]，因此突變后從二級結(jié)構(gòu)分析不會削弱其自組裝性能．

圖6?HBc突變體的圓二色性光譜

2.3.3?HBc VLPs純化表征

通過透析組裝法，使用截留分子量14000的透析袋于4℃自組裝獲得HBc VLPs，并通過尺寸排阻色譜表征自組裝效果，如圖7所示．本文構(gòu)建的由120個wtHBc二聚體或mHBc二聚體組裝而成的＝4形式的HBc VLPs相對分子質(zhì)量約為5×106.采用的Sepharose 6Fast Flow的排阻極限為4×106的球形蛋白分子或2×106的葡聚糖分子．因而，使用Sepharose 6Fast Flow介質(zhì)分離HBc VLPs時，VLPs樣品與藍(lán)色葡聚糖2000在排阻極限位置有著相同的紫外吸收峰．圖7顯示，使用藍(lán)色葡聚糖2000測得Sepharose 6Fast Flow的排阻極限出峰位置為11～15mL，DTT的出峰位置為25～35mL．wtHBc及mHBc樣品具有11～15mL的VLPs紫外吸收峰以及25～35mL的DTT紫外吸收峰，表明wtHBc VLPs與mHBc VLPs均成功組裝．此外，HBc樣品在20～25mL處具有不存在于藍(lán)色葡聚糖2000色譜曲線中的額外紫外吸收峰．并且，盡管本文保持藍(lán)色葡聚糖2000與HBc樣品濃度相同，HBc VLPs的紫外吸收峰均低于藍(lán)色葡聚糖2000的紫外吸收峰，且mHBc VLPs的紫外吸收峰最低．造成此結(jié)果的原因可能是HBc在組裝過程中除了形成目標(biāo)VLPs，也會形成組裝中間體．組裝中間體的相對分子質(zhì)量小于VLPs，出峰于VLPs之后；遠(yuǎn)大于DTT相對分子質(zhì)量，出峰于DTT之前．故而20～25mL的紫外吸收峰為組裝中間體的紫外吸收峰，且由于組裝得不完全造成HBc VLPs的紫外吸收峰低于藍(lán)色葡聚糖2000的紫外吸收峰．同時，帶電多肽引入提供的靜電吸收作用使得mHBc間的相互作用增強(qiáng)，該作用增強(qiáng)使中間體更易形成，表現(xiàn)為mHBc色譜曲線中中間體對應(yīng)峰含量增大，而VLPs含量相應(yīng)減?。虼撕罄m(xù)還需要通過自組裝動力學(xué)過程調(diào)控以優(yōu)化該過程．

圖7?HBc VLPs純化分離圖譜

2.3.4?尺寸表征

HBc VLPs的粒徑分析如圖8所示．wtHBc VLPs和mHBc VLPs的粒徑分別為(30.44±2.23)nm和(30.19±1.85)nm．Lu等[13]的工作已經(jīng)表明HBc(aa 1～149)可形成＝4形式的VLPs，直徑為30nm．C末端聚精氨酸序列的截斷、MIR域的外源插入并不影響HBc的組裝特性．本文合成的HBc VLPs同樣為＝4對稱結(jié)構(gòu)，并且插入的聚精氨酸基團(tuán)以及聚天冬氨酸基團(tuán)位于mHBc VLPs的外表面．因此，本文所示粒徑與文獻(xiàn)[13]結(jié)果符合，表明HBc VLPs構(gòu)建成功．

圖8?HBc VLPs的DLS粒徑表征

2.4?HBc VLPs穩(wěn)定性分析

2.4.1?HBc VLPs的鹽濃度響應(yīng)性

前述HBc VLPs的色譜表征結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)HBc的組裝效率不是很理想，分析其原因可能是受溶液鹽濃度和pH值的影響．為了確定HBc VLPs組裝的最佳鹽濃度條件，進(jìn)一步研究HBc VLPs在不同鹽濃度緩沖液中的穩(wěn)定性，如圖9所示．隨著鹽濃度的增加，wtHBc VLPs(8～11mL)紫外吸收峰呈升高趨勢，直到1.0mol/L NaCl時其紫外吸收峰開始降低．表明在一定范圍(0.1～0.7mol/L)內(nèi)，鹽濃度的增加可以提高wtHBc VLPs的組裝性能．在低NaCl濃度(0.1～0.3mol/L)時，Na＋增強(qiáng)wtHBc VLPs組裝性能和穩(wěn)定性的作用明顯，表明Na＋促進(jìn)HBc VLPs組裝，與文獻(xiàn)[8]報道一致．Na＋發(fā)揮作用的機(jī)理可能為HBc VLPs的組裝是疏水結(jié)構(gòu)域包埋的過程，Na＋通過在水溶液中調(diào)控HBc的疏水性，從而調(diào)控HBc VLPs的組裝與聚集．低濃度的NaCl可促進(jìn)HBc正確組裝，而濃度過高可能會破壞掉HBc VLPs原本的疏水平衡，從而造成HBc VLPs聚集．

2.4.2?HBc VLPs的pH響應(yīng)性

為了探究正、負(fù)電荷基團(tuán)的插入對HBc VLPs在不同pH值緩沖液中的組裝及穩(wěn)定性的影響，使用凝膠過濾色譜，通過280nm處的紫外吸收光譜，分別檢測wtHBc VLPs和mHBc VLPs的pH響應(yīng)性，結(jié)果如圖10所示．在pH值5.5～9.5的范圍內(nèi)，均可觀測到wtHBc VLPs(8～10mL)的紫外吸收峰以及中間體紫外吸收峰(13～22mL)(見圖10(a))．此外，在中性pH值環(huán)境(pH＝7.4)，wtHBc VLPs的紫外吸收峰最高，表明組裝效率及穩(wěn)定性最好．當(dāng)pH值偏離7.4時，wtHBc VLPs自組裝效率及穩(wěn)定性降低．其中，VLPs的紫外吸收峰在pH＝5.5時最低，表明此pH值環(huán)境不利于wtHBc VLPs的組裝和穩(wěn)定．造成此現(xiàn)象的原因可能是，pH值的偏離使得wtHBc單體之間的靜電排斥作用力減弱，導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低．在圖10(b)中，mHBc VLPs樣品在不同pH值的紫外吸收曲線呈現(xiàn)出相同的趨勢與紫外吸收峰位置，3個紫外吸收峰依次為：mHBc VLPs峰(7～10mL)、中間體峰(12～18mL)、DTT峰(18～24mL)．其中，VLPs峰略低于中間體峰，與VLPs純化表征實驗結(jié)果吻合，表明靜電相互作用的引入對單體間相互作用的擾動導(dǎo)致其中間體含量增加而使mVLP組裝體含量降低．然而，VLPs峰在pH值5.5～9.5范圍內(nèi)對應(yīng)的峰高與面積的差異不大，表明額外正、負(fù)電荷基團(tuán)的引入可提高HBc VLPs對pH值變化的耐受性，拓寬其穩(wěn)定pH區(qū)間．分析其原因可能是，MIR中正、負(fù)電荷基團(tuán)的靜電吸引作用使得VLPs中相鄰HBc單體之間的相互作用力增強(qiáng)，并在VLPs的外表面形成一層致密的靜電相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而加強(qiáng)VLPs的穩(wěn)定.

2.4.3?形貌分析

在pH響應(yīng)性實驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)pH值對wtHBc VLPs穩(wěn)定性影響的差異較大，為了闡明pH值變化對其作用關(guān)系，進(jìn)一步比較其在不同pH值環(huán)境中的組裝和穩(wěn)定性差異．利用AFM分析其在pH＝7.4和pH＝6.5時的顆粒形貌及尺寸特征，結(jié)果分別如圖11和圖12所示．在兩種pH值條件下，VLPs吸附于云母片表面，并發(fā)生橫向上的聚集．豎直方向上顆粒表面平滑，呈現(xiàn)出尖筍狀的凸起形態(tài)．此外，由于橫向聚集程度的不同，視野中的白色斑點大小不一．顆粒尺度分析結(jié)果顯示，wtHBc VLPs在pH＝6.5和pH＝7.4時的粒徑分布分別在20～40nm和15～35nm之間．pH＝6.5時，wtHBc VLPs的粒徑主要在20～30nm之間，部分顆粒的粒徑增大至40nm．而wtHBc在pH＝7.5時有顆粒粒徑分布于30～35nm，與文獻(xiàn)[13]報道粒徑值一致．因而，pH＝7.4較pH＝6.5有利于wtHBc VLPs組裝和穩(wěn)定．

圖11?pH＝6.5時wtHBc VLPs的AFM形貌和粒徑表征

圖12?pH＝7.4時wtHBc VLPs的AFM形貌和粒徑表征

2.4.4?不同pH值下wtHBc VLPs的粒徑分析

為了進(jìn)一步驗證pH值對wtHBc VLPs的影響作用，采用DLS分析其在pH為7.4和6.5時的粒徑，結(jié)果如圖13所示．在pH為7.4和6.5時，wtHBc VLPs的粒徑峰值分別為32.80nm和43.82nm，前者更加接近于文獻(xiàn)[17]報道的HBc VLPs正確組裝的理論粒徑.在pH＝6.5時，wtHBc VLPs的粒徑略微偏大，在300nm左右也有出峰．造成此現(xiàn)象的原因可能是，wtHBc的理論等電點為5.95，在pH＝6.5時所攜帶凈負(fù)電荷少于pH＝7.4時所攜帶凈負(fù)電荷，維持靜電平衡狀態(tài)的靜電排斥作用力減弱，從而更容易形成大粒徑聚集體．因此，pH值通過影響wtHBc單體間的靜電排斥作用而影響其組裝狀態(tài)．wtHBc在?pH＝7.4時，所攜帶凈電荷量有益于維持wtHBc VLPs靜電相互作用，偏離此pH值使其靜電排斥作用減弱，所以在pH＝7.4的水溶液中穩(wěn)定性最好．

圖13 不同pH值下wtHBc VLPs的DLS粒徑表征

2.4.5?HBc VLPs組裝穩(wěn)定差異性的定量分析

根據(jù)HBc VLPs的pH響應(yīng)性色譜實驗的原始數(shù)據(jù)，算出體積變化值(Δ)與紫外吸收(UV280)變化值(Δ)，并求出Δ/Δ．以Δ/Δ的變化為依據(jù)，算出Δ/Δ開始變化至第2次為0時的ΣΔ·Δ(對應(yīng)HBc VLPs色譜峰積分面積)．以HBc VLPs色譜峰積分面積定量代表其穩(wěn)定性，并以HBc VLPs在pH＝7.4時的穩(wěn)定性為1，分別計算出其在其他pH值下的積分面積與pH＝7.4時積分面積的比值，將此比值作為相對穩(wěn)定性的量值．以pH值為橫坐標(biāo)、相對穩(wěn)定性為縱坐標(biāo)做圖，得到圖14所示的HBc VLPs穩(wěn)定性隨pH值變化．從圖中可以看出，wtHBc VLPs的穩(wěn)定性隨著pH＝(5.5～9.5)的升高總體呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢．其中pH＝8.5時的數(shù)據(jù)偏小，其原因可能是wtHBc VLPs在pH＝8.5時的色譜峰與中間體峰的分離程度不及其他pH值時的分離程度，使其在計算積分面積時的有效數(shù)據(jù)減少，所得實際積分面積小于理論積分面積，從而導(dǎo)致計算出的VLPs相對穩(wěn)定性偏低，在圖中即表現(xiàn)為wtHBc VLPs在pH＝8.5時出現(xiàn)異常點．而wtHBc VLPs在pH＝7.4時穩(wěn)定性最佳，而pH＝5.5時穩(wěn)定性最弱，僅為pH＝7.4時的64.2%，體現(xiàn)了wtHBc VLPs的pH響應(yīng)性．而mHBc VLPs穩(wěn)定性隨pH值變化的曲線相對平滑，在所有測試pH值下的相對穩(wěn)定性均在88.3%以上，且其在pH＝5.5時的相對穩(wěn)定性高出wtHBc VLPs在pH＝5.5時相對穩(wěn)定性的24.1%．此結(jié)果表明mHBc VLPs對pH值變化的耐受性增強(qiáng)，穩(wěn)定性相對于wtHBc VLPs明顯提高．

圖14?HBc VLPs穩(wěn)定性隨pH值變化

3?結(jié)?語

本文通過帶電多肽引入改造HBc VLPs，以提高其穩(wěn)定性，獲得pH響應(yīng)型VLPs．通過在wtHBc的Pro79和Ala80之間分別插入帶電多肽RRRRRRRR和DDDDDDDD，成功構(gòu)建正電荷突變的m＋HBc和負(fù)電荷突變的m-HBc．突變體m＋HBc和m-HBc的二級結(jié)構(gòu)富含a-螺旋，與wHBc一致．wtHBc和mHBc均可在體外實現(xiàn)自組裝，且組裝過程及組裝體穩(wěn)定性受離子強(qiáng)度和pH值影響．正、負(fù)電荷基團(tuán)的引入，可調(diào)節(jié)蛋白組裝基元的荷電性質(zhì)，使mVLPs對pH值變化的耐受性增強(qiáng)，穩(wěn)定性提高．本研究設(shè)計將有助于VLPs在納米結(jié)構(gòu)材料及載體方向的研究應(yīng)用．

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Construction and Characteristics of Charge Modified-Hepatitis B Virus Core Protein Virus-Like Particles

Zhang Lin，Chen Heng

(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The hepatitis B virus core protein (HBc) can self-assemble into icosahedral virus-like particles (VLPs). However, their application is limited by their low assembly efficiency and low stability. For this paper, charged polypeptides RRRRRRRR or DDDDDDDD were inserted into the major immunodominant region (MIR) of wild-type HBc (wtHBc) to improve VLPs stability through the electrostatic interactions formed by the charged groups. The mutants (mHBc) were then obtained by expression in recombinant, including one form with an extra positive charge (m+HBc) and one with a negative charge (m-HBc). An α-helix structure was observed in mHBc, which was consistent with wtHBc. Using the equimolecular mixtures of m+HBc and m-HBc, successful self-assembly into VLPs nanoparticles with a particle size of (30.44±2.23) nm was observed, which was consistent with wtHBc VLPs. Assembly process and stability were affected by ionic strength and pH values. The change in stability of the VLPs in different buffers was characterized by size exclusion chromatography, atomic force microscopy, and dynamic light scattering. It was found that the wtHBc VLPs could exist in solutions containing 0.3—0.7 mol/L NaCl. Reduced stability was observed once their ionic strength deviated from this range. Optimized assembly of wtHBc VLPs was obtained at pH＝7.4. Deviation from this pH value caused a decrease of stability. Significant decrease of stability was observed when pH value fell below 5.5, which was only 64.2% of that at pH＝7.4. For mHBc VLPs, no obvious difference in stability was observed at various pH values, and relative stability of more than 88.3% was observed at the tested pH range of 5.5—9.5. Thus, the improved tolerance of HBc VLPs to pH changes could be obtained by the introduction of extra electrostatic interactions through charged amino acid residues; and, thus, a broader stable pH range and enhanced stability of VLPs were achieved, which could be beneficial to its applications.

hepatitis B virus core protein(HBc)；charge；virus-like particles(VLPs)；nanostructure；protein modification

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 21978205，No. 91534119)，the National Key Research and Development Program of China(No. 2018YFA0900700)，the Innovation Foundation of Tianjin University.

Q816

A

0493-2137(2020)05-0450-09

10.11784/tdxbz201904068

2019-04-25；

2019-07-17.

張?麟（1981—??），男，博士，教授.

張?麟，linzhang@tju.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項目(21978205，91534119)；國家重點研發(fā)計劃資助項目(2018YFA0900700)；天津大學(xué)自主創(chuàng)新基金項目.

(責(zé)任編輯：田?軍)