云 濤，華炯鋼，葉偉成，倪 征，陳 柳，張 存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

鴨呼腸孤病毒病是由鴨呼腸孤病毒(duck reovirus，DRV)引起的番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨、綠頭野鴨和鵝等水禽的急性傳染病[1-3]。自1997年以來(lái)，我國(guó)廣東、福建、浙江和廣西等番鴨養(yǎng)殖地暴發(fā)了一種以軟腳為臨床癥狀，以肝、脾表面有少量白點(diǎn)為主要病理變化的“番鴨肝白點(diǎn)病”，經(jīng)鑒定該病病原為經(jīng)典鴨呼腸孤病毒(classical duck reovirus，CDRV)，即番鴨呼腸孤病毒(muscovey duck reovirus，MDRV)，屬于基因Ⅰ型[4-6]。自2000年以來(lái)，在我國(guó)江蘇、浙江、福建、廣東、河北、山東等地廣泛流行一種鴨新型呼腸孤病毒病，病鴨肝臟出現(xiàn)不同程度點(diǎn)斑和塊狀出血，脾臟腫大甚至壞死，發(fā)病率5%～40%，病死率10%～50%，且病鴨日齡愈小，其發(fā)病率、病死率愈高，經(jīng)分離鑒定該病原為鴨新型呼腸孤病毒(novel duck reovirus，NDRV)，屬于基因Ⅱ型[7]。

NDRV與CDRV同屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)，正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，為分節(jié)段的雙股RNA病毒。NDRV含有10個(gè)RNA片段，即3個(gè)大基因L1、L2、L3，分別編碼λA、λB、λC蛋白；3個(gè)中基因M1、M2、M3，分別編碼μA、μB、μN(yùn)S蛋白；4個(gè)小基因S1、S2、S3、S4，分別編碼σA、σB、σC、σNS、P10、P18蛋白；其中8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]。NDRVS3基因具有不同于MDRV和禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)S3基因的分子特征[8-9]。根據(jù)其S3基因的差異，常采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)NDRV。已有研究主要采用兩步法進(jìn)行NDRV qRT-PCR檢測(cè)[10-12]，即先對(duì)樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，該方法操作復(fù)雜，易污染。本研究根據(jù)GenBank公布的NDRVS3基因序列進(jìn)行分析比較，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性擴(kuò)增引物和1個(gè)MGB探針引物，利用體外轉(zhuǎn)錄的NDRVS3基因作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，并與常規(guī)qRT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，旨在為NDRV的早期診斷、分子流行病毒學(xué)調(diào)查及疫苗研制提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株

新型鴨呼腸孤病毒(NDRV JDm10)、經(jīng)典鴨呼腸孤病毒(CDRV ZJ2000M)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV ZJ407)、鴨瘟病毒(duck plague virus，DPV)、鴨源新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、番鴨細(xì)小病毒(muscovy duck parvovirus，MDPV)、Ⅰ型鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus 1，DHAV-1)和H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室分離保存；宿主菌大腸埃希菌DH-5α由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室繁殖保存。

1.1.2 主要試劑儀器

One Step PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、MiniBEST病毒核酸提取試劑盒、MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、MiniBEST質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pBluescript Ⅱ SK(+)載體購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。MEGAscript?T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、MEGA clearTM凈化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。核酸分析儀購(gòu)自Quawell公司；ABI 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中NDRV JDm10、CDRV ZJ2000M、DTMUV ZJ407、DPV、NDV、MDPV、DHAV-1和AIV等病毒的S3基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇保守序列作為擴(kuò)增區(qū)域，采用Primer Primier 3.0軟件設(shè)計(jì)引物和MGB探針，該探針5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB，預(yù)擴(kuò)增片段為128 bp。上游引物P1：5′-ACAAGTGTCATCAACAGCAATATCG-3′；下游引物P2：5′-ATCATAGTAATCTGCAATGACATGCA-3′；MGB探針：FAM-CGCACTACAGAGCAA-MGB。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品的制備

按照病毒核酸提取試劑盒操作說(shuō)明提取NDRV JDm10總RNA，以P1和P2為引物，擴(kuò)增獲得特異性目的條帶，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒切膠回收后，將目的片段定向插入pBluescript Ⅱ SK(+)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并由大連寶生物公司測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒(pSK-SigB)用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ進(jìn)行線性化，然后使用MEGAscript?T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)線性化產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，經(jīng)DNaseⅠ消化后得到單鏈目的基因RNA，再用MEGA clearTM純化試劑盒進(jìn)行純化，最終獲得標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品。使用核酸分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)RNA濃度和純度，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄獲得的RNA分子量計(jì)算拷貝數(shù)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

以制備的標(biāo)準(zhǔn)品RNA為模版，參照One Step PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用20 μL反應(yīng)體系，通過(guò)矩陣法對(duì)引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的工作濃度，獲得最佳的反應(yīng)體系。通過(guò)設(shè)置不同的退火溫度(52～60 ℃)，根據(jù)反應(yīng)擴(kuò)增曲線和Ct值的大小，以確定最佳退火溫度。反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，52～60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將制備的標(biāo)準(zhǔn)品RNA按10倍倍比稀釋?zhuān)凑?.2.3節(jié)中優(yōu)化的一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。

1.2.5 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)品RNA進(jìn)行101～1010倍比稀釋?zhuān)M(jìn)行一步法熒光定量RT-PCR檢測(cè)，以確定該方法的敏感性。

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn)

以CDRV、DHV-1、DTMUV、H9N2 AIV、NDV的RNA，以及MPV和DPV的DNA為模板，在相同的條件下進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證引物和探針的特異性，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(NDRV DF-1細(xì)胞RNA)和陰性對(duì)照(正常DF-1細(xì)胞RNA為模板)。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

以稀釋成1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104拷貝·μL-1這5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品RNA為模版，進(jìn)行qRT-PCR分析，分別進(jìn)行3次批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。計(jì)算組內(nèi)與組間變異系數(shù)。根據(jù)獲得的Ct值，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出組內(nèi)與組間反應(yīng)Ct值的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)，以確定該方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 臨床樣品的檢測(cè)

使用建立的一步法qRT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)2011—2015年間臨床收集的浙江各地239份疑似DRV病料(肝臟和脾臟)進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步法MGB探針qRT-PCR方法的優(yōu)化

最佳反應(yīng)體系為20 μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL、TaKaRa ExTaqHS 0.4 μL、 Prime Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、MGB探針(10 μmol·L-1)0.8 μL、模版2 μL、熒光染料0.4 μL、RNase Free ddH2O 5.2 μL。最佳退火延伸溫度為54 ℃。最佳反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，54 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍比系列稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×109拷貝·μL-1～1.0×101拷貝·μL-1)為模版，優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR反應(yīng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性化關(guān)系，y=-3.477x+42.504，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

2.3 敏感性試驗(yàn)

將RNA標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋?zhuān)媒⒌囊徊椒═aqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)低限為10拷貝·μL-1，且有典型的擴(kuò)增曲線，具有良好的敏感性。

1～9：1.0×109～1.0×101拷貝·μL-1。下同。 1-9: 1.0×109～1.0×101 copies·μL-1. The same as below.圖1 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.1 The amplification (A) and standard (B) curve of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR for NDRV

2.4 特異性試驗(yàn)

用建立的一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法對(duì)CDRV、DHV-1、DTMUV、H9N2 AIV、NDV、MPV、DPV、NDRV陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的核酸進(jìn)行檢測(cè)(圖3)。結(jié)果顯示，僅NDRV核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他病毒的核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法具有很好的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)檢測(cè)，組內(nèi)和組間Ct變異系數(shù)均小于2%(表1)，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

采用建立的一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法對(duì)臨床采集的239份疑似病例樣品(肝臟、脾臟)進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，常規(guī)RT-PCR檢測(cè)239份樣品時(shí)有75份為陽(yáng)性，一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)有100份為陽(yáng)性，而且常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品用一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)時(shí)均為陽(yáng)性，符合率為100%。

圖2 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR for NDRV

1，新型鴨呼腸孤病毒陽(yáng)性對(duì)照；2，經(jīng)典鴨呼腸孤病毒；3，鴨坦布蘇病毒；4，鴨瘟病毒；5，Ⅰ型鴨甲肝病毒；6，番鴨細(xì)小病毒；7，H9N2亞型禽流感病毒；8，鴨源新城疫病毒；9，陰性對(duì)照。 1， NDRV JDm10 positive control; 2， CDRV ZJ 2000M; 3， DTMUV ZJ407; 4， DPV; 5， DHAV-1; 6， MDPV; 7， AIV; 8， NDV; 9， Negative control.圖3 NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR for NDRV

表1 一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)

Table 1 Intra assay and inter assay reproducibility of one-step real-time TaqMan-MGB RT-PCR

RNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度Concentration of standard (copies·μL-1)組內(nèi)變異實(shí)驗(yàn) Inter-assay variability平均數(shù) Mean±SD變異系數(shù) CV/%組間變異實(shí)驗(yàn) Intra-assay variability平均數(shù) Mean±SD變異系數(shù) CV/%1×10814.89±0.0660.4414.99±0.1270.851×10717.98±0.1460.8117.92±0.2651.481×10621.84±0.1630.7521.81±0.1980.911×10524.93±0.1810.7324.81±0.2721.101×10428.32±0.1870.6627.98±0.4471.60

3 討論

盡管CDRV和NDRV都屬于禽正呼腸孤病毒群成員，病毒生物學(xué)特性有很多相似性，但是兩者在致病性和抗原性上存在顯著差異。NDRV感染宿主譜擴(kuò)大，可引起各品種鴨及鵝感染發(fā)病，且致病性增強(qiáng)[14-15]。血清交叉中和試驗(yàn)表明，CDRV與NDRV間僅有弱的交叉中和作用[9]。CDRV與NDRV基因組也存在差異。首先，兩者的SDS-PAGE電泳圖譜明顯不同，CDRV為3/3/4圖式，而NDRV為3/3/1/3圖式，與ARV相同[16]；其次，L、M和S群基因組片段中，S群基因組片段序列變異性最大，S1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白σC和非結(jié)構(gòu)蛋白p10序列變異性最大[4-6，15]。研究發(fā)現(xiàn)，σC蛋白與病毒特異性中和反應(yīng)的表面抗原有關(guān)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，且該蛋白位于外衣殼的表面，可通過(guò)受體介導(dǎo)識(shí)別和附著靶細(xì)胞，具有受體功能[17-18]。因此，造成NDRV致病性、致病宿主譜擴(kuò)大的原因可能與結(jié)構(gòu)蛋白σC蛋白變異有關(guān)。

目前NDRV病毒常采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)，基本采用的都是熒光染料法[11-12]，該方法中熒光染料可與引物二聚體、引物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)和錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非特異性結(jié)合，從而造成假陽(yáng)性。采用兩步法探針qRT-PCR方法檢測(cè)NDRV時(shí)，需要對(duì)樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)步驟煩瑣，實(shí)際臨床檢測(cè)敏感性偏低[19]。本研究建立了NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)體外轉(zhuǎn)錄獲得的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)量為10拷貝·μL-1，比常規(guī)RT-PCR敏感性高100倍，并比袁遠(yuǎn)華等[11]和丁明洋等[12]建立的二步法SYBR Green熒光定量RT-PCR方法的敏感性高或相同。一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，由于直接以體外轉(zhuǎn)錄的含目的基因的RNA為模板，且反轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在同一PCR管中進(jìn)行，既降低了試驗(yàn)操作的誤差和樣品被感染的概率，又縮短了檢測(cè)時(shí)間[20]。同時(shí)，與常規(guī)TaqMan探針相比，MGB探針在不增加探針引物長(zhǎng)度時(shí)就可使探針的Tm值提高，使探針雜交的穩(wěn)定性增加，從而進(jìn)一步提高了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性[21]。

本研究建立的NDRV一步法TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，不但可以定性檢測(cè)NDRV，而且還可通過(guò)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算核酸拷貝數(shù)，以達(dá)到定量檢測(cè)的目的。其次，通過(guò)定量檢測(cè)病鴨各個(gè)組織臟器及體液中的NDRV載量，有助于確定發(fā)病鴨群整體的感染狀況及感染程度，并為該疫病進(jìn)一步的防治和防控技術(shù)提供依據(jù)。該檢測(cè)方法快速、靈敏、特異、穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便，為NDRV疫苗的研究、臨床樣品的實(shí)驗(yàn)室診斷和早期流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快捷有效的檢測(cè)方法和技術(shù)手段。