謝新宇 梅陽陽 付長龍 邱志偉 林晴 黃艷峰 鄭春松

【摘 要】目的：基于核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）炎癥相關(guān)信號通路，觀察烏頭湯水提物對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞炎癥模型的影響。方法：①制備烏頭湯水提物;②分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞;③噻唑藍(lán)（MTT）法檢測烏頭湯對LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞活性的影響;采用Western Blot法檢測NF-κB p65、IκB激酶復(fù)合物（IKK）、磷酸化核因子κB抑制蛋白（pIκB）含量表達。結(jié)果：①MTT實驗結(jié)果顯示，烏頭湯水提物對LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的最佳干預(yù)時間和濃度分別為24 h和150 μg·mL-1;②Western Blot檢測結(jié)果顯示，烏頭湯水提物100 μg·mL-1組、150 μg·mL-1組、200 μg·mL-1組對LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞干預(yù)24 h后，可調(diào)節(jié)與炎癥相關(guān)的NF-κB p65、IKK、pIκB含量表達，尤其以烏頭湯水提物150 μg·mL-1組變化顯著（P < 0.01）。結(jié)論：烏頭湯通過降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中與炎癥相關(guān)的NF-κB途徑調(diào)節(jié)因子含量表達，發(fā)揮抗炎作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;烏頭湯;軟骨細(xì)胞;炎癥反應(yīng);大鼠

【ABSTRACT】Objective：Based on the signal pathway related to the nuclear transcription factor-κB（NF-κB）inflammation，to observe the effect of water extract of Wutou Tang（烏頭湯）on lipopolysaccharide（LPS）-induced inflammatory model of chondrocytes in vitro.Methods：①The water extract of Wutou Tang was prepared;②Chondrocytes were isolated and cultured;③MTT method was used to detect the effect of Wutou Tang on LPS-induced chondrocyte activity;and Western Blot method was used to detect the expression of NF-κB p65，IKK，PIκB.Results：①MTT assay showed that the best intervention time and concentration of Wutou Tang water extract on LPS-induced chondrocytes were 24 hours and μg·mL-1 respectively;②Western Blot assay showed that after 24 h intervention to the LPS-induced chondrocytes in the 100 μg·mL-1 group，the 150 μg·mL-1group and the 200 μg·mL-1 group，the protein expression of NF-κB p65，IKK，PIκB related to inflammation could be regulated especially the 150 μg·mL-1of Wutou Tang water extract changed significantly（P < 0.01）.Conclusion：Wutou Tang plays an anti-inflammatory role by reducing the expression of NF-κB pathway regulatory factor in LPS induced chondrocytes.

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種由生物因素及力學(xué)異常失穩(wěn)等因素致使膝關(guān)節(jié)部位的關(guān)節(jié)軟骨變性退化、漸行性破壞或伴骨贅繼發(fā)性增生為主的慢性關(guān)節(jié)疾病，臨床常以膝關(guān)節(jié)慢性疼痛、活動受限乃至僵硬等癥狀伴隨始終，致殘率頗高[1-2]。因此，減輕患者疼痛并改善其關(guān)節(jié)功能是目前治療KOA的首選策略[3]。

烏頭湯源于張仲景的《金匱要略》，具有扶正祛邪、利達關(guān)節(jié)之效，兼可祛風(fēng)寒逐濕邪，發(fā)揮除痹消痛作用，整體切合膝骨痹的治療病機，本方由烏頭、麻黃、黃芪、芍藥、甘草組成，其中君藥烏頭可入足厥陰肝經(jīng)與足少陰腎經(jīng)，其性疏利迅捷，通達關(guān)腠，破膝骨痹之寒凝之力甚捷，故治療歷節(jié)脹痛、不可伸屈療效獨特[4]。臨床研究顯示，烏頭湯可有效改善KOA患者臨床癥狀，延緩疾病進展[5]。

經(jīng)外界刺激后，異常致炎因子脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等可與軟骨細(xì)胞表面對應(yīng)受體結(jié)合，并通過胞質(zhì)側(cè)結(jié)構(gòu)域招募相關(guān)的接頭蛋白，而此部分接頭蛋白可吸引并激活發(fā)生核因子κB抑制蛋白（IκB）激酶復(fù)合物（IKK）[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過將IKKβ基因轉(zhuǎn)移至正常大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)，可誘發(fā)炎性病理改變（關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹）等關(guān)節(jié)炎癥狀[7]。而激活后的IKK可通過誘導(dǎo)IκB的兩個保守絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，其中隨著磷酸化核因子κB抑制蛋白α（pIκBα）的產(chǎn)生與釋放，在泛素化作用下，IκB可在蛋白體（26 S）作用下發(fā)生降解，隨后處于降解后狀態(tài)的IκB與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65發(fā)生分離（即NF-κB p65脫離IκB的抑制作用），發(fā)生活化的NF-κB p65進入細(xì)胞核，最終導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)生[8]。

因此，本實驗通過制備軟骨細(xì)胞炎癥模型，觀察烏頭湯對LPS誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞中NF-κB信號通路中關(guān)鍵信號分子水平表達情況，探究烏頭湯延緩KOA大鼠軟骨退變的抗炎作用機制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4周齡SPF級健康SD雄性大鼠25只，體質(zhì)量（90±5）g，購自斯萊克（上海）實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)環(huán)境常年溫度控制在23～25 ℃，濕度55%～60%，每小時換風(fēng)16次，12 h光照/12 h黑暗自動控制循環(huán)光照條件。清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證號SYXK （閩） 2014-0001。實驗中對動物處置符合科技部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 主要試劑 烏頭湯（藥物組成：制川烏6 g、麻黃9 g、黃芪9 g、白芍9 g、炙甘草9 g），藥材購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院;噻唑藍(lán)（MTT，Sigma）;磷酸鹽緩沖液（HyClone）;DMEM/LOW GLUCOSE（生產(chǎn)批號NZK1239，HyClone）;PMSF蛋白酶抑制劑、蛋白上樣緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH =?8.8與pH = 6.8）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、10 × 電泳液、過硫酸銨（AP）、ECL發(fā)光顯影液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;10×TBST（北京索萊寶科技有限公司）;玻板（生產(chǎn)批號1653311，美國BIO-RAD公司）;一抗（兔抗）：NF-κB p65、IKK、pIκB;二抗（羊抗兔）（美國CST公司）;1-StepTM Transfer Buffer（生產(chǎn)批號PA196400，Thermo）。

1.3 主要儀器 熒光型顯微鏡（Olympus，TKO）;無菌操作臺（AIRTECH型，蘇州安泰）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國Heraus公司）;凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國BIO-RAD公司）;離心機（5417R型，德國Eppendorf公司）等。

2 方 法

2.1 烏頭湯水提物的制備 烏頭湯水回流提取

2次，每次2 h，合并提取液，抽濾，濃縮成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重;待經(jīng)低溫下研磨成粉末狀，精確稱量浸膏50 mg，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的FBS培養(yǎng)基5 mL溶解，超聲10 min，再經(jīng)0.22 μL無菌濾嘴濾過后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，配?0 mg·mL-1烏頭湯水提物母液，備用。

2.2 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 其步驟依次為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉成功后，每次人工處死大鼠3只（經(jīng)行脫頸椎式），浸泡消毒，離斷至雙側(cè)膝關(guān)節(jié)以上骨骼，PBS緩沖液沖洗凈，再次浸泡消毒，暴露關(guān)節(jié)腔，按層次分離關(guān)節(jié)軟骨，集中后經(jīng)剪碎處理（1 mm3/單位體積），PBS緩沖液沖洗3遍及以上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化，無菌試管收集消化后的上清液（每次2 h，重復(fù)3次），高速離心后棄上清液，移液器代液狀態(tài)輕柔吹打沉淀，計數(shù)板計數(shù)（2×105·mL-1），種植原代細(xì)胞于培養(yǎng)瓶進行孵化培養(yǎng)，48 h后初次換液，鏡下觀察細(xì)胞鋪滿絕大數(shù)瓶底，PBS緩沖液沖洗倒凈，胰酶消化進行傳代培養(yǎng)，標(biāo)為第1代軟骨細(xì)胞。以同樣方法傳至第3代細(xì)胞，鏡下觀察分析比較后，選取狀態(tài)及活性最佳的第2代軟骨細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.3 軟骨細(xì)胞致炎模型的復(fù)制 以潔凈培養(yǎng)瓶（規(guī)格4 mL/瓶）為載體培育第2代軟骨細(xì)胞（計數(shù)2500個·mL-1），置于37 ℃培養(yǎng)箱中（含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2）孵育細(xì)胞，每隔24 h更換一次培養(yǎng)液，待軟骨細(xì)胞沿瓶壁生長占滿約90%的空間時，按本課題組前期造模方式[9]，經(jīng)10 ng·mL-1LPS干預(yù)軟骨細(xì)胞8 h后復(fù)制軟骨細(xì)胞炎癥模型。

2.4 MTT比色試驗測定軟骨細(xì)胞活性 以96孔板為載體培育經(jīng)計數(shù)為2×103/孔的第2代軟骨細(xì)胞24 h后，再饑餓細(xì)胞同步培養(yǎng)12 h，棄去舊液，標(biāo)記分組并進行干預(yù)。①空白對照組：使用移液槍添加100 μL體積/單孔的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM）。②模型對照組：先向每反應(yīng)孔中加入含LPS（10 ng·mL-1）的培養(yǎng)基100 μL體積，待反應(yīng)8 h后倒凈舊液，再添加100 μL體積/單孔的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。③烏頭湯水提物各濃度（50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）組：向反應(yīng)孔中加入劑量為10 ng·mL-1的LPS培養(yǎng)基100 μL，作用8 h后，更換為烏頭湯水提物各濃度組分別培養(yǎng)6，12，24，48 h。后續(xù)操作依次為：棄凈每孔舊液，37 ℃溫箱MTT（每孔100 μL）反應(yīng)5 h，二甲基亞砜（DMSO）振蕩條件下反應(yīng)10 min （100 μL/孔），酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測每孔OD值并記錄與分析。

2.5 Western Blot檢測NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量表達 在6孔板各孔中央部接種含有第2代

軟骨細(xì)胞的重懸液（1×105個·mL-1），待軟骨細(xì)胞爬片孵育后，標(biāo)記分組并進行干預(yù)。①空白對照組：使用移液槍添加2 mL體積/單孔的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM）。②模型對照組：先向每反應(yīng)孔中加入含LPS（10 ng·mL-1）的培養(yǎng)基2 mL體積，待反應(yīng)8 h后倒凈舊液，再添加2 mL體積/單孔的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。③烏頭湯100 μg·mL-1組：向反應(yīng)孔中加入劑量為10 ng·mL-1的LPS培養(yǎng)基2 mL，作用8 h后更換為100 μg·mL-1濃度烏頭湯水提物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。④烏頭湯150 μg·mL-1組：向反應(yīng)孔中加入劑量為10 ng·mL-1的LPS培養(yǎng)基2 mL，作用8 h后更換為150 μg·mL-1濃度烏頭湯水提物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。⑤烏頭湯200 μg·mL-1組：向反應(yīng)孔中加入劑量為10 ng·mL-1的LPS培養(yǎng)基2 mL，作用8 h后更換為200 μg·mL-1濃度烏頭湯水提物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組軟骨細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后，棄去原培養(yǎng)基，移液槍吸入預(yù)冷的PBS緩沖液4 mL后進行輕柔振蕩漂洗，共計2次;倒掉瓶內(nèi)PBS，調(diào)至20 μL移液槍，充分吸凈瓶內(nèi)視野面中的PBS殘留，加入預(yù)冷的RIPA裂解液（含1 mmol·L-1 PMSF），轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱充分裂解，每隔10 min輕輕搖勻，以使裂解液充分裂解全部細(xì)胞，共計3次;使用無菌細(xì)胞刮刀緊貼瓶壁由上而下，由左至右進行刮?。ū喜僮鳎?，并收集至提前預(yù)冷的EP管中;冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)移EP管至提前預(yù)冷的4 ℃高速離心機中，以15 000 r·min-1離心20 min，離心半徑10 cm，然后取出EP管，插入冰盒內(nèi)，移液槍輕輕吸取上清，并轉(zhuǎn)移至提前標(biāo)記且預(yù)冷的新的EP管中，此為提取的軟骨細(xì)胞蛋白。進行蛋白定量分析（BCA法）后，配制體積分?jǐn)?shù)為12%的分離膠與體積分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，進行上樣（20 μg/孔），電泳條件為：恒流下，以20 V電壓先跑10 min，再調(diào)制50 V電壓跑30 min，最后調(diào)整到100 V電壓跑至分離膠底部;轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交（NF-κB p65、IKK、pIκB的一抗?jié)舛?∶1000）、顯影及分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗與單因素方差分析;計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞觀察 鏡下觀察細(xì)胞外觀形態(tài)近似圓形，大小基本一致，且遮光性強為原代軟骨細(xì)胞;大鼠軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)2 d后大多數(shù)軟骨細(xì)胞開始緊貼壁生長，形似扁平狀;培養(yǎng)6 d后，軟骨細(xì)胞開始聚集重疊并沿瓶壁擴散生長，呈現(xiàn)“簇團樣”集聚，外觀以圓形或橢圓形為主;8 d后細(xì)胞分布均勻，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀外觀;本實驗使用第2代軟骨細(xì)胞。見圖1。

3.2 MTT比色試驗測定軟骨細(xì)胞活性結(jié)果 MTT法檢測烏頭湯水提物在不同濃度（0，50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）及不同時間（6，12，24，48 h）對軟骨細(xì)胞活性的影響。經(jīng)烏頭湯水提物各濃度組干預(yù)24 h時對軟骨細(xì)胞活性影響：模型對照組OD值均明顯低于空白對照組（P < 0.01），烏頭湯水提物不同濃度組（50，100，150，200，400，600 μg·mL-1）干預(yù)24 h后的OD值均高于模型對照組（P < 0.05或P < 0.01），且以150 μg·mL-1組最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），見圖2（1）。經(jīng)150 μg·mL-1烏頭湯水提物組干預(yù)各時段后對軟骨細(xì)胞活性影響：24 h的OD值較6，12，48 h明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），見圖2（2）。從而得出，烏頭湯水提物干預(yù)退變軟骨細(xì)胞后，對其活性具有一定的時效-量效關(guān)系，其最佳干預(yù)時間和濃度分別為24 h和150 μg·mL-1。

3.3 Western Blot結(jié)果 Western Blot結(jié)果顯示，? 烏頭湯水提物干預(yù)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞后，可下調(diào)NF-κB p65、IKK、pIκB 蛋白含量表達。與空白對照組比較，模型對照組NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.01）;在NF-κB p65、IKK、pIκB指標(biāo)上，與模型對照組比較，烏頭湯水提物組（100，150，200 μg·mL-1）的蛋白含量均顯著降低，其中以實驗2組（烏頭湯水提物150 μg·mL-1）蛋白含量的表達影響顯著（P < 0.01）。提示烏頭湯水提物可通過調(diào)控NF-κB p65、IKK、pIκB蛋白含量表達，在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)程度，進而延緩軟骨細(xì)胞的退變進程。見圖3、圖4。

4 討 論

KOA屬中醫(yī)學(xué)“膝骨痹”范疇，多為氣血、肝腎虧虛引起筋骨失養(yǎng)，外加風(fēng)寒濕邪侵襲，留駐關(guān)節(jié)，以及外傷勞損加劇病變，致使痹證日久，邪氣久羈，深筋入骨，氣血不暢，經(jīng)絡(luò)郁阻，故關(guān)節(jié)腫痛，不可伸屈。中醫(yī)病機為“本虛標(biāo)實”“本痿標(biāo)痹”[10]。烏頭湯臨床上治療KOA具有良效，究其原因，烏頭湯溫陽祛濕、散寒止痛、補益氣血、利達關(guān)節(jié)之功切合KOA病機，可內(nèi)外兼顧，進而發(fā)揮祛因通痹的作用[11]。方中君藥制川烏溫陽下行，開關(guān)節(jié)祛寒濕，通經(jīng)絡(luò)逐冷痹;臣藥麻黃性辛溫，可行宣散風(fēng)寒、通利氣機之效，君主臣佐，兩藥配伍，可加強祛風(fēng)散寒、除濕行痹的作用;黃芪補益氣血、實衛(wèi)肌表，同時又可兼解君臣兩藥之辛熱過盛之功;芍藥酸甘化陰，養(yǎng)血調(diào)經(jīng);炙甘草可散表寒、補中益氣，同時還可調(diào)和藥性，解川烏之毒[12]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，烏頭湯可下調(diào)大鼠血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3水平，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用，進而延緩軟骨退變[13]。由此提示，烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的機制可能為調(diào)控與炎癥相關(guān)的信號通路分子水平的表達。為進一步研究其作用機制，課題組以NF-κB信號通路為切入點進行了深入研究。NF-κB蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白重要成員之一，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)中起到重要的作用。通常，NF-κB在體內(nèi)主要以p50和p65結(jié)合構(gòu)成的異二聚體形式存在。正常狀態(tài)時，NF-κB（p50/p65）與抑制蛋白IκB結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)，當(dāng)聚合物受到外界病原因素（如LPS、IL-1β、TNF-α等）刺激后，可激活TAK1，導(dǎo)致IκB被磷酸化發(fā)生降解，活化后的二聚體從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)移到細(xì)胞核內(nèi)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。換言之，LPS等炎癥因子可引起NF-κB信號通路的活化，而此通路的活化又可誘導(dǎo)炎癥因子形成，進而加劇炎癥反應(yīng)對關(guān)節(jié)軟骨的損害[14]。本研究結(jié)果顯示，烏頭湯水提物可調(diào)控LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中NF-κB p65信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子NF-κB p65、IKK、pIκB的蛋白含量表達，在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，進而延緩LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退變進程。

綜上所述，烏頭湯水提物可通過調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的致炎軟骨細(xì)胞與NF-κB p65信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子含量表達，發(fā)揮抗炎作用，但其基于相關(guān)Lnc RNA與微小mRNA的微觀調(diào)控機制及烏頭湯的干預(yù)機制仍有待深入探討。

參考文獻

[1] LIN J，WU GW，ZHAO ZS，et al.Bioinformatics analysis to identify key genes and pathways influencing synovial inflammation in osteoarthritis[J].Mol Med Rep，2018，18（6）：5594-5602.

[2] FU CL，ZHENG CS，LIN J，et al.Cibotium barometz polysaccharides stimulate chondrocyte proliferation in vitro by promoting G1/S cell cycle transition[J].Mol Med Rep，2017，15（5）：3027-3034.

[3] LIN J，WU GW，CHEN J，et al.Electroacupuncture inhibits sodium nitroprusside mediated chondrocyte apoptosis through the mitochondrial pathway[J].Mol Med Rep，2018，18（6）：4922-4930.

[4] 梅陽陽，付長龍，龐書勤，等.烏頭湯藥理藥效研究及其干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的機制探討[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（6）：47-50.

[5] 付長龍，梅陽陽，葉錦霞，等.烏頭湯治療寒濕痹阻型膝骨關(guān)節(jié)炎：與雙氯芬酸鈉的比較[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2017，6（4）：12-16.

[6] 潘建科，謝輝，劉軍，等.龍鱉膠囊對骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞p38MAPK信號通路及NF-κB p65的調(diào)控研

究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（1）：65-69.

[7] 湯發(fā)強，吳宏，鄭建章，等.蜂毒肽對大鼠退行性骨關(guān)節(jié)病軟骨細(xì)胞NF-κB信號通路的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2017，13（37）：3132-3134.

[8] HU ZC，XIE ZJ，TANG Q，et al.Hydroxysafflor yellow A（HSYA）targets the NF-κB and MAPK pathways and ameliorates the development of osteoarthritis[J].Food Funct，2018，9（8）：4443-4456.

[9] 陳后煌，邵翔，葉蕻芝，等.獨活寄生湯對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥模型IL-1β、TNF-α表達的影響[J].中華老年骨科與康復(fù)電子雜志 ，2017，3（2）：77-84.

[10] 劉獻祥.中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的研究現(xiàn)狀[J].中醫(yī)正骨，2012，24（1）：3-7.

[11] 陳達，陳后煌，邵翔，等.烏頭湯抑制骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的作用機制探討[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（8）：62-66.

[12] 晁利芹.王付教授運用烏頭湯加減治療痹證心得[J].中醫(yī)學(xué)報，2014，29（1）：38-39.

[13] 陳俊，葉錦霞，林潔，等.烏頭湯對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3的影響[J].福建中醫(yī)藥，2017，48（5）：27-29.

[14] QUAN R，HUANG Z，YUE Z，et al.Effects of a proteasome inhibitor on the NF-κB signalling pathway in experimental osteoarthritis[J].Scand J Rheumatol，2013，42（5）：400-407.

收稿日期：2019-07-11;修回日期：2019-08-23