鄔菲帆，王佳怡，戴晨宇，楊如棉，徐鵬杰，管 銘，張慧娟，蔣 明

(臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000)

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)又名西蘭花、青花椰菜和意大利芥藍(lán)等，是十字花科(Cruciferae)蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜[1]。青花菜以花球和花莖為主要食用部位，它們色澤翠綠、營養(yǎng)豐富，富含礦物質(zhì)、膳食纖維、蛋白質(zhì)和維生素，還含有具抗癌作用的硫苷類物質(zhì)，青花菜已成為一種深受人們喜愛的保健蔬菜[2-3]。浙江是我國青花菜主產(chǎn)省，全省常年種植面積達(dá)1.33萬hm2，花球產(chǎn)量占全國的40%[4]。近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，浙江青花菜產(chǎn)區(qū)菌核病和霜霉病的發(fā)生十分嚴(yán)重，甚至成片受害，給菜農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國不是青花菜的原產(chǎn)地，種質(zhì)資源極為匱乏，抗病材料更是稀缺；通過挖掘與青花菜抗病相關(guān)的功能基因，并開展分子育種，是種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑之一[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物生長發(fā)育和逆境防御過程中起重要作用，其中的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)是鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成因子，它參與多種Ca2+介導(dǎo)的信號途徑，在抵御生物和非生物逆境中扮演著重要角色[6]。

Ca2+作為第二信使，參與植物發(fā)育和逆境防御過程的信號響應(yīng)，而CDPK作為Ca2+傳感蛋白，它們通過磷酸化離子通道蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和代謝酶等底物，觸發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)[7-8]。典型的CDPK具有1個(gè)S_TKc(serine/threonine protein kinases， 蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶)結(jié)構(gòu)域和多個(gè)串聯(lián)的EF手性(EF hand)結(jié)構(gòu)域。S_TKc結(jié)構(gòu)域通常由300多個(gè)氨基酸殘基組成，用于結(jié)合ATP和調(diào)節(jié)蛋白酶活性，而EF手性結(jié)構(gòu)域能與Ca2+親和結(jié)合[9]。自首次從豌豆(Pisumsativum)中分離到CDPK以來，研究人員已在鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、普通煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、鹽藻(Dunaliellasalina)、毛白楊(Populustomentosa)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)等植物中克隆得到CDPK基因，并對部分成員進(jìn)行了表達(dá)分析和功能鑒定[10-16]。但是，有關(guān)青花菜CDPK基因的研究未見報(bào)道。本研究以青花菜為材料，在克隆CDPK基因的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR技術(shù)研究它們在霜霉菌和核盤菌侵染下的表達(dá)模式，為將來開展基因功能鑒定和抗逆分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康、飽滿的Wx青花菜種子，播種于無菌基質(zhì)(椰磚∶珍珠巖∶蛭石體積比1∶1∶1)，放入人工氣候箱(溫度22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度75%)中培育幼苗。在兩葉一心期，選取生長健壯、長勢一致的幼苗移栽至新的無菌基質(zhì)中。霜霉菌的接種采用噴霧法，在0、6、12、24、36、72、96 h采集葉片。核盤菌的接種采用菌絲塊法，用直徑為6 mm的無菌打孔器切取瓊脂塊，具菌絲一側(cè)貼于葉片上表面，對照采用空白PDA塊，接種處理0、6、12、24、36、72 h采集葉片，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。葉片置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)的DNA或RNA提取。實(shí)驗(yàn)材料對菌核病和霜霉病均表現(xiàn)為低感，接種核盤菌12 h，PDA接觸位置開始發(fā)黑，72 h病斑變大，并發(fā)生腐爛；接種霜霉菌72 h，葉面出現(xiàn)少量枯斑，7 d病斑較多，周圍出現(xiàn)明顯的褪綠圈，葉背出現(xiàn)霉層。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA提取

基因組DNA和RNA的提取采用試劑盒法，試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RNA提取采用TaKaRa的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒，實(shí)驗(yàn)操作根據(jù)說明書進(jìn)行。DNA和RNA經(jīng)電泳檢測后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。cDNA的合成采用TaKaRa公司的試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。

1.2.2 青花菜CDPK基因的克隆

根據(jù)野甘藍(lán)(B.oleraceavar.oleracea， XP_013613262)和甘藍(lán)型油菜(B.napus， NP_001302636)的CDPK基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，上游和下游引物分別為5′-ATGGGCAATTCATGCCGTGG-3′與5′-CTAAGCGTCTCTCATGCTAATGTTCAG-3′。在20 μL反應(yīng)體系中，加入14.3 μL ddH2O、2.0 μL緩沖液(含20 mmol·L-1Mg2+)、0.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物(20 μmol·L-1)、2.0 μL模板DNA(20 ng·μL-1)和0.4 μLTaq酶(2 U·μL-1)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收片段，試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。連接采用TaKaRa試劑盒，在PCR管中依次加入5 μL T4 DNA連接緩沖液、1 μL T-easy載體、3 μL回收產(chǎn)物和1 μL T4 DNA連接酶，置于4 ℃冰箱中連接過夜。經(jīng)轉(zhuǎn)化、單菌落挑取和菌液PCR鑒定，取3個(gè)陽性克隆測序。

1.2.4 BoCDPK1基因的序列分析

用SMART工具(http://smart.embl.de)預(yù)測編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域；借助MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法(neighbour-joining)，經(jīng)1 000次自舉檢測。BoCDPK1的同源蛋白序列下載自NCBI，它們分別來自陸地棉(Gossypiumhirsutum)、海島棉(G.barbadense)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)、甘藍(lán)型油菜(B.napus)和蕪菁(B.rapa)等。

1.2.5BoCDPK1基因表達(dá)分析

根據(jù)測序得到的序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR上下游引物，分別為：5′-TCCATCACCATCACCCACGTTTC-3′和5′-GGTTCTTTCACGGGAAGCACAAG-3′。以肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，引物為：5′-ACGTGGACATCAGGAAGGAC-3′和5′-GAACCACCGATCCAGACACT-3′。qRT-PCR反應(yīng)在Roche LightCycler 96上進(jìn)行，分別加入10 μL 2 × Master Mix、上下游引物各0.2 μL(20 μmol·L-1)、2.5 μL cDNA和7.1 μL ddH2O；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量，每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3次。利用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性比較采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoCDPK1基因及其編碼蛋白的特征

分別以葉片基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)轉(zhuǎn)化和測序，得到各自的核苷酸序列(圖1)。結(jié)果表明，BoCDPK1的基因組DNA全長為2 414 bp，具7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，第1外顯子最長，為730 bp，第6外顯子次之，長度為225 bp，第7外顯子最短，僅111 bp；內(nèi)含子均符合GT-AG規(guī)則，長度范圍為76～354 bp，第1內(nèi)含子最長，第5內(nèi)含子次之，為88 bp，第4內(nèi)含子最短(圖2)。

BoCDPK1的編碼區(qū)全長為1 647 bp，編碼548個(gè)氨基酸。經(jīng)SMART在線工具預(yù)測，BoCDPK1具1個(gè)S_TKc結(jié)構(gòu)域和4個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)域(圖3)。S_TKc結(jié)構(gòu)域位于+89-+347處，而4個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)域分別位于+394-+422、+430-+458、+466-+494和+500-+528。

A—基因組DNA模板；B—cDNA模板。M，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1和2為PCR產(chǎn)物。 A-genomic DNA as template; B-cDNA as template。M， DNA marker; 1 and 2， PCR products.圖1 BoCDPK1基因的克隆Fig.1 Isolation of BoCDPK1 gene

方框表示外顯子，直線為內(nèi)含子。 Boxes indicated exons， and lines showed introns.圖2 BoCDPK1基因的結(jié)構(gòu)Fig.2 The gene structure of BoCDPK1

2.2 BoCDPK1的系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載BoCDPK1的同源序列進(jìn)行多重比對，這些序列中，擬南芥CDPK(OAP08681)參與氣孔開閉，還與受傷導(dǎo)致的乙烯生物合成相關(guān)；其他基因的功能未知。序列比對結(jié)果表明，BoCDPK1與甘藍(lán)型油菜、蕪菁和野甘藍(lán)(B.oleraceavar.oleracea)的序列相似性較高，僅個(gè)別氨基酸殘基存在差異。與野甘藍(lán)相比，BoCDPK1在+47、+48和+52位存在N氨基酸的缺失。與4種蕓薹屬植物相比，擬南芥CDPK序列上存在多處插入、缺失和變異現(xiàn)象(圖4)。3種棉屬植物CDPK序列之間也十分保守，僅在個(gè)別氨基酸殘基上發(fā)現(xiàn)差異，但它們與其他物種CDPK的序列差異較大。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，青花菜BoCDPK1與3種蕓薹屬植物的CDPK處于同一分支，支持率達(dá)100%，它們再與山崳菜(Eutremasalsugineum， XP_024016164)聚于一組，支持率較小，僅為53%；3種棉屬植物聚于同一分支，支持率達(dá)100%，它們與大戟科(Euphorbiaceae)的麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas， XP_020535061)和蓖麻(Ricinuscommunis， NP_001310655)聚于一組；十字花科的亞麻薺(Camelinasativa， XP_010467489)和薺(Capsellarubella， XP_006297360)聚于一組，支持率為89%；而山柑科(Capparaceae)的醉蝶花(Tarenayahassleriana， XP_010548179)與豆科(Leguminosae)的大豆(Glycinemax， XP_003519696)單獨(dú)成組(圖5)。

劃線部分為S_TKc結(jié)構(gòu)域；高亮部分為EF手性結(jié)構(gòu)域。 The underlined residues indicated the S_TKc domain; The highlighted residues showed EF-hand domains.圖3 BoCDPK1基因及其編碼蛋白序列Fig.3 Gene sequence of BoCDPK1 and its deduced protein sequence

圖4 BoCDPK1部分序列及其同源蛋白的比較Fig.4 Comparisons of partial BoCDPK1 and its homologous sequences

2.3 BoCDPK1的表達(dá)分析

為明確BoCDPK1在霜霉菌和核盤菌侵染下的表達(dá)特點(diǎn)，以cDNA為模板，利用qRT-PCR進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，BoCDPK1的表達(dá)受霜霉菌和核盤菌的誘導(dǎo)，相對表達(dá)量呈先上升后下降的規(guī)律。在霜霉菌侵染下，6～12 h的表達(dá)量未見顯著變化，24、36、72、96 h的表達(dá)量為對照的1.79、2.24、3.4和1.64倍(圖6-A)。在核盤菌侵染下，6～72 h的表達(dá)量顯著上升，其中24 h和36 h的表達(dá)量分別為對照的2.4和3.5倍(圖6-B)。

3 討論

鈣調(diào)蛋白(calmodulin)、鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(calcineurin B-like protein)、鈣調(diào)素類似蛋白(calmodulin like protein)和CDPK為常見的Ca2+傳感蛋白，它們根據(jù)Ca2+濃度調(diào)控下游產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，其中的CDPK通過磷酸化作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[17]。CDPK參與植物生長發(fā)育，牽牛(Pharbitisnil)PnCDPK1基因的表達(dá)受光照誘導(dǎo)，在種子萌發(fā)、幼苗生長、花形成和果實(shí)成熟過程中起著重要作用[18]；馬鈴薯(Solanumtuberosum)StCDPK1和StCDPK3在匍匐莖中表達(dá)，與塊莖早期發(fā)育和膨大相關(guān)[19]；煙草NtCDPK1在根尖、莖尖和花蕾中表達(dá)，與細(xì)胞分裂、分化和凋亡相關(guān)[20]；擬南芥CDPK28在胚根、根、子葉、蓮座葉、花和果莢中表達(dá)，表明它參與擬南芥的生長發(fā)育過程[21]。本研究從青花菜中克隆到1個(gè)CDPK基因，在明確序列特征的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了表達(dá)和系統(tǒng)發(fā)育分析。多序列比對發(fā)現(xiàn)，BoCDPK1與其他物種的N端變異較大，為高度可變區(qū)域，但它們的S_TKc結(jié)構(gòu)域和EF手性結(jié)構(gòu)域高度保守，與前人的研究結(jié)果吻合[22]。EF手性結(jié)構(gòu)域?yàn)镃DPK的調(diào)控域，可與Ca2+高度親和結(jié)合，序列突變將影響親和性[23]。

圖5 BoCDPK1及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of BoCDPK1 and its homologous sequences

A—霜霉菌；B—核盤菌。不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。 A-Hyaloperonospora parasitica; B-Sclerotinia sclerotiorum. The bars with different letters showed the significant difference (P<0.05).圖6 青花菜BoCDPK1基因在病原菌脅迫下的表達(dá)Fig.6 Expression of broccoli BoCDPK1 gene challenged by pathogens

CDPK還參與逆境響應(yīng)，與多種非生物脅迫和生物脅迫有關(guān)。擬南芥CDPK28的表達(dá)受NaCl和甘露醇誘導(dǎo)，它過量表達(dá)會(huì)積累較多的脯氨酸，耐鹽能力顯著提高[21]。Urao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫與鹽脅迫均能誘導(dǎo)擬南芥AtCDPK1和AtCDPK2基因的表達(dá)；蠶豆CDPK基因VfCPK主要在葉片下表皮表達(dá)，在干旱脅迫下，VfCPK1的表達(dá)量顯著增加[25]；水稻(Oryzasativa)OsCDPK7的表達(dá)受低溫和鹽脅迫誘導(dǎo)，它的過量表達(dá)能顯著提高水稻的耐寒、耐鹽和耐旱能力[26]；崔喜艷等[27]的研究表明，羊草(Leymuschinensis)LcCDPK基因的表達(dá)受干旱及鹽堿脅迫的誘導(dǎo)，推測LcCDPK參與羊草抵御逆境脅迫的響應(yīng)。CDPK參與生物脅迫，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)CDPK3的表達(dá)受苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)誘導(dǎo)，表達(dá)量在接種1 h達(dá)到最大值[28]。本研究利用qRT-PCR檢測青花菜BoCDPK1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受霜霉菌和核盤菌的誘導(dǎo)，但在表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量上存在著一定的差異，說明BoCDPK1在霜霉菌和核盤菌脅迫下具有不同的響應(yīng)模式。

近年來，有關(guān)CDPK與病原菌互作相關(guān)的研究不多，與霜霉菌和核盤菌相關(guān)的研究未見報(bào)道。本研究在克隆BoCDPK1基因的基礎(chǔ)上，初步明確了它的序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其在霜霉菌和核盤菌侵染下的表達(dá)模式，為后續(xù)開展基因功能鑒定和抗病分子育種奠定了基礎(chǔ)。下一步將利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過BoCDPK1的抑制或過量表達(dá)研究其在青花菜抗病反應(yīng)中的生物學(xué)功能。